何苗 程琳 李丹宇 吳喜成 谷普慶鄭歆周黎明△

（1. 四川大學(xué)華西基礎(chǔ)與法醫(yī)學(xué)院藥理教研室 四川 成都 610041；2. 沈陽(yáng)同聯(lián)集團(tuán)有限公司 遼寧 沈陽(yáng) 110042）

可利霉素（Carrimycin，商品名必特）是中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所與沈陽(yáng)同聯(lián)集團(tuán)有限公司共同開(kāi)發(fā)的國(guó)家一類(lèi)新藥，于2019年6月獲批上市?？衫顾厥歉鶕?jù)細(xì)菌耐藥特點(diǎn)進(jìn)行設(shè)計(jì)，通過(guò)導(dǎo)入外源基因進(jìn)行催化形成異戊?；鶄?cè)鏈的生物合成藥物。是多組分小分子化合物的混合物。其主要成分包括異戊酰螺旋霉素Ⅲ、異戊酰螺旋霉素Ⅱ、異戊酰螺旋霉素Ⅰ三個(gè)主要成分（見(jiàn)圖1）及一定量的丁酰、丙酰、乙酰螺旋霉素Ⅲ、丁酰、丙酰、乙酰螺旋霉素Ⅱ等9種成分組成的混合化學(xué)物[1]，其結(jié)構(gòu)屬于大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗菌藥物。可利霉素可阻斷50s 核糖體中肽酰轉(zhuǎn)移酶的活性來(lái)抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成，從而達(dá)到抑菌作用，并且可利霉素可結(jié)合過(guò)氧化物清除酶，誘導(dǎo)過(guò)氧化物破壞DNA等生物大分子，從而達(dá)到殺菌的作用。此外可利霉素在體內(nèi)還可促進(jìn)中性粒細(xì)胞遷移于炎癥部位，破壞并吞噬細(xì)菌及受損細(xì)胞，還可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬作用，從而增強(qiáng)機(jī)體抗感染作用。藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究證實(shí)[2-3]它比螺旋霉素體內(nèi)半衰期更長(zhǎng)，部分代謝產(chǎn)物仍然保持抗菌活性；組織滲透性增強(qiáng)，還具有明顯的抗生素后效應(yīng)。但是前期研究表明可利霉素體內(nèi)抗菌作用較強(qiáng)，但是體外抗菌作用對(duì)有些細(xì)菌有效，而對(duì)有些細(xì)菌作用較弱，本研究的目的是進(jìn)一步明確可利霉素對(duì)臨床分離鮑曼不動(dòng)桿菌和部分耐藥菌的體內(nèi)外的抗菌作用。

圖1 可利霉素的主要成分結(jié)構(gòu)示意圖

1 實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

藥品：可利霉素，由上海同程制藥公司提供，批號(hào)：CA1601015R； 臨床分離株：臨床分離鮑曼不動(dòng)桿菌200株，耐喹諾酮大腸埃希菌、耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌、耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌、耐碳青霉烯銅綠假單胞菌、耐甲氧西林的葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,，MRSA）各1株。菌種來(lái)源：菌株均為2016年6 月至2019年4月在四川成都地區(qū)收集的臨床分離致病菌。在收集單位經(jīng)VITEK-60自動(dòng)微生物鑒定儀鑒定。每株細(xì)菌在實(shí)驗(yàn)前經(jīng)瓊脂平板劃單菌落分純，37℃隔夜新鮮培養(yǎng)的菌體適當(dāng)稀釋用于實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物：昆明小鼠，雌雄各半，體重18-22 g，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（SPF級(jí)）。飼養(yǎng)條件：25℃，濕度60%。飼養(yǎng)條件為SPF級(jí)，研究過(guò)程遵從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)管理和使用指南。小鼠由成都達(dá)碩生物科技有限公司提供，生產(chǎn)設(shè)施許可證：SCXK（川）2008-24。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 體外細(xì)菌MIC測(cè)定[4，5]

將平皿上的單個(gè)細(xì)菌接種至液體培養(yǎng)基，24 h后，吸取適量該菌液用麥?zhǔn)媳葷峁軠y(cè)定濃度，調(diào)整濃度至2×107CFU?mL-1，作為工作菌液，此菌液盡量在15 min內(nèi)接種完畢。配制藥物：取可利霉素0.0205g，加無(wú)水乙醇和吐溫80各600 μL，加入LB培養(yǎng)基2.8 mL，得5.12 mg?mL-1藥物原液。其它藥物根據(jù)預(yù)試驗(yàn)取不同濃度對(duì)倍稀釋。細(xì)菌接種：1-13號(hào)管為含藥培養(yǎng)基，每管的接種菌液量為5μL，故最終每管中約含接種菌量105 CFU?mL-1，第14、15號(hào)離心管內(nèi)只加入LB培養(yǎng)基2 mL，第14號(hào)離心管為不含藥物的空白對(duì)照。第15號(hào)離心管為不含藥物和細(xì)菌的純培養(yǎng)基對(duì)照管。所有培養(yǎng)管置恒溫箱中于35-37℃培養(yǎng)18 h后觀(guān)察結(jié)果。以不生長(zhǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)管為該細(xì)菌的最低抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）。實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果判讀參考美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究協(xié)會(huì)(Clinical and laboratory standards institute, CLSI) M100-S25標(biāo)準(zhǔn)。藥物濃度小于2--8 mg?mL-1，大于16--32 mg?mL-1為耐藥。

1.2.2 體內(nèi)ED50測(cè)定[4]

預(yù)試實(shí)驗(yàn)，找出引起小鼠100% 死亡的最低菌量：將平皿上的細(xì)菌接種至液體培養(yǎng)基，小鼠分為若干組，每組5只，雌雄兼用菌液稀釋至不同濃度，腹腔注射，每只0.5 mL觀(guān)察7 d，記錄死亡數(shù)。用1倍最大致死量（Maximum lethal dose，MLD）菌量感染小鼠1 h后，不同濃度藥物灌胃，給藥體積0.2 mL?(10g)-1，觀(guān)察24 h，記錄死亡數(shù)。正式實(shí)驗(yàn)：設(shè)計(jì)體內(nèi)治療保護(hù)實(shí)驗(yàn)的給藥劑量，小鼠分為若干組，每組10只，雌雄兼用。用1 MLD菌量感染小鼠1 h后，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的藥物劑量，以1:0.7或1:0.8的濃度間距設(shè)置組別，給藥體積0.2 mL?(10g)-1；觀(guān)察14天，記錄小鼠死亡數(shù)。根據(jù)DAS ver1.0軟件BLIESS法計(jì)算ED50值。

2 結(jié)果

2.1 可利霉素對(duì)臨床分離200株鮑曼不動(dòng)桿菌的MIC

可利霉素在體外對(duì)臨床分離的200株鮑曼不動(dòng)桿菌的MIC值很高，根據(jù)判斷原則，為不敏感，見(jiàn)表1。

表1 可利霉素對(duì)臨床分離200株鮑曼不動(dòng)桿菌的MIC值

2.2 可利霉素對(duì)臨床分離耐藥菌的MIC

臨床分離的耐藥菌，包括耐喹諾酮大腸埃希菌、耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌、耐碳青霉烯銅綠假單胞菌、耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌、耐甲氧西林的金色葡萄球菌對(duì)可利霉素的均不敏感，見(jiàn)表2。

表2 可利霉素對(duì)臨床分離耐藥菌的MIC值

2.3 可利霉素作用于小鼠的ED50

在體內(nèi)對(duì)耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌ED50為112.2 mg?kg-1；對(duì)耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌的ED50為153.2 mg?kg-1；初步認(rèn)為可利霉素對(duì)耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌在體內(nèi)有一定的抗菌作用，見(jiàn)表3。

表3 可利霉素對(duì)各耐藥菌的ED50結(jié)果

3 討論

可利霉素首次獲批適應(yīng)癥：①下呼吸道感染：流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌引起的急性氣管-支氣管炎；②上呼吸道感染：由肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、化膿性鏈球菌、卡他莫拉菌以及葡萄球菌引起的急性鼻竇炎。但在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)在體外，可利霉素對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌不敏感，但在體內(nèi)對(duì)耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌有較好的作用（ED50較低）。鮑曼不動(dòng)桿菌[6]屬于非苛養(yǎng)菌，生存能力較強(qiáng)，在臨床各類(lèi)標(biāo)本和醫(yī)院環(huán)境中檢出率很高，容易引起院內(nèi)感染且迅速通過(guò)污染的器械和醫(yī)務(wù)人員手等媒介進(jìn)行傳播，甚至引起院內(nèi)感染暴發(fā)。

近年來(lái)經(jīng)過(guò)抗菌藥物專(zhuān)項(xiàng)整治，抗菌藥物合理應(yīng)用得到逐步改善，但碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物使用量持續(xù)增加，耐碳青霉烯類(lèi)鮑曼不動(dòng)桿菌檢出率增加，2017年CHINET顯示檢出率達(dá)到接近70%[7]。

耐碳青霉烯類(lèi)鮑曼不動(dòng)桿菌常在危重患者中檢出，極易在患有嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病、年老、抵抗力低下住院患者的呼吸道、燒傷創(chuàng)面、皮膚、口腔及泌尿道等部位定植，可引起包括呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、血流系統(tǒng)等幾乎所有系統(tǒng)的感染，死亡率可以達(dá)到50%以上[8]。

耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)常用抗菌藥物的敏感率均＜30%，僅對(duì)多粘菌素和替加環(huán)素較為敏感，為此，尋找對(duì)泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌有效的抗菌藥物有十分重要的臨床意義。盡管我們的研究還未找到可利霉素在體內(nèi)對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌有效，而在體外幾乎沒(méi)有作用的原因。我們相信，進(jìn)一步的研究，終將解決這一問(wèn)題。

近期的研究發(fā)現(xiàn)，可利霉素不僅對(duì)細(xì)菌有殺滅作用， Haiyan Yan等人[9]的研究認(rèn)為可利霉素對(duì)COVID－19的RNA復(fù)制有抑制作用，在對(duì)200個(gè)現(xiàn)有的臨床使用藥物進(jìn)行抗COVID－19體外篩選，發(fā)現(xiàn)可利霉素的抗冠狀病毒作用最強(qiáng)。劉少華等人報(bào)道，在2020年武漢新冠流行的時(shí)候，可利霉素單用或聯(lián)合抗病毒藥物治療的2例新冠肺炎患者的發(fā)熱、咳嗽、乏力等臨床不適癥狀明顯緩解，肺部CT顯示感染較前明顯改善，2次新型冠狀病毒RNA檢測(cè)轉(zhuǎn)陰，臨床治愈并順利出院。 Si-yuan Liang[10]報(bào)道，可利霉素能夠在體內(nèi)和體外抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌的生長(zhǎng)，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR and MAPK通路有關(guān)。

我們相信，隨著可利霉素的臨床使用和研究更加廣泛，可利霉素新的臨床適應(yīng)癥將會(huì)有更多的拓展。