馬鑫雨，夏秋，曾秀麗，郭雯婕，李欣卓，史新竹

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)專業(yè)學(xué)生，遼寧 沈陽110034；2.公共衛(wèi)生學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室）

碘在妊娠過程中對(duì)胎兒發(fā)育起到至關(guān)重要的 作用，碘過量和碘缺乏都會(huì)對(duì)胎兒造成不良影響。在妊娠期間胎兒通過胎盤從母體攝取碘，以合成甲狀腺激素，其中鈉碘轉(zhuǎn)運(yùn)體（sodium iodide sym?porter，NIS）和pendrin轉(zhuǎn)運(yùn)體對(duì)該過程起著重要作用［1］。NIS是一種可在甲狀腺、乳腺、胎盤等多個(gè)組織中表達(dá)的以鈉鉀離子濃度梯度為動(dòng)力的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)體，可在促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）的作用下介導(dǎo)碘的轉(zhuǎn)運(yùn)。pendrin是一種表達(dá)于胎盤的碘離子和氯離子的被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)體，在孕期可攝取母體碘以供胚胎生長發(fā)育［2］。胎盤分泌的絨毛膜促性腺激素（chorionic gonado?tropin，HCG）是維持妊娠狀態(tài)的主要胎盤激素，具有調(diào)節(jié)胎盤的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等功能。有文獻(xiàn)報(bào)道，HCG受體與甲狀腺中NIS主要調(diào)節(jié)激素TSH受體具有高度的結(jié)構(gòu)同源性，均可調(diào)節(jié)碘的轉(zhuǎn)運(yùn)作用［3］。因此，本研究探討在高碘狀態(tài)下人早孕胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞株（HPT－8）細(xì)胞中HCG對(duì)NIS和pendrin表達(dá)的影響。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞、儀器及試劑 HPT－8（第四軍醫(yī)大學(xué)）。CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），倒置顯微鏡（日本Olympus公司），低溫高速離心機(jī)（美國Beckman公司），酶標(biāo)儀（上海天呈科技有限公司），DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（Hyclone），HCG（美國Sigma公司），碘酸鉀（天津市光復(fù)試劑有限公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real－Time PCR試劑盒（大連寶生物工程有限公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HPT－8細(xì)胞，置于37℃，5%CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中待細(xì)胞鋪滿T25瓶底80%左右用0.25%胰蛋白酶消化，傳入6孔板中繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中生長，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 分組、加入試劑 用DMEM培養(yǎng)基配制碘酸鉀母液，然后用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基將母液稀釋成5 000 μg／L和500 μg／L兩個(gè)劑量的高碘培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)設(shè)置500 μg／L、5 000 μg／L 2個(gè)高碘組和對(duì)照組；500 μg／L高碘＋0.5 U／ml HCG組、500 μg／L高碘＋5 U／ml HCG組、5 000 μg／L高碘＋0.5 U／ml HCG組、5 000 μg／L高碘＋5 U／ml HCG組。高碘組僅加入相應(yīng)劑量的高碘培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h；高碘＋HCG組，加入相應(yīng)劑量的高碘培養(yǎng)液24 h后再加入相應(yīng)劑量HCG培養(yǎng)24 h；對(duì)照組僅加入相應(yīng)體積的含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測NIS mRNA和pendrin mRNA的表達(dá)量

1.4.1 總RNA的提取 使用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，加入Trizol混勻鋪平，靜置5 min消化，吹打至無細(xì)胞團(tuán)后將其移入1.5 ml EP管，顛倒混勻，37℃靜置。每管加入0.15 ml三氯甲烷，劇烈振搖，37℃靜置5 min，12 000 r／min 4℃離心15 min。將上清液移至新EP管，加入等體積的異丙醇，顛倒冰上靜置5 min，12 000 r／min 4℃離心10 min，留沉淀。加1 ml預(yù)冷的75%乙醇，輕輕顛倒數(shù)次，7 500 r／min 4℃離心5 min。留取管底的白色沉淀，在室溫中干燥約10 min。用RNA濃度測定儀來測定總RNA的含量。

1.4.2 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，37℃15 min，85℃5 s，冰浴5 min。

1.4.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增 實(shí)驗(yàn)所需引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)并合成，以稀釋好的cDNA為模版進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增。引物序列及擴(kuò)增片段見表1。

表1 PCT擴(kuò)增引物序列

反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，63℃（NIS）、61℃（pendrin）退火20 s，72℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。每個(gè)樣本做平行樣，重復(fù)2次。以GAPDH為內(nèi)參，采用相對(duì)定量2－ΔΔCt法，分別計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間計(jì)量資料比較采用單因素方差分析和LSD－t檢驗(yàn)，交互作用采用析因設(shè)計(jì)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同高碘水平對(duì)NIS mRNA和pendrin mRNA表達(dá)的影響 5 000 μg／L高碘組和500 μg／L高碘組的NIS mRNA和pendrin mRNA表達(dá)量均高于對(duì)照組（P＜0.01），5 000 μg／L高碘組的NIS mRNA和pendrin mRNA表達(dá)量略高于500 μg／L高碘組，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2 不同高碘水平下NIS mRNA和pendrin mRNA的表達(dá)量（±s）

表2 不同高碘水平下NIS mRNA和pendrin mRNA的表達(dá)量（±s）

注：與對(duì)照組比較，1）P＜0.05

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2.2 高碘狀態(tài)下HCG對(duì)NIS mRNA和pendrin mRNA表達(dá)量的影響 5 000 μg／L高碘＋0.5 U／ml與5 000 μg／L高碘＋5 U／ml HCG組NIS mRNA和pendrin mRNA表達(dá)量均低于5 000 μg／L高碘組（P＜0.05），5 000 μg／L高碘＋0.5 U／ml HCG與5 000 μg／L高碘＋5 U／ml HCG組的NIS mRNA和pendrin mRNA表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3；500 μg／L高碘狀態(tài)下3組NIS mRNA和pendrin mRNA表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表4。

表3 5 000 μg／L高碘狀態(tài)下HCG對(duì)NIS mRNA和pendrin mRNA表達(dá)量的影響（±s）

表3 5 000 μg／L高碘狀態(tài)下HCG對(duì)NIS mRNA和pendrin mRNA表達(dá)量的影響（±s）

注：與5 000 μg／L高碘組比較，1）P＜0.05

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表4 500 μg／L高碘狀態(tài)下HCG對(duì)NIS mRNA和pendrin mRNA表達(dá)量的影響（±s）

表4 500 μg／L高碘狀態(tài)下HCG對(duì)NIS mRNA和pendrin mRNA表達(dá)量的影響（±s）

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2.3 高碘與HCG對(duì)NIS mRNA和pendrin mRNA表達(dá)量的交互作用 高碘和HCG對(duì)NIS mRNA的表達(dá)量不產(chǎn)生交互作用（R2＝0.836，F(xiàn)＝0.087，P＝0.776），不同濃度高碘作用下NIS mRNA表達(dá)量存在差異（F＝6.203，P＝0.037）；高碘和HCG對(duì)pendrin mRNA的表達(dá)量不產(chǎn)生交互作用（R2＝0.325，F(xiàn)＝2.970，P＝0.123），見表5和表6。

表5 高碘與HCG對(duì)NIS mRNA表達(dá)量的交互作用

表6 高碘與HCG對(duì)pendrin mRNA表達(dá)量的交互作用

3 討論

目前，關(guān)于妊娠期攝碘量的研究多集中在碘缺乏對(duì)胎兒智力的影響，碘攝入過量是否影響胎兒腦發(fā)育研究較少。孕婦碘過量會(huì)使孕婦甲狀腺功能異常，包括甲狀腺機(jī)能減退癥、亞臨床甲減、甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)癥、單純性低甲狀腺素血癥等［4］。有研究表明孕婦在攝入過量碘時(shí)，甲狀腺疾病患病率較高，其中以亞臨床甲狀腺功能減退為主［5］，說明多種甲狀腺疾病可能是由高碘引起的。

HCG是一種能夠保證整個(gè)妊娠期處于相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，由胎盤產(chǎn)生的促性腺激素，具有調(diào)節(jié)胎盤的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等功能［6－8］。HCG由α和β兩個(gè)亞單位組成，它們的α亞單位氨基酸序列相同，而β亞單位羥基端有獨(dú)特的C終點(diǎn)肽結(jié)構(gòu)，HCG在孕期維持妊娠激素黃體酮，保證胎兒正常發(fā)育的作用主要決定于β單位，這一功能由HCG受體調(diào)節(jié)。NIS是位于胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞膜頂端以Na＋－K＋－ATP酶產(chǎn)生的離子梯度為動(dòng)力的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)體，表達(dá)于各種聚碘細(xì)胞，包括乳腺、甲狀腺等［9］。pendrin是I－和Cl－被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的轉(zhuǎn)運(yùn)體，位于絨毛合體滋養(yǎng)層細(xì)胞刷狀緣膜，具有高度疏水性的細(xì)胞膜糖蛋白，在胎盤、乳腺、子宮內(nèi)膜、前列腺、睪丸和肺中均有表達(dá)［6］。在整個(gè)妊娠期間，NIS在胎盤中表達(dá)水平穩(wěn)定，pendrin則在妊娠中后期表達(dá)增加，這兩種物質(zhì)均與母體和胎兒間的碘轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，調(diào)節(jié)著母體與胎兒之間的碘轉(zhuǎn)運(yùn)功能。本研究探討HPT－8細(xì)胞在高碘狀態(tài)下不同濃度的HCG對(duì)NIS mRNA與pendrin mRNA表達(dá)的影響，研究顯示提高碘水平時(shí)NIS mRNA與pendrin mRNA表達(dá)量均明顯增加，但在HCG參與下，提升高碘水平NIS mRNA的表達(dá)量反而明顯降低，pendrin mRNA的表達(dá)量也有所降低，說明高碘狀態(tài)下HCG可降低HPT－8細(xì)胞的攝碘能力，而且碘濃度越高HCG對(duì)NIS mRNA的下調(diào)作用越明顯，pendrin mRNA變化不大。推測在碘過量的情況下，胎盤可通過HCG調(diào)節(jié)碘運(yùn)輸，減少對(duì)碘富集作用和向胎兒的碘運(yùn)輸量，保護(hù)胎兒免受碘過量造成的危害。Arturi等［10］的研究中顯示在絨癌細(xì)胞系JAR中，HCG具有上調(diào)NIS mRNA表達(dá)的作用，在甲狀腺中HCG具有上調(diào)細(xì)胞攝碘能力。本研究結(jié)果HCG的下調(diào)作用與Arturi等［10］的結(jié)果不一致，可能與細(xì)胞系的不同和細(xì)胞所處環(huán)境有關(guān)，本研究是在高碘環(huán)境下觀察細(xì)胞的攝碘能力的變化。胎盤激素作用非常復(fù)雜，可以對(duì)機(jī)體多個(gè)靶器官和靶細(xì)胞產(chǎn)生多種作用；不僅可以進(jìn)入血液循環(huán)后通過內(nèi)分泌的途徑發(fā)揮作用，而且還可以通過組織間液作用于相鄰的細(xì)胞或自身細(xì)胞，在胎盤或者其他子宮內(nèi)組織形成復(fù)雜的旁分泌和自分泌局域網(wǎng)，互相影響、相互作用。本研究還觀察到HCG與高水平碘對(duì)NIS mRNA和pendrin mRNA表達(dá)量不存在交互作用，其原因可能是胎盤細(xì)胞處于高碘環(huán)境時(shí)，提高碘水平NIS mRNA和pendrin mRNA表達(dá)量的升高不明顯，反而HCG的降低作用顯著，因此進(jìn)一步說明高碘環(huán)境下HCG具有降低胎盤細(xì)胞的攝碘能力的作用。

綜上所述，在胎盤細(xì)胞中當(dāng)?shù)膺^量時(shí)HCG降低NIS mRNA的表達(dá)，pendrin mRNA的表達(dá)量有所下降，說明高碘狀態(tài)下HCG可降低胎盤細(xì)胞的攝碘能力，從而減少了胎盤對(duì)碘的攝取，保護(hù)胎兒免受碘過量帶來的危害。