單家明，孟 巖，李焐儀，熊 豪，楊武亮

（江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西，南昌 330004）

大黃是蓼科植物掌葉大黃（Rheum palmatumL.）、唐古特大黃（Rheum tanguticumMaxim. ex Balf.）或藥用大黃（Rheum officinaleBaill.）的干燥根和根莖，具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)、利濕退黃的功效[1]，其中具有瀉下作用的是蒽醌類物質(zhì)[2～4]。大黃主產(chǎn)于甘肅、青海、四川、重慶等地。作為多產(chǎn)區(qū)藥材，由于地理環(huán)境和氣候因素的影響，不同產(chǎn)地的大黃在化學(xué)成分的組成和含量上必定存在一些差異[5]。高效液相色譜（HPLC）從化學(xué)成分的角度對中藥進(jìn)行分析，是目前中藥分析鑒別最常用的方法之一[6]，但該方法的樣品制備過程往往較為復(fù)雜。傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）具有操作簡單、樣品需求小和分析迅速等特點(diǎn)[7]，同時(shí)，紅外光譜從整體性的角度對中藥材進(jìn)行分析，能夠?qū)χ兴幍脑夹畔⑦M(jìn)行最真實(shí)的反映，對于同一中藥，其化學(xué)成分的差異能夠通過紅外光譜中吸收峰的數(shù)目、位置、強(qiáng)度及形態(tài)表現(xiàn)出來[8]。本研究分別采用上述兩種方法對37 批大黃藥材進(jìn)行分析，并對其品種和產(chǎn)地進(jìn)行了區(qū)分。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與軟件

儀器：萬分之一天平（型號：Sartorius BT 224 S，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；十萬分之一電子天平（Sartorius BT 25 S，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；Spectrum Two 傅里葉變換紅外光譜儀（Perkin Elemer 公司）； Agilent 1260 高效液相色譜儀（包括四元泵、在線脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、DAD檢測器和色譜工作站）。

軟件：OMNIC 8.2 紅外分析軟件、中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2012 軟件。

1.2 藥材與試劑

1.2.1 藥材

掌葉大黃標(biāo)準(zhǔn)藥材（批號：121249-201304）、藥用大黃標(biāo)準(zhǔn)藥材（批號：120984-201202）；蘆薈大黃素（批號：110722-201815）、大黃酸（批號：110721-201818）、大黃素（批號：111857-201703）、大黃酚（110796-201621）、大黃素甲醚（110758-201616），均購自中國食品藥品檢定研究院。蘆薈大黃素-8-O-β-葡萄糖苷（批號：PS1497)、蘆薈大黃素-3-（羥甲基）-O-β-D-葡萄糖苷（批號：PS1495)、大黃酸-8-O-葡萄糖苷（批號：PS1697)、大黃酚-1-O-β-D-葡萄糖苷（批號：PS1506)、大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷（批號：PS1507)、大黃素甲醚-8-O-β-D 葡萄糖苷（批號：PS1508)、大黃素甲醚-1-O-β-D 葡萄糖苷（批號：PS1524)、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷（批號：PS1521)，均購于成都普思生物科技股份有限公司，含量HPLC 歸一化均為98%。

所有大黃均由江西樟樹藥都制藥有限公司提供，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)賴學(xué)文教授鑒定。大黃品種及產(chǎn)地詳見表1。

表1 樣品信息Table 1 Information of sample

1.2.2 試劑

溴化鉀（光譜純，上海麥克林生化科技有限公司）；甲醇（AR 級）；甲醇（HPLC 級）。

2 方法

2.1 供試品與混合對照品的制備

2.1.1 紅外供試品的制備

取大黃粉碎，過五號篩，置于烘箱中60℃干燥2 h，KBr 粉末置于烘箱中120℃干燥4 h，備用。取粉碎后的大黃粉末約2 mg 與KBr 粉末按1:100混合，在研缽中研磨，在10 t 的壓力下壓成薄片。

2.1.2 HPLC 供試品的制備

取大黃粉末（過四號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL 并稱重，水浴回流1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，0.45 μm 膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 大黃混合對照品的制備

精密稱定各對照品，分別置容量瓶中配制成母液；用移液管精密吸取上述各對照品母液適量，置于25 mL 容量瓶，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得含蘆薈大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷25.93 μg/mL、大黃酸-8-O-葡萄糖苷6.10 μg/mL、大黃酚-1-O-β-D-葡萄糖苷13.25 μg/mL、大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷33.26 μg/mL、蘆薈大黃素-3-（羥甲基）-O-β-D-葡萄糖苷16.24 μg/mL、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷7.97 μg/mL、大黃素甲醚-1-O-β-D 葡萄糖苷10.72 μg/mL、大黃素甲醚-8-O-β-D 葡萄糖苷7.13 μg/mL、蘆薈大黃素7.44 μg/mL、大黃酸6.06 μg/mL、大黃素7.55 μg/mL、大黃酚6.10 μg/mL 和大黃素甲醚4.87 μg/mL 的混合對照品溶液，備用。

2.2 紅外光譜條件

紅外光譜掃描范圍4000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，累計(jì)掃描16 次，掃描時(shí)去除水和CO2的干擾。每個(gè)樣品重復(fù)掃描3 次，用OMNIC 8.2 軟件得到每個(gè)樣品的平均光譜，對平均光譜進(jìn)行基線校正、13 點(diǎn)平滑、歸一化處理，對處理后的光譜進(jìn)行求導(dǎo)，得到二階導(dǎo)數(shù)光譜。

2.3 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱(15 0 mn×4.6 mm,5 μm)；流動相：A 為磷酸水（pH=3），B 為甲醇，梯度洗脫，0 min，B:20%，0～60 min，B:20%→90%，60-70 min，B：90%→100%；流速：1 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：5 μL。

3 結(jié)果

采用Spectrum Two 傅里葉變換紅外光譜儀和Agilent 1260 高效液相色譜儀測得大黃藥材紅外原始光譜和HPLC 指紋圖譜，用OMNIC 8.2 和中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2012 軟件處理，得到譜圖見圖1、圖2。

圖1 37 批大黃藥材原始紅外光譜圖Fig.1 Original IR spectra of 37 batches of Rhubarb

圖2 37 批大黃藥材HPLC 指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprint of 37 batches of Rhubarb

3.1 聚類分析

聚類分析又稱集群分析，現(xiàn)如今被廣泛應(yīng)用于中藥質(zhì)量控制和品種分類等方面[9]。本研究采用SPSS24.0 軟件分別對37 批大黃藥材的紅外指紋圖譜和液相指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，聚類方法選擇組間聯(lián)接法，區(qū)間選擇平方歐式距離，聚類結(jié)果見圖3、圖4。由圖3 可知，當(dāng)歐式距離為20時(shí)，37 批大黃藥材被聚為三大類，第一類包含3～6、11、15、16、20、22、30、32、35～37，該類包含了甘肅武都、禮縣和重慶產(chǎn)大黃藥材；第二類包含2 和8，該類產(chǎn)地分別是重慶和湖北；剩余聚為第三類，包含了甘肅禮縣、宕昌、四川和青海產(chǎn)大黃藥材。由圖4 可知，當(dāng)歐式距離為20 時(shí)，37 批大黃藥材同樣被聚為三大類，第一類包含了1、5～7、11、15、16、20、22、30、32、35～37，該類大黃產(chǎn)地分別是四川，甘肅武都、禮縣和宕昌；第二類包含了2～4、8，產(chǎn)地分別是重慶和湖北；剩余聚為第三類，產(chǎn)地分別是甘肅禮縣、宕昌和青海。對比兩種聚類方式可知，所有甘肅武都的大黃被聚為一類，甘肅禮縣和宕昌的大黃基本聚為一類，其他產(chǎn)地大黃為一類，兩種聚類方式所得結(jié)果基本一致，但存在少數(shù)產(chǎn)地相互交叉的情況。

圖3 37 批大黃藥材紅外數(shù)據(jù)聚類分析圖Fig.3 Infrared data cluster analysis diagram of 37 batches of Rhubarb

圖4 37 批大黃藥材HPLC 數(shù)據(jù)聚類分析圖Fig.4 Cluster analysis of HPLC data of 37 batches of Rhubarb

3.2 大黃藥材原始紅外光譜分析

由聚類分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，部分產(chǎn)地大黃藥材聚類結(jié)果存在相互交叉的情況，現(xiàn)從各產(chǎn)地選擇一批具有代表性的大黃樣品，結(jié)合掌葉大黃和藥用大黃對照藥材進(jìn)一步分析，所得原始紅外光譜見圖5。通過圖譜可知，大黃在3413、2930、1627、1448、1374、1317、1051、780、518 cm-1附近有吸收峰存在。其中3413 cm-1附近為羥基的伸縮振動吸收峰；2930 cm-1為亞甲基的反對稱伸縮振動吸收峰；1627 cm-1為羰基伸縮振動吸收峰；1448 cm-1附近可能包含多種成分，如芳香環(huán)骨架伸縮振動、C-H 彎曲振動以及（O）C-O 伸縮振動；1373 cm-1為C-H 彎曲振動吸收峰；1051 cm-1附近是多個(gè)吸收峰重疊產(chǎn)生的寬強(qiáng)峰，主要是多糖和苷類物質(zhì)的C-OH 彎曲振動產(chǎn)生。1317、780、518cm-1一系列主要為草酸鈣的吸收峰。大黃中含較多蒽醌類物質(zhì)，多羥基蒽醌中的羥基會與羰基發(fā)生氫鍵螯合，致使羰基的伸縮振動吸收峰向低波數(shù)一端移動，并同芳香環(huán)骨架振動吸收峰合并，還包含了草酸鈣的吸收峰，最終形成1627 cm-1附近的強(qiáng)吸收峰.

由掌葉大黃與藥用大黃對照藥材紅外譜圖比較（見圖5）可知，掌葉大黃在1317、780、518 cm-1處的吸收峰要強(qiáng)于藥用大黃，且峰形更加尖銳。藥用大黃在1516、1241 cm-1處存在的吸收峰，而在掌葉大黃光譜中并無顯現(xiàn)。這些特征峰差異能夠?qū)⒄迫~大黃與藥用大黃進(jìn)行區(qū)別。通過對圖5 中各產(chǎn)地大黃藥材的紅外圖譜比較，甘肅禮縣、宕昌、武都和青海的大黃藥材在1317、780、518 cm-1附近有明顯的吸收峰，而湖北、重慶和四川產(chǎn)地并不明顯。湖北、重慶和四川產(chǎn)地大黃藥材圖譜在1516、1241 cm-1附近存在的吸收峰，而甘肅禮縣、宕昌、武都和青海產(chǎn)地大黃藥材的圖譜中并不存在。

圖5 7 批不同產(chǎn)地大黃藥材紅外光譜Fig.5 IR spectra of 7 batches of Rhubarb from different origins

以掌葉大黃對照藥材作為參照，用OMNIC 軟件計(jì)算各產(chǎn)地大黃藥材與掌葉大黃對照藥材的相關(guān)系數(shù)，甘肅禮縣、宕昌、武都，青海、湖北、重慶和四川等地分別為：0.9748、0.9669、0.9282，0.9582、0.8211、0.8413 和0.8818；以藥用大黃對照藥材作為參照，計(jì)算出相關(guān)系數(shù)分別為：0.9199、0.9126、0.8823、0.8605，0.9392、0.9383、0.9419。由此可知甘肅禮縣、宕昌、武都和青海產(chǎn)的大黃與掌葉大黃對照藥材更加接近，湖北、重慶和四川產(chǎn)的大黃與藥用大黃對照藥材更加接近。

通過對四川、重慶、湖北、青海，甘肅禮縣、宕昌、武都等地大黃藥材紅外光譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)四川、重慶、湖北三地大黃藥材紅外光譜在1516、1241 cm-1附近均存在吸收峰，由此可知該產(chǎn)地大黃品種為藥用大黃。而青海，甘肅禮縣、宕昌、武都等地大黃藥材紅外光譜在1317、780、518 cm-1附近有明顯的吸收峰，由此可知該產(chǎn)地大黃品種為掌葉大黃（見圖6、7、8、9）。因此，通過各產(chǎn)地大黃藥材原始紅外光譜以及藥材光譜與對照藥材的相關(guān)系數(shù)分析，能將甘肅禮縣、宕昌、武都，青海、湖北、重慶和四川等地大黃品種進(jìn)行區(qū)分。

圖6 四川、重慶、湖北、青海大黃藥材紅外光譜Fig.6 IR spectra of Rhubarb from Sichuan,Chongqing,Hubei and Qinghai

圖7 禮縣大黃藥材紅外光譜Fig.7 IR spectra of Rhubarb from Lixian

圖8 宕昌大黃藥材紅外光譜Fig.8 IR spectra of Rhubarb from Dangchang

圖9 武都大黃藥材紅外光譜Fig.9 IR spectra of Rhubarb from Wudu

3.3 大黃藥材IR 二階導(dǎo)數(shù)光譜分析

紅外原始光譜雖能區(qū)分大黃的品種類型，但主要特征峰峰形、峰位相似，若想對其進(jìn)一步分析，需要對原始光譜圖進(jìn)行導(dǎo)數(shù)處理。二階導(dǎo)數(shù)光譜是對原始光譜進(jìn)行二次微分后而得到的吸光度與波數(shù)關(guān)系的變化率曲線，它能夠分辨原始光譜中的重疊峰，突出譜圖的特征性，增強(qiáng)譜圖的差異性。

由圖10 可見，在1250～1200 cm-1波段，除甘肅禮縣外其他三個(gè)地區(qū)的大黃藥材均在1240、1207 cm-1兩處有吸收峰，可鑒別出甘肅禮縣大黃。甘肅武都大黃在1011 cm-1處存在一個(gè)較強(qiáng)吸收峰，而其他產(chǎn)地并未出現(xiàn)，可將甘肅武都與其他產(chǎn)地區(qū)分出來。由圖11 可見，在700～600 cm-1波段，青海產(chǎn)大黃在679、617 cm-1存在兩個(gè)吸收峰，并且在407 cm-1處存在吸收峰，而甘肅宕昌大黃在這些波數(shù)處并無吸收峰，可將甘肅宕昌與青海大黃區(qū)分開來。

圖10 4 批大黃藥材二階導(dǎo)數(shù)圖譜（1800～1000cm-1）Fig.10 Second derivative spectra of 4 batches of Rhubarb

圖11 4 批大黃藥材二階導(dǎo)數(shù)圖譜（1000～400cm-1）Fig.11 Second derivative spectra of 4 batches of Rhubarb

由圖12 可見，在1600～1500 cm-1波段，四川產(chǎn)大黃在1557、1530、1512 cm-1有三處吸收峰，其他兩地大黃只有兩處吸收峰，由此可將四川產(chǎn)大黃鑒別出來。在1100～900 cm-1波段，湖北產(chǎn)大黃的所有吸收峰均強(qiáng)于其他兩地；在800～750 cm-1波段，重慶產(chǎn)大黃存在765 cm-1一處吸收峰，而湖北產(chǎn)大黃卻分為778、755 cm-1兩處吸收峰，這能夠?qū)⒑迸c重慶產(chǎn)大黃區(qū)分開來。

圖12 3 批大黃藥材二階導(dǎo)數(shù)圖譜（1800～400 cm-1）Fig.12 Second derivative spectra of 3 batches of Rhubarb

3.4 HPLC 指紋圖譜分析

使用中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2012軟件對七批不同產(chǎn)地大黃進(jìn)行相似度分析（圖13），以掌葉大黃對照藥材作為標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，甘肅禮縣、宕昌、武都和青海四地產(chǎn)大黃與對照藥材相似度較高（見表2）；以藥用大黃對照藥材作為標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，湖北、重慶和四川三地產(chǎn)大黃對照藥材相似度較高（見表3）。由此可判斷甘肅禮縣、宕昌、武都和青海四地產(chǎn)大黃為掌葉大黃，而湖北、重慶和四川三地產(chǎn)大黃為藥用大黃，這與紅外分析結(jié)果相一致。

圖13 不同產(chǎn)地大黃藥材HPLC 指紋圖譜Fig.13 HPLC Fingerprint of Rhubarb from different origins

表2 不同產(chǎn)地大黃藥材與掌葉大黃對照藥材HPLC 指紋圖譜相似度計(jì)算Table 2 HPLC fingerprint similarity calculation results of Rheum palmatum L.and rhubarb from different habitats

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表3 不同產(chǎn)地大黃藥材與藥用大黃對照藥材HPLC指紋圖譜相似度計(jì)算Table 3 HPLC fingerprint similarity calculation results of Rheum officinale Baill.and rhubarb from different habitats

4 討論與結(jié)論

根據(jù)聚類分析結(jié)果可知，當(dāng)歐式距離為20 時(shí)，所有大黃藥材大致可分為三類，兩種分析方法聚類結(jié)果基本一致，但還是存在一定差異。分析原因，HPLC 指紋圖譜僅顯示在特定波長下存在紫外吸收的化合物[10～11]，不能反映出大黃藥材中的全部物質(zhì)，聚類時(shí)使用指紋圖譜中的共有峰進(jìn)行聚類分析；而紅外光譜能夠反映出大黃藥材中的全部物質(zhì)，不僅包含HPLC 指紋圖譜中所顯示的化合物，還包含草酸鈣類無機(jī)物，聚類時(shí)使用每個(gè)紅外光譜中全波段對應(yīng)的吸光度進(jìn)行聚類分析。

經(jīng)過對原始紅外光譜、二階導(dǎo)數(shù)光譜的分析，結(jié)果表明：（1）原始紅外光譜只能將不同產(chǎn)地大黃藥材的品種進(jìn)行區(qū)分，而無法區(qū)分其產(chǎn)地。（2）二階導(dǎo)數(shù)光譜能夠?qū)⒉煌a(chǎn)地的大黃藥材完全鑒別出來，在1600～1500、1250～1200、1011、1100～900、800～750、700～600、407 cm-1附近的特征峰位置、強(qiáng)度和形態(tài)上均存在明顯差異，由此可將不同產(chǎn)地的大黃藥材區(qū)分開來。不同產(chǎn)地大黃HPLC 指紋圖譜相似度分析結(jié)果顯示，甘肅禮縣、宕昌、武都，青海等地產(chǎn)大黃與掌葉大黃對照藥材相似度較高，湖北、重慶、四川等地產(chǎn)大黃與藥用大黃對照藥材相似度較高。由這一結(jié)果可推斷出各產(chǎn)地大黃藥材的品種，但無法區(qū)分其產(chǎn)地。

FT-IR 能夠在譜圖中反映出大黃藥材的所有化學(xué)成分，經(jīng)過處理后能夠放大其特征，達(dá)到區(qū)分不同產(chǎn)地的目的。但正是由于這種整體性，使得難以從紅外光譜中得到每一化學(xué)成分的準(zhǔn)確含量。而HPLC 無法反映出大黃藥材中的全部成分，但通過色譜峰能夠得到所對應(yīng)化合物的準(zhǔn)確含量。因此，在進(jìn)行含量測定時(shí)，HPLC 具有其優(yōu)勢[12]，但對于不同產(chǎn)地大黃藥材的區(qū)分，F(xiàn)T-IR 簡便、迅速，在全面快速大黃藥材方面有其獨(dú)特的優(yōu)勢。