周陽 陳夢夢 鄒偉,2 張炳強△

（1. 青島瑞思德生物科技有限公司，山東 青島 266000；2. 遼寧省生物技術(shù)與分子藥物研發(fā)重點實驗室，遼寧 大連116000）

干細胞是具有自我更新和分化潛能兩大特性的細胞，根據(jù)其分化潛能被分為全能干細胞、多能干細胞和單能干細胞[1]。胚胎干細胞和誘導多能干細胞是兩種最常見的干細胞類型，但研究發(fā)現(xiàn)這兩類細胞存在致瘤性和低存活率等問題，給臨床應用帶來了巨大挑戰(zhàn)[2]。羊膜干細胞來源于胎盤，具有其他干細胞無法比擬的優(yōu)勢，是再生醫(yī)學優(yōu)良的種子資源，近年來倍受關(guān)注。本文將著重介紹羊膜干細胞免疫調(diào)節(jié)的機制新的研究進展。

1 羊膜及羊膜干細胞

羊膜是胎盤的一部分，它是一種透明、光滑、無血管的單層薄膜(約100μm)，由上皮和間充質(zhì)組成[3]。羊膜來源的干細胞（Amnion-derived Stem Cells，ADSCs）包括羊膜上皮細胞（Amnion Epithelial Cells，AECs）和羊膜間充質(zhì)干細胞（Amnion Mesenchymal Stem Cells，AMSCs），見圖1。2005年，Miki 等人發(fā)表論文描述了AECs的干細胞特性：AECs在在體外有分化成內(nèi)胚層（肝、胰腺）、中胚層（心肌細胞）和外胚層（神經(jīng)細胞）三個胚層的潛力[4]。2007年第一屆胎盤來源干細胞的國際研討會明確指定AECs和AMSCs均為胎盤可獲取的干細胞[5]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs具有其他干細胞無法比擬的優(yōu)勢，如可再生性、多分化潛能、無致瘤性/無免疫原性、無倫理或法律問題以及其強大的旁分泌作用，尤其是免疫調(diào)節(jié)作用[6]。這些優(yōu)勢使羊膜來源的干細胞成為治療多種疾病的“種子細胞”[7-9]。

圖1 羊膜及羊膜干細胞示意圖

AECs和AMSCs表達胚胎干細胞和間充質(zhì)干細胞的各種標記，具有低免疫原性和無致瘤性。AMSCs特異性表達Nanog、Oc4和CD29等多種標記，但不表達CD34和CD133[10]。同時，羊膜干細胞也能表達CD90、CD44、CD73 和 CD105 等經(jīng)典間充質(zhì)干細胞(MSCs)標記物，但缺乏 CD45、CD34、CD45、HLA-DR、CD80、CD86 等細胞表面標記物，這提示二者具有特殊的免疫調(diào)節(jié)能力[5]。

近年來，多項臨床前研究表明，羊膜來源的干細胞對婦科疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腦損傷、肺病、肝病、腫瘤、皮膚病、骨病、心血管疾病、炎癥性腸病、腎病、糖尿病、自身免疫疾病等多種疾病具有潛在的治療效果[11]，見圖2。

圖2 人羊膜來源的干細胞對多種疾病具有潛在治療效果

2 羊膜間充質(zhì)干細胞的免疫調(diào)節(jié)作用

眾所周知，組織損傷會引起一系列導致炎癥反應的分子和細胞事件發(fā)生。炎癥過程包括在胞外調(diào)節(jié)因子(細胞因子和趨化因子)的控制下招募免疫細胞到受損部位。被招募的免疫細胞有單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞，樹突狀細胞，T細胞和B細胞，見圖3。

圖3 組織損傷引起的免疫細胞招募

在損傷組織再生的過程中，炎癥作為一種重要的防御性反應起著關(guān)鍵作用。消除炎癥是修復的必經(jīng)之路，持續(xù)的慢性炎癥會造成組織損傷過度，導致包括纖維化和自身免疫性疾病在內(nèi)的一系列癥狀。羊膜細胞及其衍生物可以通過作用于不同的炎癥介質(zhì)達到消炎的目的。

2.1 促進多種細胞因子、趨化因子和抗炎細胞因子的分泌

細胞因子和趨化因子是炎癥的早期調(diào)節(jié)因子。它們由受損組織的細胞和隨后被招募到受損部位的免疫細胞產(chǎn)生，并提供分子信號來協(xié)調(diào)免疫細胞遷移，激發(fā)免疫細胞活化。細胞因子和趨化因子產(chǎn)生的減少會下調(diào)炎性細胞向炎癥部位的招募，從而抑制炎癥傳播。新近很多課題組報道了羊膜細胞條件培養(yǎng)基對CD3+的T淋巴細胞增殖抑制具有劑量依賴性[12]。

Bulati 等人研究發(fā)現(xiàn)hAMSCs的免疫調(diào)節(jié)作用依賴于以PDL-1/PD-1軸為基礎(chǔ)的細胞間接觸[13]。Cargnoni, A.等人研究發(fā)現(xiàn)，hAMSCs 和 hAESCs 可以明顯降低博來霉素誘導的肺纖維化鼠的促炎癥細胞因子水平，其中細胞/生長因子包括單核細胞趨化蛋白-1 (Monocyte Chemotactic Protein 1，MCP-1)、腫瘤壞死因子-α ( Tumor Necrosis Factor，TNF-α)、白 介 素-1（Interleukin-1，IL-1）、干擾素-γ (Interferon-γ，IFNγ)、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）和促纖維化的轉(zhuǎn)化生長因子β（Transforming Growth Factor -β，TGF-β）、血小板源性生長因子-α（Platelet Derived Growth Factor-α，PDGF-α）和血小板源性生長因子-β（Platelet Derived Growth Factor-β，PDGF-β）等[14,15]。

羊膜細胞可以通過調(diào)整免疫調(diào)節(jié)因子（如抗炎細胞因子白細胞介素-10, Interleukin-10，IL-10）的產(chǎn)生來促進炎癥過程分解，這種免疫調(diào)節(jié)因子可減輕炎癥反應，并在重建組織完整性中發(fā)揮重要作用。據(jù)報道，在四氯化碳(Tetrachloromethane，CCl4)誘導的肝纖維化小鼠的肝臟中注入hAEC后，IL-10的基因表達增加[16]。

此外，研究表明，用羊水細胞輸注膠原誘導關(guān)節(jié)炎的小鼠，引流的淋巴細胞分泌高水平的IL-10[17]。羊水細胞產(chǎn)生的其他具有免疫調(diào)節(jié)活性或已被認為可促進正常器官功能恢復的因子包括前列腺素E2（Prostaglandin E2，PGE2）、肝細胞生長因子（Hepatocyte Growth Factor，HGF）、雙加氧酶（Dioxygenase, IDO）、人類白細胞抗原（Human Leucocyte Antigen，HLA-G）、轉(zhuǎn)化生長因子β1（Transforming Growth Factor -β，TGF-β 1）和轉(zhuǎn)化生長因子β2（Transforming Growth Factor -β，TGF-β2）以及血小板源性生長因子（Platelet Derived Growth Factor，PDGF）[12,18,19]。其中PGE2、HGF、IDO活性和HLA-G被認為是介導或至少參與了羊水細胞的免疫抑制活性。

2.2 抑制非特異性免疫細胞招募和遷移

通常炎癥發(fā)生時，中性粒細胞第一個到達修復部位，在檢測和清除損傷細胞方面起著至關(guān)重要的作用。隨后，中性粒細胞停止內(nèi)流和激活，這對消炎具有積極作用，因為中性粒細胞釋放的氧化劑和蛋白酶可能會導致宿主組織損傷和長期炎癥。研究表明，hAEC干預能顯著減少中性粒細胞浸潤到肺[20]。有文獻報道，用膠原誘導小鼠關(guān)節(jié)炎，hAMSC治療后小鼠的關(guān)節(jié)內(nèi)中性粒細胞浸潤減少[17]，另外在博萊霉素誘導肺損傷小鼠的肺中也有同樣報道[21]。由于凋亡的中性粒細胞會釋放含有膜聯(lián)蛋白1的微粒，這是一種對中性粒細胞具有抗遷移作用的蛋白[22]，所以加速中性粒細胞凋亡也可以作為一種正反饋回路，進一步抑制中性粒細胞的遷移和募集。

繼中性粒細胞后，抗原呈遞細胞( Antigen-Presenting Cell, APCs)（如巨噬細胞、樹突狀細胞和來適應性免疫反應中的淋巴細胞）也被招募到損傷部位，并參與炎癥反應。有證據(jù)表明，羊膜細胞可以阻礙這些免疫細胞的募集、成熟和增殖。將hAECs移植到多發(fā)性硬化癥（Multiple Sclerosis, MS）模型小鼠中可以減少中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的單核/巨噬細胞和T細胞浸潤，從而減緩臨床疾病的進程[18]。用脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）誘導胎羊損傷后，向其大腦注入hAEC，發(fā)現(xiàn)炎性小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞減少[23]。體外證據(jù)表明，羊膜細胞可以直接作用于單核細胞和APCs。例如，hAECs、hAMSCs及其條件培養(yǎng)基可阻止單核細胞向樹突狀細胞的分化和成熟[24-26]。

2.3 誘導調(diào)節(jié)性T細胞生成，抑制T淋巴細胞的激活和增殖

調(diào)節(jié)性T細胞在炎癥的解決中發(fā)揮著重要的作用。調(diào)節(jié)性T細胞是FOXP3基因表達的CD4+ CD25+ T淋巴細胞的一個亞群，通過分泌免疫抑制和促進分解的細胞因子如IL-10和TGF-β來調(diào)節(jié)免疫應答[27]。在類風濕關(guān)節(jié)炎、結(jié)腸炎和移植物抗宿主病等不同炎癥性疾病的臨床前研究中，調(diào)節(jié)性T細胞表現(xiàn)出有益作用[28-30]。羊膜細胞的一個顯著特性是它們在體內(nèi)和體外都能誘導產(chǎn)生調(diào)節(jié)性T細胞。在膠原誘導關(guān)節(jié)炎小鼠模型中，hAMSC治療顯著增加了抗原特異性調(diào)節(jié)性T細胞的生成，這些調(diào)節(jié)性T細胞具有免疫抑制功能，能夠阻止關(guān)節(jié)炎的進展[17]。也有報道稱，調(diào)節(jié)性T細胞在hAEC介導的巨噬細胞極化和隨后博萊霉素誘導的肺損傷的減弱中是必需的[31]。

T淋巴細胞是在細胞免疫中發(fā)揮主要作用的淋巴細胞，根據(jù)其表面抗原CD4、CD8等的表達的不同，分為CD4+ T淋巴細胞和CD8+ T淋巴細胞。大量文獻表明，無論在體內(nèi)還是體外，羊膜細胞及其衍生物在抑制T細胞增殖和活化中起著重要作用。眾所周知，在體外hAECs，hAMSC和羊膜細胞群能夠抑制由多種刺激物誘導的T淋巴細胞增殖[19,32,33]。研究表明，來自hAMSCs和hAECs的條件培養(yǎng)基能夠發(fā)揮與hAMSCs和hAECs相似的作用，抑制活化的T淋巴細胞增殖[34,35]。Bulati 等人觀察到 INF-γ誘導的 hAMSC 免疫調(diào)節(jié)作用依賴于活化的淋巴細胞、細胞間接觸和可溶性因子[13]。

Rossi 等人表明 hAMSCs 釋放的前列腺素也與淋巴細胞的抗增殖作用有關(guān)[12]。 Meesuk等人發(fā)現(xiàn)， AMSCs和骨髓間充質(zhì)干細胞在與活化T細胞共培養(yǎng)時表現(xiàn)出相當程度的免疫抑制作用，AMSCs分泌的吲哚胺2,3-雙加氧酶（IDO）與骨髓間充質(zhì)干細胞具有相同的免疫抑制活性[36]。Morandi等人發(fā)現(xiàn) HLA-G和HLA-E 分子參與了 hAESCs 介導的 T 細胞增殖抑制[37]。 此外，hADSCs 對炎癥過程也有免疫調(diào)節(jié)和免疫抑制作用，包括降低炎癥細胞的活性，抑制小膠質(zhì)細胞的遷移和免疫細胞向損傷部位的募集[7,8]。 ADSCs 還表現(xiàn)出血管生成、細胞保護、抗瘢痕和抗菌性能[38]。

2.4 促進M1型巨噬細胞向M2型轉(zhuǎn)化

一般來說，極化的巨噬細胞通常稱為M1和M2，對應巨噬細胞的兩種主要的、相反的活動。M1巨噬細胞通過產(chǎn)生促炎細胞因子、趨化因子和活性氧來消除損傷啟動因子，從而協(xié)調(diào)炎癥階段。隨后，M2巨噬細胞促進從炎癥期到組織修復期的進展，恢復受損的組織結(jié)構(gòu)和完整性[39]。

有趣的是，不同的研究結(jié)果均表明巨噬細胞在羊膜細胞的下游免疫抑制作用中起關(guān)鍵作用，并最終改善治療效果。例如，Murphy等人證明，對于巨噬細胞功能受損的肺纖維化小鼠，hAECs不能發(fā)揮修復作用[20]。此外，在博萊霉素誘導的肺損傷實驗中，hAEC干預使巨噬細胞向肺部的浸潤顯著減少[20,21]。此外，未經(jīng)治療的患病動物中浸潤的巨噬細胞以M1為主，而hAECs處理的動物主要巨噬細胞表型為M2[21,31]。此外，體外研究表明，在解決慢性炎癥后的纖維化過程中，巨噬細胞及其向M2型的轉(zhuǎn)換起到了重要的作用。事實上，有報道稱，在四氯化碳(Tetrachloromethane, CCl4)誘導的肝纖維化小鼠中，hAECs移植可減少傷口愈合M2巨噬細胞表型誘導形成的肝纖維化[16]。最近，實驗證明在皮膚傷口愈合的小鼠模型中，皮下注射來自hAEC的條件培養(yǎng)基可以加速傷口愈合。同樣，條件培養(yǎng)基介導的組織修復與定居骨髓群體的調(diào)節(jié)有關(guān)，其特征是減少炎癥環(huán)境和M1巨噬細胞數(shù)量以及誘導M2巨噬細胞[40]。研究證實，羊膜細胞對巨噬細胞具有免疫調(diào)節(jié)作用。例如，有報道稱，在體外單核細胞分化為DC或M1巨噬細胞時，即使在沒有任何分化/極化刺激的情況下，hAMSCs也會使單核細胞向抗炎M2巨噬細胞分化[24,40,41]。在hAMSCs或其條件培養(yǎng)基存在下產(chǎn)生的巨噬細胞，抗炎細胞因子IL-10的產(chǎn)生增加，不同促炎因子的分泌減少。這些細胞可誘導具有潛在抑制活性的調(diào)節(jié)性T細胞[40]。

3 問題與展望

雖然羊膜細胞在再生醫(yī)學上表現(xiàn)出非常好的修復能力，但是目前的研究還處于比較初期的階段，大多數(shù)研究還集中在動物模型中，臨床試驗較少。目前的研究僅能表明羊膜細胞在動物模型和少數(shù)患者上是安全有效的，大規(guī)模的臨床試驗還沒有開展，因此該治療方法是否具有普適性還需要大量的臨床工作支撐。另外，羊膜細胞的制備、質(zhì)控體系的構(gòu)建、臨床級細胞或衍生物的劑量標準等一系列制度尚未確立，故臨床效果可重復性差，不適合大規(guī)模進行研究。綜上所述，羊膜干細胞應用于臨床還有很多工作要做。本研究所致力于羊膜干細胞的制備、質(zhì)控體系構(gòu)建等工藝標準化，希望從制劑標準方面為羊膜干細胞的臨床應用做出貢獻。