崔思嬌，張大軍，巴琳，汪宇，欒天?

（1.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院化學(xué)教研室，遼寧 沈陽(yáng)110034；2.中國(guó)人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院藥劑科）

膏藥作為中醫(yī)傳統(tǒng)劑型應(yīng)用至今已有千余年的歷史，從《中國(guó)藥典》1977年版［1］首次將膏藥作為一個(gè)單獨(dú)劑型收載，到《中國(guó)藥典》2015年版［2］對(duì)膏藥外觀性狀、貯藏條件和檢查項(xiàng)目等作以具體規(guī)定，膏藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)逐步提升，但依舊缺少反映黑膏藥質(zhì)量的客觀指標(biāo)和檢測(cè)方法，因而現(xiàn)階段質(zhì)量控制仍多憑借經(jīng)驗(yàn)判斷。目前國(guó)內(nèi)對(duì)黑膏藥質(zhì)量的研究鮮見(jiàn)報(bào)道［3－6］，可能是因?yàn)槠涮幏綇?fù)雜，多味中藥成分相互作用，炮制過(guò)程中產(chǎn)生新的物質(zhì)，難以選擇代表性的成分作為控制指標(biāo)；制劑工藝均需高溫油炸，導(dǎo)致其成分多被破壞；黏性大、吸附性強(qiáng)的基質(zhì)加大了分析時(shí)處理樣品的難度。

雙烏扶筋膏是中國(guó)人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院自主研發(fā)生產(chǎn)的黑膏藥制劑，主要由生草烏、生川烏、生南星、川牛膝、續(xù)斷等多味中藥組成。具有軟堅(jiān)散結(jié)、祛瘀消腫、散寒定痛、舒筋活絡(luò)功效，用于骨質(zhì)增生、頸椎病、肩周炎、腰椎病、風(fēng)濕、類(lèi)風(fēng)濕引起的筋骨疼痛等癥，經(jīng)臨床應(yīng)用多年，療效顯著，但其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中尚無(wú)含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。續(xù)斷是雙烏扶筋膏的主藥，其有效成分川續(xù)斷皂苷Ⅵ（圖1），經(jīng)現(xiàn)代藥理學(xué)證實(shí)，其具有保護(hù)骨組織﹑抗炎﹑鎮(zhèn)痛等藥理活性，并且能夠多靶點(diǎn)發(fā)揮藥效［7］。因此，可選擇川續(xù)斷皂苷Ⅵ作為雙烏扶筋膏的質(zhì)量控制指標(biāo)。目前，有關(guān)黑膏藥的制劑中，以HPLC對(duì)其中的藥物進(jìn)行含量測(cè)定的方法鮮有報(bào)道。為提升雙烏扶筋膏的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本研究建立了雙烏扶筋膏中主要成分之一川續(xù)斷皂苷Ⅵ的HPLC含量測(cè)定方法。

圖1 川續(xù)斷皂苷Ⅵ的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent Technologies 1260 InfinityⅡ高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司），AUW220D電子分析天平（日本Shimadzu公司），HH·S電熱恒溫水浴鍋（江蘇紅旗醫(yī)療器械廠），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE－520A（上海亞榮生化儀器廠），SHB－Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）。

1.2 試藥 雙烏扶筋膏樣品為中國(guó)人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院制劑室生產(chǎn)（批號(hào)20191228、20200121、20200310），規(guī)格為10 g／貼。川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì) 照 品（批 號(hào)111685－201707，純 度90.9%）購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；乙腈、甲醇、色譜純?yōu)樘旖蚴兴挠丫?xì)化學(xué)品有限公司；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件［8－10］Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈－0.1%磷酸水溶液（26∶74，V／V），檢測(cè)波長(zhǎng)為212 nm，流速1.0 ml／min，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μl。

2.2 單因素試驗(yàn) 首先將提取時(shí)間固定為3.0 h，取雙烏扶筋膏樣品（批號(hào)20200121）6貼，置－20℃冰箱中冷凍1 h后取出，剝離藥物，搗碎，混勻，稱取本品膏體約50 g，精密稱定，置錐形瓶中，加水500 ml，分別在50﹑60﹑70﹑80及90℃下進(jìn)行水浴提取，放冷，過(guò)濾取濾液。蒸干濾液，殘?jiān)?0 ml甲醇溶解，過(guò)濾取濾液，濃縮，定容至5 ml量瓶中，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液備用，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，其提取溫度與之對(duì)應(yīng)的樣品含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。隨后，將提取溫度固定為80℃，提取時(shí)間依次設(shè)定為1.0、1.5、2.0、2.5及3.0 h，按上述同樣方法測(cè)得提取時(shí)間與對(duì)應(yīng)的樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量與提取溫度

表2 川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量與提取時(shí)間

2.3 溶液的制備 （1）對(duì)照品溶液的制備：精密稱取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品適量，加甲醇制成0.5 mg／ml的對(duì)照品溶液。（2）供試品溶液的制備：取雙烏扶筋膏6貼，置－20℃冰箱中冷凍1 h后取出，剝離藥物，搗碎，混勻，稱取本品膏體約50 g，精密稱定，置錐形瓶中加水500 ml，80℃下水浴提取2.5 h，放冷，過(guò)濾取濾液。蒸干濾液，殘?jiān)?0 ml甲醇溶解，過(guò)濾取濾液，濃縮，定容至5 ml量瓶中，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液備用。（3）陰性對(duì)照品溶液的制備：按處方量并以相同工藝制備不含續(xù)斷的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制得陰性對(duì)照品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 精密吸取2.3項(xiàng)下對(duì)照品、供試品、陰性對(duì)照品溶液各適量，按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。理論塔板數(shù)按川續(xù)斷皂苷Ⅵ峰計(jì)算不低于3 000，分離度大于1.5。色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 雙烏扶筋膏的HPLC圖

2.4.2 線性關(guān)系考察 將2.3項(xiàng)下對(duì)照品溶液稀釋成5個(gè)質(zhì)量濃度的溶液，依次為20、50、100、250、500 μg／ml，按2.1項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積（Y）對(duì)質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得到川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品回歸方程Y＝3.935 4X－1.497 8，r2＝0.999 9。結(jié)果表明川續(xù)斷皂苷Ⅵ在20~500 μg／ml范圍內(nèi)質(zhì)量濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4.3 精密度試驗(yàn) 吸取對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得川續(xù)斷皂苷Ⅵ峰面積RSD為0.37%（n＝6），表明該方法精密度良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取雙烏扶筋膏（批號(hào)20200121）6份，依照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依次進(jìn)樣，結(jié)果顯示川續(xù)斷皂苷Ⅵ的平均濃度為0.228 mg／ml，RSD為1.33%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 吸取供試品溶液（批號(hào)20200121）于0、4、8、12、16、24 h依次進(jìn)樣并計(jì)算含量，結(jié)果顯示川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量測(cè)定的RSD為1.31%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.6 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的雙烏扶筋膏（批號(hào)20200121，含量20.4 μg／g）6份，精密稱定，分別準(zhǔn)確加入川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品適量，按2.3項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示川續(xù)斷皂苷Ⅵ的平均回收率為96.74%，RSD為1.49%（n＝6），結(jié)果表明該方法的回收率良好。見(jiàn)表3。

表3 雙烏扶筋膏中川續(xù)斷皂苷Ⅵ加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.5 樣品含量測(cè)定 取批號(hào)為20191228、20200121、20200310的雙烏扶筋膏樣品各約50 g，精密稱定后，按2.3項(xiàng)下制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 雙烏扶筋膏中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

川續(xù)斷皂苷Ⅵ為糖苷取代的五環(huán)三萜類(lèi)化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示，因其結(jié)構(gòu)中存在大量的醇羥基，故此，其在醇類(lèi)溶劑以及水中溶解度較高，并且隨著溫度的升高其溶解度顯著增加。因此，在提取溶劑的選擇中，本研究選擇甲醇、乙醇、水三種提取溶劑進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，甲醇與水的提取率相對(duì)較高，但以水為提取溶劑制備的供試品溶液所得圖譜中雜質(zhì)峰較少，與其他雜質(zhì)峰分離度較好，且基線平穩(wěn)，因此本研究選用水作為提取溶劑。

在提取方式的考察中，以水為溶劑首先考察了回流提取法，發(fā)現(xiàn)大量基質(zhì)溶于提取液中，以致提取液濃縮后過(guò)于黏稠，無(wú)法通過(guò)微孔濾膜處理檢測(cè)。其次考察了超聲提取法，發(fā)現(xiàn)超聲提取后供試品呈膏體狀聚集，制得的供試品中川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量極低，其原因可能是因?yàn)闃悠分写罅炕|(zhì)經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間超聲軟化聚集，使得藥物有效成分粘附在基質(zhì)中，造成有效成分的損失。最后，本研究選擇在80℃下進(jìn)行水浴提取法，試驗(yàn)結(jié)果表明，制得的供試品溶液澄清，提取率較高且所得供試品溶液圖譜中雜質(zhì)峰較少，因此選擇水浴提取方式進(jìn)行供試品溶液的制備。

在提取溫度與時(shí)間的考察中，在提取溫度上分別進(jìn)行了50、60、70、80及90℃下的提取試驗(yàn)，結(jié)果顯示，提取溫度為80℃時(shí)川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量最高，當(dāng)溫度上升到90℃時(shí)，提取液黏度大大增加，較難過(guò)濾，且含量不再增加，故此將提取溫度確定為80℃。隨后，在提取時(shí)間上分別進(jìn)行了1.0、1.5、2.0、2.5及3.0 h的提取試驗(yàn)，結(jié)果顯示，在80℃水浴提取2.5 h后，所制得的供試品樣品中川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量無(wú)顯著變化，考慮到試驗(yàn)時(shí)間和能源成本，本研究最終將水浴提取溫度確定為80℃，提取時(shí)間確定為2.5 h。

綜上所述，本研究采用HPLC法測(cè)定雙烏扶筋膏中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量，解決了黑膏藥樣品難處理的問(wèn)題，采用水浴提取法防止大量基質(zhì)對(duì)主成分含量測(cè)定的干擾，提高了雙烏扶筋膏的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，使黑膏藥的質(zhì)量控制客觀規(guī)范化，同時(shí)為相關(guān)領(lǐng)域的研究提供了參考。