【摘要】目的：探討芍藥苷對動脈粥樣硬化小鼠模型主動脈斑塊、血脂、血清甲基化及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶水平的影響。方法：30 只 8 周齡雄性 ApoE-/-小鼠高脂喂養(yǎng)9周后，隨機分為模型組、立普妥組（陽性對照組）和芍藥苷組。繼續(xù)喂養(yǎng)并藥物干預(yù)9周后，分別檢測三組小鼠血脂、血清 DNA 甲基化水平及 DNMT1水平;行HE染色，采用 IPP 圖像分析軟件測量小鼠主動脈斑塊面積。結(jié)果：芍藥苷可減小動脈粥樣硬化小鼠主動脈斑塊性對面積，降低血清TG、LDL-C水平，并降低血清DNA甲基化及DNMTI水平。結(jié)論：芍藥苷可通過降低血脂、血清甲基化及DNMT1 水平從而抑制動脈粥樣硬化斑塊形成，干預(yù)動脈粥樣硬化進展。

【關(guān)鍵詞】芍藥苷;動脈粥樣硬化;血脂;甲基化;DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶

中圖分類號：R285.5

前言

心血管疾病是引起人類死亡的首要原因;據(jù)統(tǒng)計，在我國因病死亡人數(shù)中約2/5死于心血管疾病。動脈粥樣硬化是包括冠狀動脈粥樣性心臟病在內(nèi)的諸多心血管疾病的病理基礎(chǔ)，因此有效緩解動脈粥樣硬化是預(yù)防及治療心血管疾病的基礎(chǔ)。在動脈粥樣硬化的發(fā)生過程中，脂代謝紊亂發(fā)揮著重要的作用;而DNA甲基化與脂代謝紊亂具有密切關(guān)系。芍藥苷是中藥赤芍的主要苷類化合物之一;研究表明，芍藥苷具有顯著的抗氧化能力及降脂和抑制主動脈斑塊形成的作用。本實驗以高脂飲食喂養(yǎng)的ApoE -/- 小鼠為觀察對象，探討芍藥苷對動脈粥樣硬化模型小鼠的主動脈斑塊、血脂及DNA甲基化的影響。

1.材料與方法

1.1 動物與飼料

30只6-8周齡ApoE-/-小鼠（雄性，品系C57BL/6J），體重約18-20g，購自北京維通利華實驗技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2012-0001。高脂飼料：21%脂肪（wt/wt）、0.15%膽固醇（wt/wt），購于北京科奧協(xié)力飼料有限公司，許可證號：SCXK（京）2009-0012。

1.2 藥物

芍藥苷購自澤朗醫(yī)藥公司生產(chǎn)（批號：20140315）;阿托伐他汀鈣（商品名立普妥）購自輝瑞制藥有限公司（批號：H20051408）。

1.3 分組及模型的制備

所有小鼠飼養(yǎng)于SPF級動物室，正常飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)3日后，ApoE-/-小鼠更換為高脂飼料，自由采食攝水。9周后，隨機分為模型組、立普妥組，芍藥苷組（n=10）。據(jù)成人臨床推薦日用量，按體重系數(shù)比折算小鼠給藥量：立普妥3mg/kg ，芍藥苷0.12g/kg（折算系數(shù)為9.01，公式：成人日用量/60kg×9.01=小鼠日用量/kg）。藥物溶解于蒸餾水中，每日灌胃給藥1次，模型組給予等量蒸餾水灌胃，繼續(xù)高脂喂養(yǎng)9周。

1.4 血脂的檢測

嚴格按照試劑盒說明書，檢測血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平。

1.5 血清DNA甲基化及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶水平的檢測

嚴格按照試劑盒說明書，采用 ELISA 法檢測DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMT）水平。采用高效液相色譜法（HPLC）檢測血清 DNA 甲基化水平。

1.6 主動脈斑塊面積的測定

無菌條件下取各組小鼠心臟，經(jīng)脫水、包埋、切片，按照Suzuki等建立的方法，取小鼠主動脈瓣起始橫斷面，每隔100μm取4張切片，切片厚5μm。行HE 染色，后使用IPP軟件測量各只小鼠斑塊面積，后計算斑塊占占管腔百分比。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（ ±s）表示。使用GraphPad Prism6.01軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。兩組間采用t檢驗;多組間比較采用單因素方差分析，p﹤0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 動脈粥樣硬化小鼠模型的建立及芍藥苷對主動脈斑塊的影響

藥物干預(yù)9周后，模型組小鼠主動脈根部可見明顯動脈粥樣硬化斑塊，伴大量膽固醇結(jié)晶伴泡沫細胞聚集（圖1A）。立普妥組（圖1B）及芍藥苷組（圖1C）斑塊相對面積較模型組顯著減小，立普妥組斑塊相對面積較芍藥苷組顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

2.2 芍藥苷對動脈粥樣硬化模型小鼠血脂的影響

藥物干預(yù)9周后，與模型組相比，立普妥及芍藥苷可顯著降低血清TG與LDL-C水平;但立普妥降低甘油三酯水平較芍藥苷更為顯著;芍藥苷可顯著升高血清HDL-C水平。（表2）

2.3 芍藥苷降低動脈粥樣硬化模型小鼠血清DNA甲基化水平及DNMT1水平

藥物干預(yù) 9周后，立普妥組及芍藥苷組小鼠血清DNA甲基化水平較模型組明顯降低;立普妥組與芍藥苷組之間無明顯差異。立普妥組與芍藥苷組小鼠血清DNMT水平較模型組亦明顯降低（P<0.01），兩組間無明顯差異。（表3）

3.討論

芍藥苷為常用傳統(tǒng)中藥芍藥的主要有效成分，是一種單萜類糖苷化合物，具有廣泛的藥理作用。研究表明，芍藥苷具有抗氧化，抗炎，抗凝、抗高血糖、降血脂及抗動脈硬化等多種生物學(xué)效應(yīng)，且毒副作用較小。動脈粥樣硬化是以脂代謝紊亂為主要病因的一類病理性血管疾病;自1999年以來，動脈粥樣硬化被認為是一種慢性炎癥病變，而脂代謝紊亂則被認為是血管內(nèi)膜炎癥反應(yīng)的發(fā)生關(guān)鍵因素，在As過程中發(fā)揮著重要作用。

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的一種重要方式，在維持生物體多種正常功能及疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。研究證實，在脂代謝紊亂過程中與脂代謝密切相關(guān)的多種基因存在著DNA甲基化現(xiàn)象。另外，DNA 甲基化可通過調(diào)控與AS有關(guān)的炎癥免疫細胞和炎癥因子來影響 AS 的發(fā)生與發(fā)展。基因組甲基化水平與冠心病及冠心病風(fēng)險呈正相關(guān)。

本研究以高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠制備動脈粥樣硬化模型，經(jīng)藥物干預(yù)治療后檢測其血脂、主動脈斑塊相對面積及血清DNA甲基化及DNMT1水平以探討芍藥苷對動脈粥樣硬化的作用。結(jié)果可見：芍藥苷可有效降低動脈粥樣硬化小鼠血清TG及LDL-C水平，并可增加HDL-C水平，此種作用可能是芍藥苷發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用的基礎(chǔ)。而芍藥苷降低基因組DNA甲基化水平及DNMT1水平可能是其發(fā)揮降低血脂的途徑之一;但其具體機制仍待進一步研究。

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