衛(wèi)靜雯 成姝婷

（1. 四川大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)，四川 成都 610041；2. 四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)時(shí)間生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（四川大學(xué)），四川 成都 610041）

結(jié)腸癌（Colorectal cancer，CRC）是一種常見的消化道惡性腫瘤，其在我國(guó)的發(fā)病率和病死率均居高不下。由于CRC患者確診時(shí)大多數(shù)已處于中晚期，因而預(yù)后較差，即便是確診時(shí)仍處于早期的患者，其5年生存率也僅為65%；而已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，20%～30%在確診的五年內(nèi)死亡[1-3]。據(jù)我國(guó)國(guó)家癌癥中心分別于2013年、2015年和2019年發(fā)布的全國(guó)癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)CRC的發(fā)病率呈逐年遞增的趨勢(shì)[4]。2018年CRC與直腸癌發(fā)病率、死亡率居我國(guó)所有惡性腫瘤發(fā)病人數(shù)的第三位及第五位[5]。癌癥的發(fā)生與基因轉(zhuǎn)錄組的異常存在著密切的關(guān)系，通常涉及到多種癌基因、抑癌基因、細(xì)胞周期調(diào)控基因等的改變，如：相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄組表達(dá)水平的變化[6]。本研究通過從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心 (National Center for Biotechnology Information，NCBI) 公共數(shù)據(jù)平臺(tái)Gene Expression Omnibus（GEO） (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)在線數(shù)據(jù)庫(kù)獲得CRC癌組織和正常癌旁組織的表達(dá)譜基因芯片原始數(shù)據(jù)，分析CRC癌組織和正常癌旁組織之間的差異表達(dá)基因（Differentially Expressed Genes，DEGs），以及這些DEGs基因可能參與的生物學(xué)功能和信號(hào)通路，并初步篩選出與CRC的發(fā)生相關(guān)的關(guān)鍵基因，旨在探討CRC的發(fā)病機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 芯片數(shù)據(jù)獲取

在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心公共數(shù)據(jù)平臺(tái)Gene Expression Omnibus (GEO) 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) 中，以“colon cancer”作為搜索詞，檢索關(guān)于CRC的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)集納入條件：CRC患者的轉(zhuǎn)錄組RNA表達(dá)芯片；芯片組織包含CRC腫瘤組織和與之對(duì)應(yīng)的正常癌旁組織。通過篩選下載了CRC基因芯片數(shù)據(jù)集GSE44861，該數(shù)據(jù)集來源于美國(guó)國(guó)家癌癥研究所，貝塞斯達(dá)人類致癌實(shí)驗(yàn)室，芯片平臺(tái)為Affymetrix Human Genome U133A Array，包括CRC腫瘤組織和癌旁正常組織的111個(gè)結(jié)腸組織的基因表達(dá)譜。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理

通過active perl軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，包括單個(gè)樣本數(shù)據(jù)匯總為矩陣、探針I(yè)D轉(zhuǎn)換為Gene symbol。

1.2.2 差異基因篩選

使用R軟件Limma包（Linear Models for Microarray Data）對(duì)預(yù)處理后的芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，設(shè)置假陽(yáng)性概率（False Discovery Rate，F(xiàn)DR）<0.05和樣本件差異倍數(shù) |logFC| >1.0為篩選閾值，篩選CRC腫瘤組織和癌旁正常組織間的差異表達(dá)的DEGs。

1.2.3 基因本和信號(hào)通路富集分析

使用Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery（DAVID）數(shù)據(jù)庫(kù)（http://david.abcc.ncifcrf.gov/）的在線分析工具對(duì)篩選出的DEGs進(jìn)行富集分析，包括基因本（Gene Ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)信號(hào)通路[7,8]。其中GO分析對(duì)生物過程（Biological Process，BP）、分子功能（Molecular Function，MF）和細(xì)胞組成（Cellular Component，CC）進(jìn)行了富集。設(shè)定FDR<0.001為篩選閾值。

1.2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為研究DEGs所編碼蛋白質(zhì)之間的相互關(guān)系, 本研究使用了STRING數(shù)據(jù)庫(kù) (http://www.stringdb.org/) 對(duì)篩選出的DEGs編碼蛋白進(jìn)行了蛋白互作（Protein-protein interaction，PPI）分析，設(shè)定置信度 > 0.7，并構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。采用Cytoscape軟件（v3.8.0）的Cytohubba插件對(duì)PPI結(jié)果進(jìn)行可視化分析，以MCC算法獲取前10位關(guān)鍵基因[9]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究中基因芯片表達(dá)數(shù)據(jù)采用R軟件（v4.0.2）進(jìn)行差異基因分析，采用DAVID在線工具對(duì)差異基因進(jìn)行基因本和信號(hào)通路富集分析，采用STRING在線工具對(duì)差異基因編碼蛋白進(jìn)行PPI分析，采用Cytoscape軟件（v3.8.0）的Cytohubba插件對(duì)PPI結(jié)果進(jìn)行關(guān)鍵基因分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRC組織DEGs篩選結(jié)果

分析GSE44861基因表達(dá)譜，共篩選出241個(gè)DEGs，其中74個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，167個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。見圖1。

圖1 GSE44861基因表達(dá)譜中差異基因。A為差異基因的火山圖，B為前50個(gè)差異基因的熱圖。

2.2 DEGs的GO和KEGG富集分析結(jié)果

GO富集分析結(jié)果表明，DEGs在8條BP中顯著富集：胃腸上皮的維護(hù)（Maintenance of gastrointestinal epithelium）、體液免疫反應(yīng)（Humoral immune response）、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織（Extracellular structure organization）、細(xì)胞外基質(zhì)組織（Extracellular matrix organization）、消化（Digestion）、碳酸氫鹽運(yùn)輸（Bicarbonate transport）、抗菌體液反應(yīng)（Antimicrobial humoral response）、抗菌肽介導(dǎo)的抗菌體液免疫應(yīng)答（ Antimicrobial humoral immune response mediated by antimicrobial peptide），見圖2a；差異基因在5條cc中顯著富集：微絨毛膜（Microvillus membrane）、微絨毛（Micronillus）、含膠原細(xì)胞外基質(zhì)（Collagen-containing extracellular matrix）、頂端質(zhì)膜（Apical plasma membrane）、細(xì)胞頂端（Apical part of cell），見圖2B；差異基因在13條MF中顯著富集：信號(hào)受體激活劑活性（Signaling receptor activator activity）、受體配體活性（Receptor ligand activity）、氧化還原酶活性，作用于供體的CH-OH基團(tuán)，NAD或NADP為受體（Oxidoreductase activity, acting on the CH-OH group of donors, NAD or NADP as accetor）、氧化還原酶活性，作用于供體的CH-OH基團(tuán)（Oxidoreductase activity, acting on the CH-OH group of donors）、激素活性（Hormone activity）、糖胺聚糖結(jié)合（Glycosaminoglycan biding）、具有抗張強(qiáng)度的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分（Extracellular matrix structural constituent conferring tensile strength）、CXCR趨化因子受體結(jié)合（CXCR chemokine receptor binding）、趨化因子受體結(jié)合（Chemokine receptor binding）、趨化因子活性（Chemokine activity）、碳酸鹽脫水酶活性（Carbonate dehydratase activity）、陰離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性（Anion transmembrane transporter activity），見圖2C。此外, 差異表達(dá)基因在2條KEGG 通路中富集： 氮代謝（Nitrogen metabolism）、膽汁分泌（Bile secretion），見圖2D。

圖2 差異基因的功能和通路富集分析。A表示BP；B表示CC；C表示MF;D表示KEGG。

2.3 差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò)

將所有DEGs對(duì)應(yīng)蛋白列表上傳STRING數(shù)據(jù)庫(kù)分析其相互作用關(guān)系，PPI結(jié)果顯示，該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)共有238個(gè)節(jié)點(diǎn)，208條邊線。通過Cytoscape軟件得到該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)中的10關(guān)鍵蛋白分別為：AGT、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL11、CXCL13、SST、PYY、P2RY14、INSL5，見圖3。

圖3 差異基因表達(dá)蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵蛋白

2.4 差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò)

將所有DEGs對(duì)應(yīng)蛋白列表上傳STRING數(shù)據(jù)庫(kù)分析其相互作用關(guān)系，PPI結(jié)果顯示，該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)共有238個(gè)節(jié)點(diǎn)，208條邊線。通過Cytoscape軟件得到該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)中的10關(guān)鍵蛋白分別為：AGT、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL11、CXCL13、SST、PYY、P2RY14、INSL5，見圖3。

2.5 關(guān)鍵基因（Hub gene）在DEGs富集結(jié)果中的分布

在DEGs富集結(jié)果中各GO注釋和KEGG通路包含的DEGs中查找由PPI網(wǎng)絡(luò)獲得的10關(guān)鍵蛋白所對(duì)應(yīng)的hub基因，發(fā)現(xiàn)除了P2RY14外，其余9個(gè)hub基因主要分布于3條BP（抗菌肽介導(dǎo)的抗菌體液免疫應(yīng)答、抗菌體液反應(yīng)、體液免疫反應(yīng)）和6條MF（受體配體活性、信號(hào)受體激活劑活性、CXCR趨化因子受體結(jié)合、激素活性、趨化因子受體結(jié)合、趨化因子活性）。所有的Hub基因在CC和KEGG富集結(jié)果中沒有分布。

3 討論

CRC的發(fā)生、發(fā)展與相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄組的改變有著密切的關(guān)系[6]。本研究利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中CRC組織和相應(yīng)癌旁組織的基因芯片數(shù)據(jù)對(duì)其DEGs進(jìn)行了篩選，共獲得241個(gè)DEGs，其中74個(gè)上調(diào)，167個(gè)下調(diào)。我們首先利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)分析了DEGs在BP、CC、MF和KEGG中的富集情況，得到8條BP、5條CC、13條MF和2條KEGG注釋；之后利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)這些DEGs對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)進(jìn)行了分析，得到了它們之間的相互作用關(guān)系，并采用Cytoscape軟件的Cytohubba插件篩選出了10個(gè)關(guān)鍵蛋白的hub基因。在這些hub基因中，P2RY14未能在GO和KEGG中富集，可能與CRC中改變的BP、CC、MF和KEGG關(guān)系不大；但其表達(dá)水平在CRC與癌旁組織之間的差異提示該基因本身與CRC存在一定的聯(lián)系，只是這種聯(lián)系的發(fā)生與BP、CC、MF或信號(hào)通路無(wú)關(guān)?，F(xiàn)有研究雖尚無(wú)P2RY14與CRC的報(bào)道，但其與其它腫瘤有著緊密的聯(lián)系，如：P2RX7等嘌呤能受體可增加腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，是不良預(yù)后因素[10,11]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，富集于“CXCR趨化因子受體結(jié)合”MF注釋的所有DEGs均是hub基因；而富集于“趨化因子受體結(jié)合”和“趨化因子活性”的MF注釋大部分DEGs為hub基因，提示CRC的發(fā)生與趨化因子受體結(jié)合（特別是CXCR趨化因子受體結(jié)合）有著緊密的關(guān)系。趨化因子及其受體家族是白細(xì)胞遷移至炎癥部位的重要介質(zhì)，長(zhǎng)期炎癥可能為腫瘤細(xì)胞的發(fā)育和生長(zhǎng)提供理想的微環(huán)境，趨化因子家族可以通過吸引腫瘤促進(jìn)和抗腫瘤細(xì)胞來刺激或抑制腫瘤的發(fā)展[12]。有研究表明，CXC趨化因子家族被白介素-1α在結(jié)腸癌細(xì)胞系中強(qiáng)烈誘導(dǎo)，表明了結(jié)腸癌與炎癥過程的潛在聯(lián)系，并在腫瘤生長(zhǎng)調(diào)節(jié)與轉(zhuǎn)移中有重要作用[13]。CXCL1、CXCL2 、CXCL3、CXCL11、CXCL13均屬于CXC趨化因子家族的小細(xì)胞因子，且在不同腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著重要的作用。目前已知CXCL3在包括CRC在內(nèi)的多種侵襲性腫瘤中過表達(dá)，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因子[14]；CXCL1也可能與結(jié)腸癌的發(fā)生相關(guān)[15]；CXCL11在CRC中的作用存在爭(zhēng)議，有研究者認(rèn)為在CRC細(xì)胞系中過表達(dá)，可抑制細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞的遷移，與CRC的遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移和體外上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)，可能是結(jié)腸癌患者總生存期較差的危險(xiǎn)因素[16-18]；另一些研究者認(rèn)為CXCL11可促進(jìn)抗腫瘤免疫從而提高生存率，可作為結(jié)腸腺癌患者的獨(dú)立良性預(yù)后生物標(biāo)志物[16]。CXCL2和CXCL13與炎癥和免疫有著密切的聯(lián)系，但尚未確定與CRC的關(guān)系[20,21]。

此外，本研究中hub基因還多富集于“抗菌肽介導(dǎo)的抗菌體液免疫應(yīng)答”、“抗菌體液反應(yīng)”、“體液免疫反應(yīng)”的BP注釋和“受體配體活性”、“信號(hào)受體激活劑活性”和“激素活性”的MF注釋，提示CRC的發(fā)生或與腸道感染和免疫應(yīng)答有關(guān)。

綜上所述， CRC的發(fā)生可能與CXCR趨化因子受體結(jié)合以及腸道感染和免疫應(yīng)答密切相關(guān)，P2RY14作為CRC中較為獨(dú)立的DEGs，也極有可能成為CRC的篩查、診斷、預(yù)后的分子生物標(biāo)志物。但本研究?jī)H利用生物信息學(xué)分析進(jìn)行初步篩選，且測(cè)序數(shù)據(jù)的樣本量較小，存在一定的局限性，后期需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。