陸好悅，劉聰聰，肇 毅

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺外科，江蘇 南京 210029

乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，導(dǎo)致全世界每年約50 萬(wàn)女性死亡［1］。根據(jù)不同乳腺癌之間基因表達(dá)的差異，其至少可以分為4 種不同的分子亞型［2］。三陰性乳腺癌（triple negative breast can?cer，TNBC）是指雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）及人表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growthfactor receptor 2，HER?2）均為陰性的一類乳腺癌，占乳腺癌相關(guān)死亡人數(shù)的25%［3］。即使接受了規(guī)范的手術(shù)及放化療，TNBC 患者在術(shù)后2～3 年內(nèi)仍處于高復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)期［4］，其預(yù)后明顯差于其他乳腺癌亞型。由于TNBC 缺乏特異性的分子靶點(diǎn)，不能從針對(duì)ER、PR的內(nèi)分泌治療及針對(duì)HER?2 的分子靶向治療中獲益，因此，尋找新的治療藥物及治療方法來(lái)有效控制TNBC 患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是目前乳腺癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)［5］。散沫花（Lawsonia inermis L.）又稱指甲花［6］，中藥典籍中最早記載于西晉嵇含所著《南方草木狀》，其具有抗腫瘤、抗感染、抗寄生蟲(chóng)等藥理功效。散沫花中活性成分散沫花素（lawsone），又稱指甲花醌，有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，對(duì)包括肺癌、肝癌、腸癌、黑色素瘤及白血病等［7-12］在內(nèi)的多種腫瘤均有抑制作用。本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)散沫花素對(duì)TNBC細(xì)胞的作用，探討散沫花素治療TNBC的潛力。

1 材料和方法

1.1 材料

散沫花素（2?羥基?1，4?萘醌，分子式：C10H6O3）粉劑（上海Topscience 生物科技有限公司）；人乳腺癌細(xì)胞MDA?MB?231（ATCC 公司，美國(guó)）；人乳腺癌細(xì)胞SUM1315由Stephen Ethier教授（美國(guó)密歇根大學(xué)）贈(zèng)予。DMEM 培養(yǎng)基、PBS 緩沖液、胎牛血清、0.25%胰酶和青鏈霉素（Gibco 公司，美國(guó)）；CCK?8試劑盒（Dojindo 公司，日本）；Transwell 生物膜基質(zhì)凝膠包被的侵襲小室（Costar 公司，美國(guó)）；結(jié)晶紫、細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

Thermo 3111 CO2培養(yǎng)箱、MUTiskan GO 酶標(biāo)儀（Thermo Fisher 公司，美國(guó)）；Axiovert 40 CFL 熒光倒置顯微鏡（Zeiss 公司，德國(guó)）；BD FACSCalibur 流式細(xì)胞儀（BD Bioscience 公司，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)MDA?MB?231 和SUM1315 細(xì)胞。功能實(shí)驗(yàn)分組：①散沫花素處理組：MDA?MB?231 和SUM1315 細(xì)胞分別用含有200 μmol/L、150 μmol/L散沫花素的DMEM 培養(yǎng)基預(yù)處理24 h 后收集細(xì)胞培養(yǎng)；②對(duì)照組：含0.1%DMSO的DMEM培養(yǎng)基預(yù)處理24 h后收集細(xì)胞。

1.2.2 抑制增殖活性檢測(cè)（CCK?8法）

在96 孔板中接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA?MB?231和SUM1315細(xì)胞，每孔接種約2 000個(gè)，待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度散沫花素DMEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），以含0.1% DMSO 的DMEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）為空白對(duì)照。在處理72 h后，吸除舊培養(yǎng)基，加入10 μL 的CCK?8 及90 μL 無(wú)血清培養(yǎng)基，放入CO2培養(yǎng)箱靜置2 h后，用酶標(biāo)儀讀取450 nm吸光度。按照下列公式計(jì)算細(xì)胞活力：

A（加藥）：具有細(xì)胞、CCK?8 溶液和藥物溶液的孔的吸光度；A（空白）：具有培養(yǎng)基和CCK?8 溶液而沒(méi)有細(xì)胞的孔的吸光度；A（0加藥）：具有細(xì)胞、CCK?8溶液而沒(méi)有藥物溶液的孔的吸光度。用Graphpad Prism 8軟件以提取物濃度的對(duì)數(shù)值log（X）為橫坐標(biāo)，提取物的吸光度與空白對(duì)照吸光度的百分比值為縱坐標(biāo)，做非線性回歸分析，獲得抑制細(xì)胞增殖的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.2.3 細(xì)胞遷移活性檢測(cè)（劃痕實(shí)驗(yàn)）

收集預(yù)處理后的兩組細(xì)胞，以每孔5×105個(gè)細(xì)胞接種于6 孔板，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后用槍頭（200 μL）劃痕，用PBS 緩沖液洗去漂浮細(xì)胞，加入DMEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），分別于劃痕后的0、24 h后在顯微鏡下拍照，用Image J軟件分析處理前后劃痕面積變化，計(jì)算抑制遷移率。

1.2.4 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

收集預(yù)處理后的兩組細(xì)胞，用不含胎牛血清的培養(yǎng)基制備成含4×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液加入Tran?swell 生物膜基質(zhì)凝膠包被的侵襲小室（置于24 孔板中），Transwell 小室的下層加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，用棉簽擦去孔內(nèi)細(xì)胞，75%乙醇固定0.5 h后用結(jié)晶紫染色1 h，洗去多余染液，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照，并計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)，取5 個(gè)視野的平均數(shù)表示腫瘤細(xì)胞的體外侵襲數(shù)。

1.2.5 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

收集預(yù)處理后的兩組細(xì)胞，以500個(gè)/孔均勻接種至6 孔板上，培育14 d 后用70%乙醇固定3 min，1%結(jié)晶紫染色15 min，PBS洗滌2次并拍照。

1.2.6 EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)癌細(xì)胞DNA合成能力

暫不考慮總重，為了平衡跨中的活載，同前，當(dāng)預(yù)應(yīng)力度分別取為1和0.5時(shí)得到的剪力滯系數(shù)沿著跨徑方向的變化曲線如圖10所示。

收集預(yù)處理后的兩組細(xì)胞，以2 000 個(gè)/孔均勻接種至96孔板中。按EdU 試劑盒配制染色液和進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，結(jié)束后置于顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化

收集預(yù)處理后的兩組細(xì)胞，以每孔5×105個(gè)細(xì)胞接種至6 孔板，以不含EDTA 的胰蛋白酶使細(xì)胞脫壁，收集細(xì)胞，按細(xì)胞周期試劑盒中說(shuō)明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS22.0 和Graphpad5.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。所有定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK 法。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 散沫花素對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制

將散沫花素粉劑用DMSO 溶解至10 mmol/L 配置為母液，再用DMEM 培養(yǎng)基稀釋至不同濃度，測(cè)試其對(duì)MDA?MB?231和SUM1315乳腺癌細(xì)胞的增殖抑制活性（圖1）。進(jìn)一步分析散沫花素在不同濃度時(shí)對(duì)MDA?MB?231和SUM1315 細(xì)胞增殖的抑制作用，計(jì)算得出其作用72 h的IC50分別為249.87 μmol/L和158.34 μmol/L。

圖1 不同濃度散沫花素培養(yǎng)72 h后乳腺癌細(xì)胞增殖活性Figure 1 Proliferative activity of breast cancer cells cul?tured with different concentrations of lawsone

2.2 散沫花素對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移的影響

與對(duì)照組相比，散沫花素處理后MDA?MB?231和SUM1315 細(xì)胞遷移的平均抑制率分別達(dá)67.85%和56.54%（P<0.000 1，圖2）。

圖2 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞遷移活性（×40）Figure 2 Results of wound?healing assay（×40）

2.3 散沫花素對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲的影響

與對(duì)照組相比，散沫花素處理組的細(xì)胞侵襲能力受到明顯抑制，散沫花素處理后MDA?MB?231 和SUM1315 細(xì)胞穿過(guò)膜孔的細(xì)胞數(shù)量分別為對(duì)照組的28.52%和18.06%（P<0.05，圖3）。

2.4 散沫花素對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響

平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組比較，散沫花素處理組的細(xì)胞克隆數(shù)明顯減少（P<0.001，圖4A、B）。EdU 實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，散沫花素處理組細(xì)胞的DNA 合成能力受到顯著抑制［（87±13）vs.（42±9），P<0.001，圖4C；（103±24）vs.（33±12），P<0.001，圖4D］。

圖4 散沫花素對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響Figure 4 Effect of lawsone on proliferation of triple negative breast cancer cells

2.5 散沫花素對(duì)乳腺癌細(xì)胞周期的影響

通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)散沫花素對(duì)MDA?MB?231和SUM1315細(xì)胞周期的影響。由結(jié)果可知，散沫花素處理組與空白對(duì)照組相比，MDA?MB?231 的G0/G1 期細(xì)胞的數(shù)量平均由48.78%增加至55.7%，S 期細(xì)胞數(shù)由44.72%減少至42.57%，G2 期細(xì)胞數(shù)量由6.5%減少至1.73%；SUM1315 的G0/G1 期細(xì)胞的數(shù)量平均由48.78%增加至55.7%，S 期細(xì)胞數(shù)由44.72%減少至42.57%，G2 期細(xì)胞數(shù)量由6.5%減少至1.73%（圖5）。

圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果Figure 5 Results of cell cycle analysis

3 討論

目前，乳腺癌的全身治療手段主要包括化療、內(nèi)分泌治療和抗HER?2 靶向治療。由于內(nèi)分泌治療和抗HER?2 靶向治療對(duì)TNBC 無(wú)效，化療是目前TNBC 唯一有效的全身治療手段［2］。雖然TNBC 相對(duì)于非TNBC 對(duì)化療的初始反應(yīng)更加敏感，但較易形成耐藥［13］。因此，研究人員一直在不斷探索針對(duì)三陰性乳腺癌的有效治療方法。以靶向程序性死亡受體1（PD?1）或其配體（PD?L1）為代表的免疫治療在多種晚期惡性腫瘤中都顯示出了良好的治療效果［14］。然而，針對(duì)TNBC 的臨床試驗(yàn)結(jié)果表明抗PD?L1/PD?L1 單藥治療TNBC 的客觀反應(yīng)率只有10%～20%［15］。另外，靶向PARP、mTOR、Src 等靶點(diǎn)的藥物也被用于TNBC治療的體內(nèi)外研究。其中單藥PARP抑制劑在攜帶BRCA1突變的TNBC患者治療上取得一定效果，但尚未獲得能提高TNBC 患者預(yù)后的臨床數(shù)據(jù)。靶向mTOR 的抑制劑在PTEN基因缺陷的TNBC 細(xì)胞中顯示出了更高的抑制作用［16］，然而現(xiàn)有的臨床實(shí)驗(yàn)表明mTOR 抑制劑聯(lián)合化療并沒(méi)有改善TNBC患者的病理緩解率［17］。本課題組既往開(kāi)展了Src 抑制劑PP2 用于TNBC 治療的臨床前研究，發(fā)現(xiàn)波形蛋白高表達(dá)的TNBC 細(xì)胞系對(duì)Src抑制劑更加敏感［18］，提示TNBC內(nèi)在的異質(zhì)性可能會(huì)影響藥物的預(yù)期治療效果?？傮w來(lái)說(shuō)，目前多數(shù)單藥治療TNBC 的研究結(jié)果并不理想，對(duì)患者預(yù)后生存無(wú)明顯改善。

散沫花素是中草藥散沫花中主要的活性成分之一，有抗氧化、抗腫瘤、抗真菌和細(xì)菌等活性。散沫花素能通過(guò)多種機(jī)制來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用，在體外實(shí)驗(yàn)中，散沫花素可通過(guò)抑制酪氨酸酶活性及降低相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（MITF）表達(dá)來(lái)減少黑素瘤細(xì)胞中黑色素的產(chǎn)生［12］，還可通過(guò)降低NF?κB活性來(lái)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞周期［8］，并能在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中明顯抑制皮膚癌的發(fā)生［19］。此外，Lee 等［11］研究發(fā)現(xiàn)散沫花素的衍生物能靶向作用于多藥耐藥的急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞中的Wnt/β?catenin 信號(hào)通路來(lái)抑制白血病細(xì)胞。此前，尚無(wú)研究涉及散沫花素在TNBC治療中的作用。

本研究首先通過(guò)CCK?8、EDU 和平板克隆實(shí)驗(yàn)明確了散沫花素對(duì)TNBC 的非選擇性抑制作用，能同時(shí)抑制MDA?MB?231 和SUM1315 細(xì)胞的增殖活性，且兩者IC50處相同數(shù)量級(jí)，均＞150 μmol/L。在Baiju 等［20］的研究中，將散沫花素合成雜環(huán)稠合醌類化合物，處理人結(jié)腸癌、人前列腺癌、人早幼粒細(xì)胞白血病、人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和人肺癌細(xì)胞，證實(shí)其對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，且IC50值<2 μmol/L，遠(yuǎn)小于散沫花素的IC50值，提示該化合物可能具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒性，但這一結(jié)論尚未得到循證醫(yī)學(xué)證實(shí)。Oliveira等［21］的研究將散沫花素與以其為基礎(chǔ)的6種釕（Ⅱ）配合物處理前列腺癌細(xì)胞及乳腺癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)6種釕（Ⅱ）配合物的IC50值均小于散沫花素的IC50值；該研究中散沫花素的IC50值均＞100 μmol/L，與本研究的結(jié)果相仿。

通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討散沫花素是否具有抑制TNBC轉(zhuǎn)移的能力，結(jié)果表明，散沫花素能有效抑制TNBC 的遷移和侵襲。De Grandis等［22］的研究中用以散沫花素為基礎(chǔ)的化合物處理前列腺癌細(xì)胞，與對(duì)照組相比，暴露于化合物濃度為0.5 μmol/L 的細(xì)胞48 h 后，80%的細(xì)胞遷移受到抑制。Rom?o等［23］的研究中用與多胺結(jié)合的散沫花素處理多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞后，與對(duì)照組相比該化合物能顯著降低腫瘤侵襲力。由此可見(jiàn)，無(wú)論是散沫花素單體還是基于散沫花素的化合物都有明顯抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用。

本研究細(xì)胞周期分析還發(fā)現(xiàn)散沫花素能有效阻斷TNBC 細(xì)胞由G1 期進(jìn)入S 期。Wang 等［8］用散沫花素處理結(jié)腸癌DLD?1細(xì)胞，結(jié)果顯示處于G2/M期的細(xì)胞數(shù)量顯著增加，向下一個(gè)S 期過(guò)渡的時(shí)間有所延遲。提示散沫花素雖然對(duì)各類腫瘤細(xì)胞都具有抑制作用，但在不同腫瘤細(xì)胞間發(fā)揮作用的原理不同，可以進(jìn)一步設(shè)計(jì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究散沫花素在TNBC細(xì)胞中的作用靶點(diǎn)。

綜上研究表明，散沫花素能有效抑制包括TN?BC細(xì)胞在內(nèi)的惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移，其抑制TNBC 細(xì)胞的分子機(jī)制以及對(duì)活體TNBC 乳腺癌的作用有待進(jìn)一步探索。