周陽(yáng) 陳夢(mèng)夢(mèng) 鄒偉,2 張炳強(qiáng)△

（1. 青島瑞思德生物科技有限公司，山東 青島 266000；2. 遼寧省生物技術(shù)與分子藥物研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連116000）

干細(xì)胞是具有自我更新和分化潛能兩大特性的細(xì)胞，根據(jù)其分化潛能被分為全能干細(xì)胞、多能干細(xì)胞和單能干細(xì)胞[1]。胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞是兩種最常見(jiàn)的干細(xì)胞類型，但研究發(fā)現(xiàn)這兩類細(xì)胞存在致瘤性和低存活率等問(wèn)題，給臨床應(yīng)用帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)[2]。羊膜干細(xì)胞來(lái)源于胎盤，具有其他干細(xì)胞無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)，是再生醫(yī)學(xué)優(yōu)良的種子資源，近年來(lái)倍受關(guān)注。本文將著重介紹羊膜干細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制新的研究進(jìn)展。

1 羊膜及羊膜干細(xì)胞

羊膜是胎盤的一部分，它是一種透明、光滑、無(wú)血管的單層薄膜(約100μm)，由上皮和間充質(zhì)組成[3]。羊膜來(lái)源的干細(xì)胞（Amnion-derived Stem Cells，ADSCs）包括羊膜上皮細(xì)胞（Amnion Epithelial Cells，AECs）和羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞（Amnion Mesenchymal Stem Cells，AMSCs），見(jiàn)圖1。2005年，Miki 等人發(fā)表論文描述了AECs的干細(xì)胞特性：AECs在在體外有分化成內(nèi)胚層（肝、胰腺）、中胚層（心肌細(xì)胞）和外胚層（神經(jīng)細(xì)胞）三個(gè)胚層的潛力[4]。2007年第一屆胎盤來(lái)源干細(xì)胞的國(guó)際研討會(huì)明確指定AECs和AMSCs均為胎盤可獲取的干細(xì)胞[5]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs具有其他干細(xì)胞無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)，如可再生性、多分化潛能、無(wú)致瘤性/無(wú)免疫原性、無(wú)倫理或法律問(wèn)題以及其強(qiáng)大的旁分泌作用，尤其是免疫調(diào)節(jié)作用[6]。這些優(yōu)勢(shì)使羊膜來(lái)源的干細(xì)胞成為治療多種疾病的“種子細(xì)胞”[7-9]。

圖1 羊膜及羊膜干細(xì)胞示意圖

AECs和AMSCs表達(dá)胚胎干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的各種標(biāo)記，具有低免疫原性和無(wú)致瘤性。AMSCs特異性表達(dá)Nanog、Oc4和CD29等多種標(biāo)記，但不表達(dá)CD34和CD133[10]。同時(shí)，羊膜干細(xì)胞也能表達(dá)CD90、CD44、CD73 和 CD105 等經(jīng)典間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)標(biāo)記物，但缺乏 CD45、CD34、CD45、HLA-DR、CD80、CD86 等細(xì)胞表面標(biāo)記物，這提示二者具有特殊的免疫調(diào)節(jié)能力[5]。

近年來(lái)，多項(xiàng)臨床前研究表明，羊膜來(lái)源的干細(xì)胞對(duì)婦科疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腦損傷、肺病、肝病、腫瘤、皮膚病、骨病、心血管疾病、炎癥性腸病、腎病、糖尿病、自身免疫疾病等多種疾病具有潛在的治療效果[11]，見(jiàn)圖2。

圖2 人羊膜來(lái)源的干細(xì)胞對(duì)多種疾病具有潛在治療效果

2 羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用

眾所周知，組織損傷會(huì)引起一系列導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的分子和細(xì)胞事件發(fā)生。炎癥過(guò)程包括在胞外調(diào)節(jié)因子(細(xì)胞因子和趨化因子)的控制下招募免疫細(xì)胞到受損部位。被招募的免疫細(xì)胞有單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞，樹(shù)突狀細(xì)胞，T細(xì)胞和B細(xì)胞，見(jiàn)圖3。

圖3 組織損傷引起的免疫細(xì)胞招募

在損傷組織再生的過(guò)程中，炎癥作為一種重要的防御性反應(yīng)起著關(guān)鍵作用。消除炎癥是修復(fù)的必經(jīng)之路，持續(xù)的慢性炎癥會(huì)造成組織損傷過(guò)度，導(dǎo)致包括纖維化和自身免疫性疾病在內(nèi)的一系列癥狀。羊膜細(xì)胞及其衍生物可以通過(guò)作用于不同的炎癥介質(zhì)達(dá)到消炎的目的。

2.1 促進(jìn)多種細(xì)胞因子、趨化因子和抗炎細(xì)胞因子的分泌

細(xì)胞因子和趨化因子是炎癥的早期調(diào)節(jié)因子。它們由受損組織的細(xì)胞和隨后被招募到受損部位的免疫細(xì)胞產(chǎn)生，并提供分子信號(hào)來(lái)協(xié)調(diào)免疫細(xì)胞遷移，激發(fā)免疫細(xì)胞活化。細(xì)胞因子和趨化因子產(chǎn)生的減少會(huì)下調(diào)炎性細(xì)胞向炎癥部位的招募，從而抑制炎癥傳播。新近很多課題組報(bào)道了羊膜細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)CD3+的T淋巴細(xì)胞增殖抑制具有劑量依賴性[12]。

Bulati 等人研究發(fā)現(xiàn)hAMSCs的免疫調(diào)節(jié)作用依賴于以PDL-1/PD-1軸為基礎(chǔ)的細(xì)胞間接觸[13]。Cargnoni, A.等人研究發(fā)現(xiàn)，hAMSCs 和 hAESCs 可以明顯降低博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化鼠的促炎癥細(xì)胞因子水平，其中細(xì)胞/生長(zhǎng)因子包括單核細(xì)胞趨化蛋白-1 (Monocyte Chemotactic Protein 1，MCP-1)、腫瘤壞死因子-α ( Tumor Necrosis Factor，TNF-α)、白 介 素-1（Interleukin-1，IL-1）、干擾素-γ (Interferon-γ，IFNγ)、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）和促纖維化的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（Transforming Growth Factor -β，TGF-β）、血小板源性生長(zhǎng)因子-α（Platelet Derived Growth Factor-α，PDGF-α）和血小板源性生長(zhǎng)因子-β（Platelet Derived Growth Factor-β，PDGF-β）等[14,15]。

羊膜細(xì)胞可以通過(guò)調(diào)整免疫調(diào)節(jié)因子（如抗炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-10, Interleukin-10，IL-10）的產(chǎn)生來(lái)促進(jìn)炎癥過(guò)程分解，這種免疫調(diào)節(jié)因子可減輕炎癥反應(yīng)，并在重建組織完整性中發(fā)揮重要作用。據(jù)報(bào)道，在四氯化碳(Tetrachloromethane，CCl4)誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠的肝臟中注入hAEC后，IL-10的基因表達(dá)增加[16]。

此外，研究表明，用羊水細(xì)胞輸注膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的小鼠，引流的淋巴細(xì)胞分泌高水平的IL-10[17]。羊水細(xì)胞產(chǎn)生的其他具有免疫調(diào)節(jié)活性或已被認(rèn)為可促進(jìn)正常器官功能恢復(fù)的因子包括前列腺素E2（Prostaglandin E2，PGE2）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Hepatocyte Growth Factor，HGF）、雙加氧酶（Dioxygenase, IDO）、人類白細(xì)胞抗原（Human Leucocyte Antigen，HLA-G）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（Transforming Growth Factor -β，TGF-β 1）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2（Transforming Growth Factor -β，TGF-β2）以及血小板源性生長(zhǎng)因子（Platelet Derived Growth Factor，PDGF）[12,18,19]。其中PGE2、HGF、IDO活性和HLA-G被認(rèn)為是介導(dǎo)或至少參與了羊水細(xì)胞的免疫抑制活性。

2.2 抑制非特異性免疫細(xì)胞招募和遷移

通常炎癥發(fā)生時(shí)，中性粒細(xì)胞第一個(gè)到達(dá)修復(fù)部位，在檢測(cè)和清除損傷細(xì)胞方面起著至關(guān)重要的作用。隨后，中性粒細(xì)胞停止內(nèi)流和激活，這對(duì)消炎具有積極作用，因?yàn)橹行粤＜?xì)胞釋放的氧化劑和蛋白酶可能會(huì)導(dǎo)致宿主組織損傷和長(zhǎng)期炎癥。研究表明，hAEC干預(yù)能顯著減少中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)到肺[20]。有文獻(xiàn)報(bào)道，用膠原誘導(dǎo)小鼠關(guān)節(jié)炎，hAMSC治療后小鼠的關(guān)節(jié)內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)減少[17]，另外在博萊霉素誘導(dǎo)肺損傷小鼠的肺中也有同樣報(bào)道[21]。由于凋亡的中性粒細(xì)胞會(huì)釋放含有膜聯(lián)蛋白1的微粒，這是一種對(duì)中性粒細(xì)胞具有抗遷移作用的蛋白[22]，所以加速中性粒細(xì)胞凋亡也可以作為一種正反饋回路，進(jìn)一步抑制中性粒細(xì)胞的遷移和募集。

繼中性粒細(xì)胞后，抗原呈遞細(xì)胞( Antigen-Presenting Cell, APCs)（如巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和來(lái)適應(yīng)性免疫反應(yīng)中的淋巴細(xì)胞）也被招募到損傷部位，并參與炎癥反應(yīng)。有證據(jù)表明，羊膜細(xì)胞可以阻礙這些免疫細(xì)胞的募集、成熟和增殖。將hAECs移植到多發(fā)性硬化癥（Multiple Sclerosis, MS）模型小鼠中可以減少中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的單核/巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞浸潤(rùn)，從而減緩臨床疾病的進(jìn)程[18]。用脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）誘導(dǎo)胎羊損傷后，向其大腦注入hAEC，發(fā)現(xiàn)炎性小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞減少[23]。體外證據(jù)表明，羊膜細(xì)胞可以直接作用于單核細(xì)胞和APCs。例如，hAECs、hAMSCs及其條件培養(yǎng)基可阻止單核細(xì)胞向樹(shù)突狀細(xì)胞的分化和成熟[24-26]。

2.3 誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞生成，抑制T淋巴細(xì)胞的激活和增殖

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在炎癥的解決中發(fā)揮著重要的作用。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是FOXP3基因表達(dá)的CD4+ CD25+ T淋巴細(xì)胞的一個(gè)亞群，通過(guò)分泌免疫抑制和促進(jìn)分解的細(xì)胞因子如IL-10和TGF-β來(lái)調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答[27]。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、結(jié)腸炎和移植物抗宿主病等不同炎癥性疾病的臨床前研究中，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表現(xiàn)出有益作用[28-30]。羊膜細(xì)胞的一個(gè)顯著特性是它們?cè)隗w內(nèi)和體外都能誘導(dǎo)產(chǎn)生調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。在膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠模型中，hAMSC治療顯著增加了抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的生成，這些調(diào)節(jié)性T細(xì)胞具有免疫抑制功能，能夠阻止關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展[17]。也有報(bào)道稱，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在hAEC介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化和隨后博萊霉素誘導(dǎo)的肺損傷的減弱中是必需的[31]。

T淋巴細(xì)胞是在細(xì)胞免疫中發(fā)揮主要作用的淋巴細(xì)胞，根據(jù)其表面抗原CD4、CD8等的表達(dá)的不同，分為CD4+ T淋巴細(xì)胞和CD8+ T淋巴細(xì)胞。大量文獻(xiàn)表明，無(wú)論在體內(nèi)還是體外，羊膜細(xì)胞及其衍生物在抑制T細(xì)胞增殖和活化中起著重要作用。眾所周知，在體外hAECs，hAMSC和羊膜細(xì)胞群能夠抑制由多種刺激物誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖[19,32,33]。研究表明，來(lái)自hAMSCs和hAECs的條件培養(yǎng)基能夠發(fā)揮與hAMSCs和hAECs相似的作用，抑制活化的T淋巴細(xì)胞增殖[34,35]。Bulati 等人觀察到 INF-γ誘導(dǎo)的 hAMSC 免疫調(diào)節(jié)作用依賴于活化的淋巴細(xì)胞、細(xì)胞間接觸和可溶性因子[13]。

Rossi 等人表明 hAMSCs 釋放的前列腺素也與淋巴細(xì)胞的抗增殖作用有關(guān)[12]。 Meesuk等人發(fā)現(xiàn)， AMSCs和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在與活化T細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)表現(xiàn)出相當(dāng)程度的免疫抑制作用，AMSCs分泌的吲哚胺2,3-雙加氧酶（IDO）與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有相同的免疫抑制活性[36]。Morandi等人發(fā)現(xiàn) HLA-G和HLA-E 分子參與了 hAESCs 介導(dǎo)的 T 細(xì)胞增殖抑制[37]。 此外，hADSCs 對(duì)炎癥過(guò)程也有免疫調(diào)節(jié)和免疫抑制作用，包括降低炎癥細(xì)胞的活性，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的遷移和免疫細(xì)胞向損傷部位的募集[7,8]。 ADSCs 還表現(xiàn)出血管生成、細(xì)胞保護(hù)、抗瘢痕和抗菌性能[38]。

2.4 促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化

一般來(lái)說(shuō)，極化的巨噬細(xì)胞通常稱為M1和M2，對(duì)應(yīng)巨噬細(xì)胞的兩種主要的、相反的活動(dòng)。M1巨噬細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子、趨化因子和活性氧來(lái)消除損傷啟動(dòng)因子，從而協(xié)調(diào)炎癥階段。隨后，M2巨噬細(xì)胞促進(jìn)從炎癥期到組織修復(fù)期的進(jìn)展，恢復(fù)受損的組織結(jié)構(gòu)和完整性[39]。

有趣的是，不同的研究結(jié)果均表明巨噬細(xì)胞在羊膜細(xì)胞的下游免疫抑制作用中起關(guān)鍵作用，并最終改善治療效果。例如，Murphy等人證明，對(duì)于巨噬細(xì)胞功能受損的肺纖維化小鼠，hAECs不能發(fā)揮修復(fù)作用[20]。此外，在博萊霉素誘導(dǎo)的肺損傷實(shí)驗(yàn)中，hAEC干預(yù)使巨噬細(xì)胞向肺部的浸潤(rùn)顯著減少[20,21]。此外，未經(jīng)治療的患病動(dòng)物中浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞以M1為主，而hAECs處理的動(dòng)物主要巨噬細(xì)胞表型為M2[21,31]。此外，體外研究表明，在解決慢性炎癥后的纖維化過(guò)程中，巨噬細(xì)胞及其向M2型的轉(zhuǎn)換起到了重要的作用。事實(shí)上，有報(bào)道稱，在四氯化碳(Tetrachloromethane, CCl4)誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠中，hAECs移植可減少傷口愈合M2巨噬細(xì)胞表型誘導(dǎo)形成的肝纖維化[16]。最近，實(shí)驗(yàn)證明在皮膚傷口愈合的小鼠模型中，皮下注射來(lái)自hAEC的條件培養(yǎng)基可以加速傷口愈合。同樣，條件培養(yǎng)基介導(dǎo)的組織修復(fù)與定居骨髓群體的調(diào)節(jié)有關(guān)，其特征是減少炎癥環(huán)境和M1巨噬細(xì)胞數(shù)量以及誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞[40]。研究證實(shí)，羊膜細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)作用。例如，有報(bào)道稱，在體外單核細(xì)胞分化為DC或M1巨噬細(xì)胞時(shí)，即使在沒(méi)有任何分化/極化刺激的情況下，hAMSCs也會(huì)使單核細(xì)胞向抗炎M2巨噬細(xì)胞分化[24,40,41]。在hAMSCs或其條件培養(yǎng)基存在下產(chǎn)生的巨噬細(xì)胞，抗炎細(xì)胞因子IL-10的產(chǎn)生增加，不同促炎因子的分泌減少。這些細(xì)胞可誘導(dǎo)具有潛在抑制活性的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞[40]。

3 問(wèn)題與展望

雖然羊膜細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)上表現(xiàn)出非常好的修復(fù)能力，但是目前的研究還處于比較初期的階段，大多數(shù)研究還集中在動(dòng)物模型中，臨床試驗(yàn)較少。目前的研究?jī)H能表明羊膜細(xì)胞在動(dòng)物模型和少數(shù)患者上是安全有效的，大規(guī)模的臨床試驗(yàn)還沒(méi)有開(kāi)展，因此該治療方法是否具有普適性還需要大量的臨床工作支撐。另外，羊膜細(xì)胞的制備、質(zhì)控體系的構(gòu)建、臨床級(jí)細(xì)胞或衍生物的劑量標(biāo)準(zhǔn)等一系列制度尚未確立，故臨床效果可重復(fù)性差，不適合大規(guī)模進(jìn)行研究。綜上所述，羊膜干細(xì)胞應(yīng)用于臨床還有很多工作要做。本研究所致力于羊膜干細(xì)胞的制備、質(zhì)控體系構(gòu)建等工藝標(biāo)準(zhǔn)化，希望從制劑標(biāo)準(zhǔn)方面為羊膜干細(xì)胞的臨床應(yīng)用做出貢獻(xiàn)。