*衛(wèi) 強(qiáng)，劉瑞杰，劉 娣，魏燦燦

（安徽新華學(xué)院藥學(xué)院，安徽，合肥 230088）

櫻花(Cerasua serrulata)為薔薇科(Rosaceae)櫻屬(Cerasus)植物，在世界各地都有栽培，具有很高的觀賞價值[1]。據(jù)報道，在日本國，其花、葉、汁均可食用，將其加工成櫻葉汁，清香撲鼻。每年的三四月份，日本櫻花盛開。每到春天，人們信手采來最新鮮的葉子晾干，再放到密封瓶子里保存。還有些主婦，索性將新鮮櫻花葉子冷凍起來，以便隨時取出制作櫻花餅或櫻花粥[2]。櫻花中富有高膳食纖維、高鉀、高鈣、高鐵，具有較高的營養(yǎng)價值[3]。櫻花中還含有多糖、黃酮、綠原酸和揮發(fā)油成分[4-5]，平均綠原酸含量高于菊花和桂花，揮發(fā)油中硅氧烷類物質(zhì)用于化妝品和身體護(hù)理產(chǎn)品[6]。

櫻花同種可開放紅色和白色兩種顏色的花，其顏色各異，化學(xué)成分也有所不同。本研究以黃酮、多糖、色素成分為研究對象，比較櫻花中紅花和白花多糖、黃酮和色素成分的含量及抑制α-葡萄糖苷酶活性，為其資源開發(fā)和利用提供一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

儀器：紫外分光光度儀（尤尼柯儀器有限公司），超聲波提取器（廣州萬程微波設(shè)備有限公司），1260 型高效液相色譜儀（美國Angilent 科技有限公司），TJ270-30A 紅外光譜儀（天津拓普儀器有限公司）等。

材料：櫻花采自安徽新華學(xué)院校園內(nèi)。高效液相色譜用試劑為色譜純，所用試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 總黃酮含量的比較

精密稱量蘆丁對照品5 mg，置于100 mL 容量瓶，加乙醇溶解并定容，得濃度為50 μg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取上述溶液1、2、3、4、6、8、12 mL 于25 mL 量瓶中，加入0.5 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置6 min，再加入0.5 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，放置6 min 后再加入4 mL 2%氫氧化鈉溶液，搖勻，放置15 min。以相應(yīng)試劑為空白，于510 nm 波長下測定吸收度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：A=0.0286C+0.0121，r=0.9992。

取紅色和白色櫻花50℃烘干，各精密稱取5 g，加入80%乙醇200 mL，回流提取各3 次（第一次2 h，第二次1 h，第三次0.5 h），合并提取液。吸取提取液5 mL，加水15 mL，再加入石油醚20 mL，萃取3 次，水層保留，取水層1 mL，置25 mL 量瓶中，測定含量。

1.2.2 多糖含量的比較

精密稱量干燥至恒重的葡萄糖50 mg，加水溶解，轉(zhuǎn)移至500 mL 容量瓶，加水定容至刻度，搖勻，配成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。再吸取0.5、1、2、3、5、7 mL 分別置于10 mL 容量瓶中，加水定容至刻度，配成濃度為0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、0.7 mg/mL 的對照溶液，備用[7]。

準(zhǔn)確量取蒸餾水2 mL 和上述葡萄糖對照溶液各2 mL，置于干燥的具塞試管，加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，置于冰水中，然后立即加入濃硫酸5 mL，搖勻，放置15 min 置于100℃沸水中加熱15 min，取出，再置于冰水中放置15 min，以蒸餾水溶液作空白，于490 nm 處測定吸收度。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以吸收度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：A=9.128C+0.014，r=0.998[7]。

取1.2.1 項下藥渣，加200 mL 水，回流提取3次（第一次3 h，第二次2 h，第三次1 h），合并提取液。取提取液20 mL，以Sevage 法除去蛋白質(zhì)后測定含量。

1.2.3 色素成分提取與比較

1.2.3.1 色素的提取

以水、甲醇、無水乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙酸乙酯-乙醇（1:1）、氯仿-甲醇（1:1）、氯仿、石油醚各30 mL 超聲提取10 min，不過濾，傾倒入試管中，觀察其顏色，以白花和紅花原色為標(biāo)準(zhǔn)，選擇提取溶劑。

1.2.3.2 色素顯色反應(yīng)

將所得色素取適量移入試管，分別滴入10%氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液、5%碳酸鈉溶液、5%三氯化鋁乙醇溶液、2%乙酸鎂甲醇溶液、2%三氯化鐵乙醇溶液、2%鐵氰化鉀溶液-2%三氯化鐵溶液、2%硼氫化鈉甲醇液、鹽酸-鎂粉、5%香草醛-鹽酸溶液，記錄所呈顏色[8]。

1.2.3.3 色素紫外光譜（UV）分析

以乙醇為空白溶劑，對紅色、白色櫻花中色素進(jìn)行紫外掃描。

1.2.3.4 色素高效液相色譜（HPLC）比較

將紅色、白色櫻花的乙酸乙酯、乙酸乙酯-乙醇（1:1）超聲提取液過0.45μm 有機(jī)相濾膜濾過，進(jìn)行HPLC 測試，流動甲醇（B）-水（A）梯度洗脫：0～10min，90%～10%，10～15min，10%～90%，15～20 min，90～10%，檢測波長254nm，流速1.0mL/min，柱溫25℃[8]。

1.2.3.5 色素紅外光譜（IR）比較

取1.2.1 項下紅色、白色櫻花的提取液，水浴蒸干，上X-5 大孔樹脂柱（30 g），先以水洗至無色，再以80%乙醇洗脫，洗脫液減壓濃縮，干燥至恒重，以溴化鉀壓片，進(jìn)行紅外光譜測定。

1.2.4 抑制α-葡萄糖苷酶活性

取0.45 μm 過濾膜提取液1 mL，60℃干燥至恒重，以50 mL二甲基亞砜(DMSO) 溶解。參考文獻(xiàn)[9]測定α-葡萄糖苷酶活性，取500 μL磷酸鹽緩沖液( 0.1mol/L，pH 值6. 8) 和50 μL 0.01776 mol/L 4 -硝基酚-α-D -呋喃葡萄糖苷(PNPG) 于10 mL刻度試管，加入50 μL 0.625 g/L的樣品和50 μL0.10U/mL的α-葡萄糖苷酶，溫浴20 min，用1.0 mol/L Na2CO3溶液100 μL 終止反應(yīng)，將反應(yīng)液于405 nm 波長下測定吸收度，并用蒸餾水代替酶液作空白。每個樣品同一濃度下作3個平行，取其平均值。同時做相同體系下的樣品空白組(A樣品空白) ，不加樣品的陰性對照組(A陰性) ，不加樣品、酶與底物的空白對照組(A空白) 。按照酶活性抑制率=[1-(A樣品-A樣品空白)/(A陰性-A空白)]×100%，計算抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮、多糖含量及抑制α-葡萄糖苷酶活性

表1 顯示，紅色櫻花中黃酮和多糖的含量較高，分別達(dá)到12 mg/g 和20 mg/g，其中紅色櫻花中黃酮含量高出白色櫻花約50%。紅色櫻花中黃酮和多糖成分抑制α-葡萄糖苷酶活性較強(qiáng)，分別達(dá)到80.76%和70.16%，顯示紅色櫻花可能在有效成分的開發(fā)應(yīng)用上有一定資源優(yōu)勢。

表1 不同成分抑制α-葡萄糖苷酶活性（n=3）Table 1 Different compositions and inhibitory effect on α-glycosidase

2.2 色素成分比較

2.2.1 色素的提取

由表2 可知，以櫻花本色為參考，確定乙酸乙酯-乙醇（1:1）提取紅色櫻花中花色素較好，以乙酸乙酯提取白花櫻花中花色素較好。

表2 紅色、白色櫻花中色素成分的提取Table 2 Extracting method of red and white flowers pigment of Cerasua serrulata

2.2.2 色素顯色反應(yīng)

根據(jù)實驗方法，測定色素顯色反應(yīng)，結(jié)果如表3所示。紅色、白色櫻花中色素均與鹽酸-鎂粉反應(yīng)呈淺紅，表明均有有黃酮類成分；氫氧化鈉、碳酸鈉、三氯化鋁、乙酸鎂反應(yīng)，表明其均含有酚羥基基團(tuán)；與三氯化鐵、鐵氰化鉀-三氯化鐵呈綠色，且較深，表明為酚類；與硼氫化鉀反應(yīng)呈橙紅色，表明紅色櫻花色素中可能含少量二氫黃酮類，而白色櫻花不反應(yīng)。白色櫻花色素與香草醛-鹽酸反應(yīng)呈粉紅色，表明可能含有間苯二酚或間苯三酚結(jié)構(gòu)[8-9]。因此，初步判斷紅色、白色櫻花中色素主要成分可能分別為黃酮類、酚類。

表3 紅色、白色櫻花中色素成分的顯色反應(yīng)Table 3 Chromogenic reaction of red and white flowers pigment of Cerasua serrulata

2.2.3 色素UV 比較

經(jīng)過紫外掃描，紅色色素在423、370 nm 有最大吸收，且在200 nm 左右有較多雜峰，符合黃酮帶Ⅰ300～400 nm，帶Ⅱ220～280 nm 吸收特征[10]，提示可能含有黃酮成分。白色櫻花中色素成分于426、370 nm 處也有明顯吸收峰，符合黃酮帶Ⅰ300～400 nm 吸收范圍，但未見帶Ⅱ240～280 nm吸收，提示可能是白色櫻花中黃酮含量較低，導(dǎo)致吸收較弱。

2.2.4 色素HPLC 比較

根據(jù)HPLC 檢測方法，測定了色素的可能組成，結(jié)果圖1 所示。保留時間6.162 min（6.163 min）可能為白、紅櫻花色素相似或相同成分，且在兩花中含量均較高，其成分類型有待進(jìn)一步研究確定。而其他成分差異較大。

圖1 紅色、白色櫻花中色素HPLC 分析Fig.1 HPLC analysis of red and white flowers pigment of Cerasua serrulata

2.2.5 色素IR 比較

由圖2 可知，紅色、白色櫻花中色素于3370、3390 cm-1處均為強(qiáng)而寬的羥基伸縮振動吸收峰；1600、1450、812 cm-1為苯環(huán)骨架振動吸收帶；1070、1080 cm-1均為芳香基團(tuán)不飽和C-H 彎曲振動吸收峰，這充分顯示兩種色素類成分為芳香類化合物。紅色、白色櫻花中色素于1260、1270 cm-1處為芳香醚（Ar-O-C）基團(tuán)伸縮振動吸收峰[11]。另外，紅色櫻花中色素于1000～1750 cm-1處顯示更多的相關(guān)峰，且有1260 cm-1峰強(qiáng)度較強(qiáng)，有812cm-1峰，顯示黃酮含量高，而白色櫻花中色素在該區(qū)域相關(guān)峰較少，1270 cm-1峰強(qiáng)度弱，顯示黃酮含量較低。

圖2 紅色、白色櫻花中色素IR 分析光譜Fig.2 IR scanning spectrum of red and white flowers pigment of Cerasua serrulata

3 討論

兩種顏色櫻花中化學(xué)成分對比研究表明，紅色櫻花中黃酮和多糖的含量較高，其中黃酮含量高出白色櫻花50%，多糖含量高出白色櫻花33%，說明紅色櫻花有一定資源優(yōu)勢。根據(jù)顯色反應(yīng)和UV、IR 光譜初步判斷，紅色、白色櫻花中色素主要成分可能分別為黃酮類、多酚類。HPLC 譜圖判斷紅色、白色櫻花有相同或相似成分，國內(nèi)報道也說明紅色、白色梅花的花色色素含相同黃酮成分，紅色花色源于花色素或花色苷[12]。另外，櫻花中黃酮、多糖和色素成分的組成、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)有待進(jìn)一步鑒定，紅色和白色之間變色機(jī)理有待進(jìn)一步深入研究。

據(jù)報道，天然產(chǎn)物中多糖成分具有抗腫瘤[13]、免疫調(diào)節(jié)[13-14]、抗糖尿病[15]、抗凝血[16]、抗病毒[17]、抗氧化活性[18]及抑制α-葡萄糖苷酶作用[19]。黃酮成分具有抑制金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的作用[20]。色素成分有抗氧化、抗腎結(jié)石作用[21]。酚類成分有抗氧化、抗菌作用[22]。另外，國內(nèi)對于櫻花中多種成分的研究和開發(fā)受到廣泛關(guān)注，如櫻花黃酮、多糖的抗氧化活性[4-5]，其黃酮可明顯抑制二甲苯致小鼠耳腫脹和降低冰醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性[23]。櫻花紅色素可作為食用色素用于食品行業(yè)，具有安全、無毒等特點[24]。櫻花提取物可促進(jìn)乳酸菌增殖，抑制酸奶的后酸化，提高酸奶的抗氧化活性[25]。國內(nèi)已分離出多種抑制α-葡萄糖苷酶的黃酮成分，有學(xué)者從506157 菌株次級代謝產(chǎn)物中分離出的4'，7-二羥基異黃酮[26]，從鏈霉菌屬菌中分離出的染料木黃酮[27]，從大豆分離出大豆異黃酮[28]，從印度魚藤分離出的4’，5’，7-三羥基異戊二烯基異黃酮[29]。因此，櫻花的研究和開發(fā)具有廣闊的市場前景。