趙璐，孫茂偉，鄒鵬?

（1.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，遼寧 沈陽(yáng)110034；2.沈陽(yáng)市積水潭醫(yī)院普外科）

乳腺癌是導(dǎo)致女性癌癥患者死亡的第二大因素，僅次于肺癌［1］。近年，其發(fā)病率持續(xù)上升，是威脅女性健康的惡性腫瘤之一［2］。目前，手術(shù)切除是治療乳腺癌的首選方案，隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，結(jié)合化療、內(nèi)分泌治療、放射治療、分子靶向治療等方法能夠提高患者的生存質(zhì)量和生存期［3－4］。但是由于乳腺癌本身在組織水平、治療反應(yīng)、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移位點(diǎn)等方面都存在極高異質(zhì)性，即使相同的臨床病例特征患者，也會(huì)出現(xiàn)不同的治療反應(yīng)和臨床預(yù)后，因此僅從臨床病例特征對(duì)患者進(jìn)行診斷和預(yù)后較為片面，新的診斷標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)勢(shì)在必得，可為乳腺癌診斷、預(yù)后以及治療提供依據(jù)［5］。轉(zhuǎn)錄因子ETF（TEA domain family member 2或TEAD2）屬于TEF家族，其N－末端含有一個(gè)由72個(gè)氨基酸組成的TEA DNA結(jié)構(gòu)域［6］。研究表明該家族成員能夠參與多種信號(hào)通路，在腫瘤形成、轉(zhuǎn)移、代謝、免疫和耐藥過程中起重要作用［7］。趙璐等［8］研究發(fā)現(xiàn)ETF通過MAPK－ERK信號(hào)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞的惡性增殖。Sebastian等［9］在膠原單層培養(yǎng)基上培養(yǎng)C57BL／6N小鼠肝細(xì)胞72 h后，發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞周期相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)，其中包括ETF，能夠增強(qiáng)細(xì)胞的基礎(chǔ)增殖頻率。ETF通過其C端反式激活結(jié)構(gòu)域與YAP／TAZ的N端 相 互 作 用，形 成YAP／TAZTEAD復(fù)合物，構(gòu)成Hippo途徑的核轉(zhuǎn)錄模塊，在乳腺癌細(xì)胞增殖、腫瘤形成等發(fā)揮作用［10］。但鮮見ETF對(duì)乳腺癌細(xì)胞周期影響的報(bào)道。本研究擬探討ETF在乳腺癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)情況，以及ETF對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響，為乳腺癌診斷、治療及預(yù)后評(píng)估提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2018年1月至2020年12月沈陽(yáng)市積水潭醫(yī)院普外科收治的76例乳腺癌患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）所有患者均為女性；（2）術(shù)后經(jīng)病理組織學(xué)確診為原發(fā)性乳腺癌，術(shù)前未進(jìn)行放化療等治療；（3）手術(shù)切除的均有原發(fā)性乳腺癌組織和相應(yīng)癌旁組織；（4）病例記錄完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡大于80歲；（2）伴有其他腫瘤；（3）經(jīng)受過其他治療；（4）臨床資料不完整；（5）不愿參加本研究?；颊吣挲g29~73歲，平均（57.47±7.96）歲。腫瘤及癌旁組織均取自同一患者，留取組織標(biāo)本置于生理鹽水中，去除組織標(biāo)本上的血污后，置于液氮保存待用。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 藥品與試劑 人乳腺癌MDA－MB－231／MCF－7細(xì)胞和人正常乳腺細(xì)胞MCF10A（美國(guó)ATCC公司）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）（Gibco公司）；胰蛋白酶（Sigma公司）；慢病毒包裝試劑盒（合肥知恩生物公司）；細(xì)胞全蛋白提取試劑盒（凱 基 生 物 公 司）；抗 體ETF、Cyclin D1、CDK4、CDK6、Cyclin E1、RB、p－RB（美國(guó)Cell Signaling Technology公司），二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；BCA蛋白定量試劑、ECL發(fā)光劑、CCK－8細(xì)胞增殖試劑盒（碧云天生物科技有限公司）；SuperScriptⅢ試劑盒（Invitrogen公司）；其他化學(xué)試劑（生工生物有限公司）。

1.3 主要儀器 Western blot及轉(zhuǎn)膜設(shè)備（BioRad公司）；顯影機(jī)（廣州博鷺騰生物有限公司）；StepOne型號(hào)熒光定量PCR（美國(guó)AB Applied Bio?systems公司）；紫外吸收光度儀（BioRad公司）；流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson公司）。

1.4 方法

1.4.1 免疫組化 將76例乳腺癌組織和癌旁組織切片后，置于60℃烘箱中烘烤20 min；二甲苯脫蠟2次，每次5 min；分別采用無(wú)水、95%、70%的乙醇脫水各2次；3%雙氧水甲醇處理切片，抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性；羊血清封閉2 h。ETF抗體1∶200處理后樣本，4℃過夜。次日，PBS清洗3次后加入二抗，二氨基聯(lián)苯胺顯色。

1.4.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組和細(xì)胞轉(zhuǎn)染 人正常乳腺細(xì)胞MCF10A、人乳腺癌MDA－MB－231／MCF－7細(xì)胞培養(yǎng)于10% FBS DMEM培養(yǎng)基，置于37℃5% CO2培養(yǎng)箱，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)慢病毒包裝試劑盒說明書進(jìn)行操作，把感染的MDA－MB－231／MCF－7細(xì)胞培養(yǎng)72 h，收集培育中的清液，即慢病毒液。隨即采用嘌呤霉素篩選感染的靶細(xì)胞，挑選出MDA－MB－231－ETF／MCF－7－ETF組和陰性對(duì)照組MDA－MB－231－NC／MCF－7－NC，未感染MDA－MB－231／MCF－7細(xì)胞作為空白對(duì)照組。

1.4.3 RT－qPCR 分別檢測(cè)76例乳腺癌組織和相應(yīng)癌旁組織、MDA－MB－231－ETF／MCF－7－ETF組、MDA－MB－231－NC／MCF－7－NC和MDA－MB－231／MCF－7細(xì)胞中相關(guān)因子mRNA表達(dá)。采用Trizol試劑裂解組織或細(xì)胞，按照RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。采用SYBR試劑盒進(jìn)行RT－PCR，PCR反應(yīng)體系進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4.4 Western blot法 分別檢測(cè)76例乳腺癌組織和相應(yīng)癌旁組織，MDA－MB－231－ETF／MCF－7－ETF組、MDA－MB－231－NC／MCF－7－NC和MDAMB－231／MCF－7細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)。按照細(xì)胞全蛋白提取試劑盒說明書進(jìn)行蛋白提取，采用NP40裂解液將組織勻漿或細(xì)胞吹散，計(jì)算樣本蛋白濃度。取30 μg全蛋白于15% SDS－PAGE進(jìn)行分離，電轉(zhuǎn)至NC膜，將脫脂奶粉于室溫封閉1 h；一抗4℃過夜，二抗37℃1 h；ECL發(fā)光。

1.4.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將MDA－MB－231－ETF／MCF－7－ETF組、MDA－MB－231－NC／MCF－7－NC和MDA－MB－231／MCF－7組細(xì)胞制成4×105個(gè)／ml細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，按照CCK－8細(xì)胞增殖試劑盒說明書進(jìn)行操作，按照0、12、24、36、72、96 h進(jìn)行時(shí)間設(shè)定，檢測(cè)前4 h每孔加入5 μl CCK－8試劑，棄培養(yǎng)液，在450 nm處測(cè)定吸光度值（OD）值。OD代表細(xì)胞數(shù)目，每組3個(gè)復(fù)孔。

1.4.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 將MDA－MB－231－ETF／MCF－7－ETF組、MDA－MB－231－NC／MCF－7－NC和MDA－MB－231／MCF－7組細(xì)胞制成5×106個(gè)／ml細(xì)胞懸液置于24孔板，按照細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，加入實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基，48 h后，PBS洗滌2次，離心收集細(xì)胞。70%乙醇固定4℃過夜，次日PBS洗滌3次，加入1 mg／ml PI染液，室溫避光孵育30 min后，檢測(cè)細(xì)胞周期分布。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ETF在乳腺癌及癌旁組織中的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示，在76例乳腺癌組織和癌旁組織中，ETF蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率分別為73.68%（56／76）和17.11%（13／76） （χ2＝49.070，P＜0.01）。ETF蛋白主要定位在細(xì)胞質(zhì)中，圖1A。RT－qPCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，ETF在乳腺癌組織中mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著高于癌旁組織（P＜0.01），見圖1B、C。

圖1 ETF在乳腺癌及癌旁組織中的表達(dá)

2.2 ETF對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響 利用慢病毒感染的方式構(gòu)建過表達(dá)ETF MDA－MB－231／MCF－7細(xì)胞株，檢測(cè)ETF對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響。首先采用RT－qPCR和Western blot檢測(cè)MCF10A組、MDA－MB－231／MCF－7組、MDA－MB－231－ETF／MCF－7－ETF組、MDA－MB－231－NC／MCF－7－NC組中ETF表達(dá)情況，結(jié)果顯示ETF在MDA－MB－231／MCF－7細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于MCF10A細(xì)胞（P＜0.01），ETF在乳腺癌細(xì)胞中過表達(dá)。ETF在MDA－MB－231－ETF／MCF－7－ETF組中的表達(dá)顯著高于陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組（P＜0.01），成功構(gòu)建ETF過表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞系，見圖2A－B。采用CCK－8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同細(xì)胞組的增殖情況，結(jié)果顯示在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)MDA－MB－231與MDA－MB－231－NC、MCF－7與MCF－7－NC組細(xì)胞增殖差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。而在48、72、96 h處，與MDA－MB－231／MCF－7組細(xì)胞比較，MDA－MB－231－ETF／MCF－7－ETF組細(xì)胞增殖顯著增強(qiáng)（P＜0.01），見圖2C。

圖2 ETF對(duì)MDA－MB－231／MCF－7細(xì)胞增殖的影響

2.3 ETF對(duì)乳腺癌細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，與MDA－MB－231／MCF－7、MDAMB－231－NC／MCF－7－NC組相比，MDA－MB－231－ETF／MCF－7－ETF組細(xì)胞周期中G1／S期細(xì)胞比例顯著降低（P＜0.01），G2／M期細(xì)胞比例顯著增加（P＜0.01），細(xì)胞周期進(jìn)程加快（P＜0.01），見圖3A。RT－qPCR和Western blot結(jié)果顯示，與MDA－MB－231／MCF－7、MDA－MB－231－NC／MCF－7－NC組相比，MDA－MB－231－ETF／MCF－7－ETF組Cyclin D1、CDK4、CDK6、Cyclin E1 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組（P＜0.01），RB mRNA和蛋白水平與陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但其磷酸化蛋白水平顯著高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組（P＜0.01），見圖3B、C。

圖3 ETF對(duì)MDA－MB－231／MCF－7細(xì)胞周期及相關(guān)細(xì)胞周期蛋白的影響

3 討論

乳腺癌是女性惡性腫瘤發(fā)病率最高的癌癥，預(yù)估到2020年，全球乳腺癌患者將達(dá)1 785萬(wàn)，且呈年輕化趨勢(shì)［11］。因此，研究乳腺癌發(fā)病的分子機(jī)制，尋找能夠大大提高乳腺癌早期診斷的腫瘤標(biāo)志物就顯得尤為重要。

轉(zhuǎn)錄因子ETF的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在腫瘤發(fā)展過程中起著重要作用，與人類惡性腫瘤的臨床病理參數(shù)密切相關(guān)，可作為判斷預(yù)后的生物標(biāo)志物。在肝癌組織中ETF和VGLL4 mRNA的表達(dá)均顯著高于正常對(duì)照組，且在晚期患者的肝癌組織中ETF mRNA的表達(dá)高于早期患者，且ETF和VGLL4 mRNA高表達(dá)與上皮－間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和血管生成有關(guān)，提示ETF和VGLL4在腫瘤發(fā)生發(fā)展進(jìn)展中發(fā)揮重要作用［12］。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87－MG、LN229細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)YAP1促進(jìn)ETF入核，且復(fù)合物能夠直接作用MES基因啟動(dòng)子，進(jìn)而調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)程［13］。

目前鮮見關(guān)于ETF對(duì)乳腺癌增殖影響的報(bào)道，因此本研究檢測(cè)ETF在乳腺癌組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示其在乳腺癌組織中的陽(yáng)性率顯著升高，與體外細(xì)胞中檢測(cè)結(jié)果相似，提示ETF蛋白高表達(dá)可能與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在體外構(gòu)建高表達(dá)ETF蛋白的乳腺癌細(xì)胞系，并檢測(cè)ETF對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示ETF能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖。在對(duì)機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，ETF能夠通過提升G2／M期細(xì)胞比例，使細(xì)胞周期進(jìn)程加快。在檢測(cè)周期相關(guān)蛋白表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，Cyclin D1、CDK4、CDK6、Cyclin E1和p－RB在MDAMB－231－ETF／MCF－7－ETF組表達(dá)量顯著高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，因此，提示在乳腺癌細(xì)胞穩(wěn) 轉(zhuǎn)ETF后，通 過 提 高Cyclin D1、CDK4、CDK6、Cyclin E1和p－RB的表達(dá)，使細(xì)胞更快速通過G1／S期，G2／M期細(xì)胞比例高，加快細(xì)胞周期進(jìn)程。RB是抑癌基因，非磷酸化形式存在于G0／G1期，磷酸化形式存在于S／G2期，RB過度磷酸化是其失活的重要機(jī)制，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞周期及細(xì)胞增殖異常［14－15］。提示ETF通過調(diào)節(jié)周期相關(guān)蛋白表達(dá)加速乳腺癌細(xì)胞增殖。

綜上所述，ETF與乳腺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可成為潛在的臨床早期診斷及不良預(yù)后的標(biāo)記物。接下來(lái)本課題組將會(huì)繼續(xù)探究ETF對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移等方面的影響，為乳腺癌的發(fā)生發(fā)展的標(biāo)志物和潛在的重要靶點(diǎn)奠定理論基礎(chǔ)。