劉琨毅，羅慧，李崇萍，馬燕，2，程建勝，趙菊潤，張新鳳，趙明，2*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，龍潤普洱茶學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)西南中藥材種質(zhì)創(chuàng)新與利用國家地方聯(lián)合工程研究中心，云南 昆明 650201；3.宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院五糧液技術(shù)與食品工程學(xué)院，四川 宜賓 644003；4.云南品斛堂生物科技有限公司，云南 德宏 678400；5.龍陵縣石斛研究所，云南 寶山 678300；6.浙江農(nóng)林大學(xué)省部共建亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300）

人參果是一種漿果類作物，其果肉清爽多汁，味道清甜，富含維生素和微量元素，特別是鈣和硒含量高于大多數(shù)水果[1-2]，具有消炎、抗衰老、補(bǔ)鈣、降血壓、降血糖、美容等功效[3]。因此，將人參果加工成各類產(chǎn)品會有較大的市場潛力。鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）是我國傳統(tǒng)名貴藥材，在其種植過程中盛開的石斛花，不僅具有觀賞價值，而且具有重要的開發(fā)價值[4]。鐵皮石斛花作為一種新食品原料[5]，其含有豐富的多糖、氨基酸、黃酮等營養(yǎng)成分，具有抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用[6-7]。目前鐵皮石斛花的相關(guān)產(chǎn)品還停留在初加工水平，造成了一定的資源浪費(fèi)[8]，因而有必要開發(fā)其高附加值的產(chǎn)品。

復(fù)合型發(fā)酵酒是利用兩種或多種富含可發(fā)酵性糖釀造而成的低酒精度飲品[9]，經(jīng)過釀造工藝優(yōu)化后能夠綜合幾種原料的香味、風(fēng)味物質(zhì)及營養(yǎng)成分，使產(chǎn)品的口感、香氣及滋味更加豐富[10-11]?；诖?，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上運(yùn)用響應(yīng)面法，以人參果和鐵皮石斛花為主要原料，探究人參果鐵皮石斛花復(fù)合果酒感官評分和酒精度含量最高時的最優(yōu)生產(chǎn)工藝，并檢測其黃酮類物質(zhì)的含量，為人參果和鐵皮石斛花資源的開發(fā)利用提供一定的參考價值，為新型復(fù)合果酒的研發(fā)、釀造提供數(shù)據(jù)支撐和指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵皮石斛花：于2018年5月采自云南品斛堂生物科技有限公司云南龍陵石斛種植基地，采摘后烘干，粉碎后過40目篩，待用；新鮮人參果、白砂糖：市售；釀酒酵母：安琪酵母股份有限公司；鞣花酸、楊梅素、蘆丁、槲皮素、山奈酚、花旗松素：成都曼思特生物科技有限公司；偏重亞硫酸鉀、維生素 C（vitamin C，VC）（均為食品級）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；檸檬酸（食品級）：湖北鑫潤德化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CP214型電子天平：北京賽多利斯天平有限公司；HH-S28S型數(shù)顯恒溫水浴鍋；金壇市大地自動化儀器廠；JHBE-50T型閃式提取器：河南智晶生物科技股份有限公司；SW-CJ-1FD型超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LRHS-250-II型生化培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)器械有限公司；1200型高速液相色譜系統(tǒng)：美國Agilent公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 人參果鐵皮石斛花復(fù)合果酒生產(chǎn)工藝流程

人參果→洗滌→榨汁→裝瓶→添加鐵皮石斛花粉→成分調(diào)整→巴氏滅菌→接種→主發(fā)酵→固液分離→低溫貯存→過濾→成品

操作要點(diǎn)：選取新鮮的人參果去皮后放入閃式提取器中榨汁[料水比 1∶1（g/mL）]，并加入 0.08%VC用于護(hù)色，取100 mL加入250 mL的三角瓶內(nèi)，按照一定比例添加鐵皮石斛花粉，加糖調(diào)整到試驗(yàn)所需糖度并加入0.01%偏重亞硫酸鉀，利用檸檬酸將果汁的pH值調(diào)整為4.0，巴氏滅菌（65℃、30 min）后待冷卻按體積分?jǐn)?shù)接入一定量經(jīng)活化后的酵母菌懸液（在釀酒酵母粉中加入10倍質(zhì)量30℃的純凈水，活化20 min），在一定溫度條件下發(fā)酵，主發(fā)酵7 d結(jié)束；固液分離后15℃貯存3 d，4層紗布過濾后得到成品。

1.3.2 人參果鐵皮石斛花復(fù)合果酒生產(chǎn)工藝單因素優(yōu)化試驗(yàn)

參考劉琨毅等[12]的方法，在4%鐵皮石斛花添加量、20.0%初始糖度、0.03%釀酒酵母接種量及22℃發(fā)酵溫度的基礎(chǔ)條件下，每次只改變4個因素中的1個因素，保持其他因素不變，分別設(shè)置鐵皮石斛花添加量（0%、2%、4%、6%、8%）、初始糖度（15.0%、17.5%、20.0%、22.5%、25.0%）、釀酒酵母接種量（0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%）及發(fā)酵溫度（18、20、22、24、26℃），以感官評分及酒精度為指標(biāo)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.3.3 人參果鐵皮石斛花復(fù)合果酒生產(chǎn)工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以鐵皮石斛花添加量（A）、初始糖度（B）、釀酒酵母接種量（C）、發(fā)酵溫度（D）為4個因素，以感官評分（Y1）和酒精度（Y2）為考察指標(biāo)設(shè)計進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

1.3.4 人參果鐵皮石斛花復(fù)合果酒感官評價方法

感官評分由11名（6男5女）品酒師組成的感官評定小組參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[13]對人參果鐵皮石斛花復(fù)合果酒從外觀、香氣、滋味、風(fēng)格4個方面進(jìn)行感官評分，滿分100分，每個樣品的感官評分取平均分，評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 人參果鐵皮石斛花復(fù)合果酒的感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory score standards of pepino fruit and D.officinale′s flower compound fruit wine

1.3.5 人參果鐵皮石斛花復(fù)合果酒黃酮類物質(zhì)測定方法

按照前期建立的方法，應(yīng)用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC） 檢測人參果鐵皮石斛花復(fù)合果酒中黃酮類成分，并根據(jù)峰面積使用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析[14]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

以上每個試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用OriginPro 12.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)制圖，應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，利用Design Expert 10.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 人參果鐵皮石斛花復(fù)合果酒單因素試驗(yàn)

不同鐵皮石斛花添加量對人參果石斛花復(fù)合果酒品質(zhì)的影響如圖1所示。

圖1 不同鐵皮石斛花添加量對人參果石斛花復(fù)合果酒品質(zhì)的影響Fig.1 Effects of different addition of D.Officinale′s flower on the quality of pepino fruit and D.officinale flower compound fruit wine

由圖1可知，隨著鐵皮石斛花添加量的增加，人參果鐵皮石斛花復(fù)合果酒的感官評分呈現(xiàn)先升后降的趨勢。鐵皮石斛花添加量為6%時，復(fù)合果酒感官評分達(dá)到最高，為84.7±0.8；當(dāng)鐵皮石斛花添加量繼續(xù)增加后，復(fù)合果酒的感官評分顯著下降（P＜0.05）。當(dāng)鐵皮石斛花添加量較低（＜6%）時，復(fù)合果酒香氣較為寡淡，故造成復(fù)合果酒的感官評分不高；當(dāng)鐵皮石斛花添加量較高時（＞6%），人參果香氣不突出且復(fù)合果酒的香氣不愉悅。加之復(fù)合果酒的酒精度不隨鐵皮石斛花添加量的變化而顯著變化（P＞0.05），由此，選擇鐵皮石斛花添加量為6%用于后續(xù)試驗(yàn)。

不同初始糖度對人參果石斛花復(fù)合果酒品質(zhì)的影響如圖2所示。

圖2 不同初始糖度對人參果石斛花復(fù)合果酒品質(zhì)的影響Fig.2 Effects of different initial sugar content on the quality of pepino fruit and D.officinale flower compound fruit wine

由圖2可知，當(dāng)初始糖度從15.0%增加至22.5%時，人參果鐵皮石斛花復(fù)合果酒的感官評分呈上升趨勢，其感官評分最高分為86.2±1.1；當(dāng)初始糖度繼續(xù)增加后，復(fù)合果酒的感官評分反而下降。初始糖度直接影響復(fù)合果酒的發(fā)酵過程，糖分是酵母發(fā)酵主要動力來源，在發(fā)酵過程中，糖分轉(zhuǎn)化成乙醇、酸類、酯類等物質(zhì)[15]。初始糖度過低，酵母發(fā)酵動力不足；初始糖度過高，導(dǎo)致復(fù)合果酒殘?zhí)沁^多影響感官品質(zhì)[16]。雖然酒精度隨著初始糖度的增加而增加，但是初始糖度從22.5%增加到25.0%時酒精度增加了3.4%，但感官評分卻下降較多。綜合考慮復(fù)合果酒感官評分和酒精度，選擇初始糖度為22.5%進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

不同釀酒酵母接種量對人參果石斛花復(fù)合果酒品質(zhì)的影響如圖3所示。

由圖3可知，隨著釀酒酵母接種量的逐漸增加，復(fù)合果酒的感官評分與酒精度均呈先上升后下降的趨勢。在釀酒酵母接種量為0.04%時，感官評分與酒精度均達(dá)到最高值，分別為 88.7±0.7、（11.7±0.1）%vol。釀酒酵母是主要的產(chǎn)酒精的微生物，在發(fā)酵過程中生成酒精及其他的香氣成分[17]。酵母接種量較低時，不能充分發(fā)酵糖分，導(dǎo)致糖分過剩，酒精度過低；而過高的酵母接種量，并不能提高復(fù)合果酒的酒精度，反而使發(fā)酵不完全[18]。綜合考慮，選擇釀酒酵母接種量為0.04%進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖3 不同釀酒酵母接種量對人參果石斛花復(fù)合果酒品質(zhì)的影響Fig.3 Effects of different inoculation of S.cerevisiae on the quality of pepino fruit and D.officinale flower compound fruit wine

不同發(fā)酵溫度對人參果石斛花復(fù)合果酒品質(zhì)的影響如圖4所示。

由圖4可知，發(fā)酵溫度直接影響復(fù)合果酒的品質(zhì)，當(dāng)發(fā)酵溫度從18℃上升至26℃時，復(fù)合果酒感官評分呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。當(dāng)發(fā)酵溫度為22℃時，復(fù)合果酒感官評分達(dá)到最高分，為88.7±0.7。復(fù)合果酒的酒精度隨著發(fā)酵溫度的升高而增加，當(dāng)發(fā)酵溫度從24℃升高至26℃時，酒精度增加不再顯著（P＞0.05）。當(dāng)發(fā)酵溫度為18℃時，酵母菌生長相比22℃時受到一定的抑制，酒體發(fā)酵不充分，復(fù)合果酒酒精度偏低進(jìn)而影響感官品質(zhì)；當(dāng)發(fā)酵溫度從22℃升高至26℃時，酵母菌的生長速度逐漸加快、代謝活躍，導(dǎo)致酒體整體風(fēng)味不佳進(jìn)而促使感官評分顯著降低[18]。綜合考慮，選擇發(fā)酵溫度為22℃進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 人參果鐵皮石斛花復(fù)合果酒響應(yīng)面法試驗(yàn)

人參果鐵皮石斛花復(fù)合果酒生產(chǎn)工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 人參果鐵皮石斛花復(fù)合果酒生產(chǎn)工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis of pepino fruit and D.officinale flower compound fruit wine

對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析[19]，結(jié)果如表3所示。

表3 響應(yīng)面結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface results

分別以感官評分（Y1）和酒精度（Y2）為響應(yīng)值，經(jīng)回歸擬合后，得到相應(yīng)的回歸方程：Y1=87.74＋1.43A-0.27B-0.47C-1.55D-1.78AB-0.65AC-0.85AD+0.30BC＋0.48BD＋2.38CD-3.15A2-3.92B2-4.23C2-1.74D2；Y2=12.34＋0.20A-0.03B-0.06C-0.23D-0.23AB-0.08AC-0.10AD＋0.05BC＋0.08BD＋0.35CD-0.39A2-0.54B2-0.55C2-0.20D2。

根據(jù)方差分析，模型極顯著（P＜0.01），且失擬項不顯著（P＞0.05），表明未知因素對試驗(yàn)結(jié)果的干擾較?。ū?），可以通過模型確定以感官評分與酒精度為響應(yīng)值時人參果鐵皮石斛花復(fù)合果酒釀造的最佳工藝條件[20-21]。感官評分的相關(guān)系數(shù)R2=0.8957、R2adj=0.7914，酒精度的相關(guān)系數(shù)R2=0.894 5、R2adj=0.788 9，說明感官評分和酒精度的試驗(yàn)值與預(yù)測值之間有較好的擬合度；感官評分與酒精度的變異系數(shù)（C.V.）分別為1.93%、1.85%，均小于5.00%，表明模型重現(xiàn)性較好。4個因素對復(fù)合果酒感官評分的影響次序?yàn)镈＞A＞C＞B，即發(fā)酵溫度對復(fù)合果酒感官評分的影響最為顯著，其次是鐵皮石斛花添加量，再次是釀酒酵母接種量。一次項 A、D，交互項 CD，二次項 A2、B2、C2對復(fù)合果酒感官評分的影響極顯著（P＜0.01）；交互項AB，二次項D2對復(fù)合果酒感官評分的影響達(dá)到了顯著水平（P＜0.05）。各因素交互作用對人參果鐵皮石斛花復(fù)合果酒感官評分影響的響應(yīng)曲面結(jié)果見圖5。

由圖5可知，4個因素的兩兩相互作用中，因素C與因素D所形成的響應(yīng)面曲面坡度最為陡峭與方差分析中交互項CD對復(fù)合果酒感官評分的影響極顯著（P＜0.05）的結(jié)論相吻合。

圖5 各因素交互作用對人參果鐵皮石斛花復(fù)合果酒感官評分影響的響應(yīng)曲面Fig.5 Response surface plot of interactive of various factors on sensory evaluation of pepino fruit and D.officinale flower compound fruit wine

由表3知，發(fā)酵溫度對復(fù)合果酒酒精度的影響最為顯著，其次是鐵皮石斛花添加量，再次是釀酒酵母接種量，最后是初始糖度。一次項A、D，交互項CD，二次項A2、B2、C2對復(fù)合果酒酒精度的影響極顯著（P＜0.01）；二次項D2對復(fù)合果酒酒精度的影響達(dá)到了顯著水平（P＜0.05）。各因素交互作用對人參果鐵皮石斛花復(fù)合果酒酒精度影響的響應(yīng)曲面結(jié)果見圖6。

由圖6可知，4個因素的兩兩相互作用中，因素C與因素D所形成的響應(yīng)面曲面坡度最為陡峭，表明釀酒酵母接種量與發(fā)酵溫度的交互作用對復(fù)合果酒酒精度的影響最為顯著。

圖6 各因素交互作用對人參果鐵皮石斛花復(fù)合果酒酒精度影響的響應(yīng)曲面Fig.6 Response surface plot of interactive of various factors on alcohol content of pepino fruit and D.officinale flower compound fruit wine

通過響應(yīng)面軟件分析，復(fù)合果酒在鐵皮石斛花添加量6.84%、初始糖度22.03%、釀酒酵母接種量0.04%、發(fā)酵溫度為20.42℃的條件下，感官評分可獲得最高的理論值89.749 6；在鐵皮石斛花添加量6.97%、初始糖度21.95%、釀酒酵母接種量0.04%、發(fā)酵溫度為20.00℃的條件下，酒精度可獲得最高的理論值12.530 7%vol。后續(xù)在鐵皮石斛花添加量7%、初始糖度22%、釀酒酵母接種量0.04%、發(fā)酵溫度為20℃的條件下進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，其感官評分與酒精度分別為 90.1±0.8 與（12.5±0.1）%vol，測定結(jié)果穩(wěn)定與理論值相差不大，證明該結(jié)果合理可靠。

2.3 人參果鐵皮石斛花復(fù)合果酒黃酮類物質(zhì)分析

測定人參果鐵皮石斛花復(fù)合果酒在經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后的工藝條件下黃酮類物質(zhì)的含量，結(jié)果如表4所示。

表4 人參果鐵皮石斛花復(fù)合果酒黃酮類物質(zhì)含量Table 4 The Content of flavonoids in pepino fruit and D.Officinale′s flower compound fruit wine μg/mL

在復(fù)合果酒中檢測出4種黃酮類物質(zhì)，分別為花旗松素、蘆丁、鞣花酸和楊梅素，其總含量為（168.1±13.4）μg/mL。研究表明，上述4種物質(zhì)均具有重要的生物活性，如花旗松素具有抗氧化、抗炎、抑制腫瘤等生理功能[22]；蘆丁對痛風(fēng)、心血管疾病和糖尿病的治療有一定作用[23]；鞣花酸能夠預(yù)防人類骨肉瘤[24]；楊梅素可以改善由免疫應(yīng)答引起的炎癥反應(yīng)[25]。

3 結(jié)論

經(jīng)過響應(yīng)面試驗(yàn)得到人參果鐵皮石斛花復(fù)合果酒的最優(yōu)釀造條件：在鮮榨的人參果汁中添加7%鐵皮石斛花，并加入0.08%VC，調(diào)整初始糖度為22%與pH值為4.0，隨后加入0.01%偏重亞硫酸鉀，巴氏滅菌后接入0.04%釀酒酵母，于20℃條件下發(fā)酵7 d，固液分離，液體15℃貯存3d。在此條件下可獲得淺黃透明、酒香和諧、滋味爽口，感官評分為90.1±0.8，酒精度（12.5±0.1）%vol和黃酮類物質(zhì)含量（168.1±13.4）μg/mL的人參果鐵皮石斛花復(fù)合果酒，其中發(fā)酵溫度對復(fù)合果酒感官評分與酒精度的影響最為顯著，其次是鐵皮石斛花添加量，再次是釀酒酵母接種量，最后是初始糖度。試驗(yàn)結(jié)果為拓寬人參果與鐵皮石斛花的應(yīng)用范圍提供了理論依據(jù)。