李軍 陳偉程 徐若竹 湯佳臻

深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院口腔科（廣東深圳518100）

口腔癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）為頭頸部最常見的惡性腫瘤［1?2］，5年生存率約為63%，其中舌鱗狀細(xì)胞癌（tongue squamous cell car?cinoma，TSCC）最為常見。由于舌部運(yùn)動以及淋巴回流原因，TSCC 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率較高［3?4］，從而降低患者的生存率。盡管TSCC的治療已經(jīng)取得了最新進(jìn)展，但TSCC 的病死率仍然很高［5?6］。所以有必要對TSCC 進(jìn)展涉及的分子途徑進(jìn)行研究，為TSCC新的治療策略提供方向。

Src 酪氨酸激酶（Src tyrosine kinase，Src）是一種非受體酪氨酸激酶，分子量為60 kDa。Src 作為Src 激酶家族的成員，在細(xì)胞增殖、侵襲和遷移等方面發(fā)揮重要作用［7?9］。研究表明，Src蛋白在多種腫瘤細(xì)胞中高度活化，并促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展［10?11］。但Src 蛋白在舌鱗癌中的作用尚未明確，本研究將對Src 蛋白在口腔舌鱗癌中的表達(dá)和與臨床病理特征之間的關(guān)系以及對舌鱗癌細(xì)胞增殖和侵襲遷移能力的影響進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料來源收集2012年2月至2019年2月于我院口腔頜面外科就診的TSCC 患者20 例，其中男12 例，女8 例，年齡33～60 歲。所有病例術(shù)前病理活檢均確診為TSCC，術(shù)前未行放療或化療。切取TSCC 組織和腫瘤邊界外約1 cm 的癌旁組織進(jìn)行研究。該研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，納入研究的患者本人或其家屬均知情同意。

1.2 主要試劑兔抗人Src 單克隆抗體（Cell Sig?naling Technology，美國）；即用型快捷免疫組化MaxVisionTM試劑盒、加強(qiáng)型DAB 顯色試劑盒、中性樹膠（福州邁新生物股份有限公司，中國），EDTA組織抗原修復(fù)液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，中國）；舌鱗癌SCC127 細(xì)胞系購自ATCC，DMEM 及胎牛血清（Gibco，美國），基底膜基質(zhì)BD Matrixgel（354234）（Thermo Fisher，美 國），SRC 的shRNA 載體合成自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，SRC?shRNA 1#：AAACTCCCCTTGCTCATGTACTT，SRC?shRNA 2#：CATCCTCAGGAACCAACAATTC；CCK?8 試劑盒（Dojindo，日本）。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化采用S?P 法：（1）10%甲醛溶液固定標(biāo)本，脫水，石蠟包埋后4 μm 連續(xù)切片；（2）65 ℃烤片，2 h，經(jīng)二甲苯及梯度酒精脫蠟、水化；（3）pH=9.0 的EDTA 組織抗原修復(fù)液，高壓修復(fù)10 min 后自然冷卻。PBS 洗滌3 次后3%過氧化氫室溫處理10 min，PBS 洗滌3 次，山羊血清封閉30 min 后加入兔抗人Src 單克隆抗體，4 ℃孵育過夜；（4）PBS 洗滌3 次，加入二抗室溫下作用30 min，PBS 洗滌3 次；（5）滴加DAB 顯色液，通過顯微鏡控制反應(yīng)時間，PBS 終止染色后蘇木素復(fù)染，自來水沖洗，PBS 返藍(lán)；（6）切片經(jīng)酒精及二甲苯透明、干燥，中性樹脂封片。

選取高倍鏡視野，參照YOSHIKAWA 法［12］判定結(jié)果：（1）兩名病理科專家在不知其臨床病理特征下，顯微鏡下觀察細(xì)胞數(shù)。（2）將包膜呈黃或棕黃色細(xì)胞視為陽性。（3）根據(jù)腫瘤細(xì)胞染色百分比進(jìn)行分級：無陽性反應(yīng)或陽性染色＜5%為（-），≥5%且＜35%為（+），≥35%且＜65%為（++），≥65%為（+++）。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)TSCC細(xì)胞系SCC127用含有10%胎牛血清和100 μg/mL 青霉素的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)條件為37 ℃，5%CO2。

1.3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染取對數(shù)期舌鱗癌細(xì)胞系SCC127，將細(xì)胞接種到6 孔板，待細(xì)胞貼壁后更換為不含血清和青霉素的DMEM 培養(yǎng)基，培養(yǎng)6 h 后，將SRC?shRNA 轉(zhuǎn)染SCC127 細(xì)胞系，繼續(xù)培養(yǎng)72 h 后，收集細(xì)胞用于后續(xù)檢驗。

1.3.4 實時熒光定量PCR收集轉(zhuǎn)染72 h 后的SCC127 細(xì)胞，采用TRIzol 試劑提取總RNA。取RNA 使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后將cDNA 作為RT?qPCR 的模板，在反應(yīng)體系中加入TaqDNA 聚合酶及引物進(jìn)行分析。SRC 上游引物為5′?CAGTGTCTGACTTCGACAACGC?3′，下游引物為5′?CCATCGGCGTGTTTGGAGTA?3′；GAPDH 上游引物序列為5′?GAAGGTGAAGGTCGGAGTC?3′，下游引物序列為5′?GAAGATGGTGATGGGATTTC?3′；采用2?ΔΔCt法進(jìn)行量化分析。

1.3.5 蛋白質(zhì)印跡法分別取已轉(zhuǎn)染SRC?shRNA和對照NC?shRNA SCC127 細(xì)胞，利用RIPA 裂解后，離心提取總蛋白后用BCA法進(jìn)行蛋白定量。在10%SDS?PAGE 凝膠上分離出30 μg 總蛋白，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉后，加入Src 一抗（1∶500 稀釋），4 ℃條件下孵育過夜。第2 天洗膜后，室溫條件下用HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 孵育1 h，PBST 洗膜后加入顯影液曝光顯像。SRC 條帶灰度值反映蛋白的相對表達(dá)水平。

1.3.6 細(xì)胞增殖實驗利用CCK?8 法評估細(xì)胞增殖。取已轉(zhuǎn)染SRC?shRNA（實驗組）和NC?shRNA（對照組）的SCC127 細(xì)胞，以5×103細(xì)胞/孔的數(shù)量接種到96 孔板中，分別培養(yǎng)24、48 和72 h 后，每孔加入10 μL CCK?8 試劑，37 ℃條件下孵育2.5 h 后，用酶標(biāo)儀測量在450 nm 波長下的光密度值（OD）。

1.3.7 Transwell 侵襲實驗取已轉(zhuǎn)染SRC?shRNA（實驗組）和NC?shRNA（對照組）的SCC127 細(xì)胞，胰酶消化后離心收集細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基重懸混勻，調(diào)整細(xì)胞密度為2.5 × 105個/mL，接種于小室上室，200 μL/孔。待細(xì)胞貼壁穩(wěn)定后，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。輕柔擦棄上室細(xì)胞與基質(zhì)膠，經(jīng)4%多聚甲醛固定5 min，0.01%結(jié)晶紫染色后，雙蒸水漂洗后晾干。隨機(jī)選取5 個400 倍視野拍照，計算各組中穿膜細(xì)胞數(shù)量。

1.3.8 劃痕實驗取已轉(zhuǎn)染SRC?shRNA（實驗組）和NC?shRNA（對照組）的SCC127 細(xì)胞，胰酶消化后計數(shù)，將細(xì)胞接種于6 孔板（接種數(shù)量以次日鋪滿6 孔板一層為宜）。培養(yǎng)24 h 后，在6 孔板中用200 μL 槍頭呈“一”字劃痕，生理鹽水沖洗3 次，更換含血清的DMEM 培養(yǎng)基，劃痕后24 h 觀察細(xì)胞的遷移情況并拍照記錄，重復(fù)實驗3 次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法用SPSS 25.0 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用GraphPad prism 7.0 作圖軟件（Version X，USA）作圖,利用Image J 圖像分析軟件統(tǒng)計Transwell 細(xì)胞個數(shù)。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，比較方法采用t檢驗，多組比較采用方差分析；計數(shù)資料用例（%）表示，比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Src 蛋白在TSCC 組織、癌旁組織的表達(dá)Src 蛋白在TSCC 及癌旁組織中均有表達(dá)，癌旁組織陽性率為15%（3/20），癌組織陽性率為75%（15/20）。中強(qiáng)陽性率：癌旁組織為0（0/20），癌組織為60%（12/20），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。見表1、圖1。

表1 Src 蛋白在舌鱗癌組織及癌旁組織的表達(dá)Tab.1 Expression of Src protein in tongue squamous cell carcinoma and paracancerous tissues例

圖1 Src 在TSCC 及癌旁組織的表達(dá)Fig.1 Expression of Src protein in tongue squamous cell carcinoma and paracancerous tissues

2.2 TSCC 中Src 蛋白的表達(dá)與臨床及病理特征之間的關(guān)系不同年齡、性別和腫瘤分化程度患者Src 蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P> 0.05）。臨床分期Ⅰ、Ⅱ期患者Src 陽性表達(dá)率顯著低于Ⅲ和Ⅳ期（P<0.05）；中高分化顯著低于低分化（P<0.05），T1和T2分期顯著低于T3和T4分期（P<0.001）；淋巴轉(zhuǎn)移者顯著高于無轉(zhuǎn)移者（P<0.05）。見表2。

表2 TSCC 組織中Src 表達(dá)與臨床及病理因素之間的關(guān)系Tab.2 Relationship between Src expression and clinical and pathological factors in tongue squamous cell carcinoma

2.3 shRNA 序列對SRC 表達(dá)的影響SRC shR?NA?1#和SRC shRNA?2#均可抑制SRC 的表達(dá)，且SRC shRNA?2#的效果優(yōu)于SRC shRNA?1#，見圖2。故本研究主要用SRC shRNA?2#來進(jìn)行功能研究。

圖2 Western Blot 和定量PCR 檢測SRC?shRNA 對SRC 表達(dá)的影響Fig.2 Effect of SRC?shRNA on Expression of SRC by Western Blot and Quantitative PCR

2.4 沉默SRC 抑制舌鱗癌細(xì)胞系SCC127 細(xì)胞的增殖能力將SRC?shRNA 轉(zhuǎn)染至舌鱗癌細(xì)胞系SCC127 后，利用CCK?8 法檢測沉默SRC 對細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示，沉默SRC 表達(dá)可顯著減低SCC127 細(xì)胞的增殖，見圖3。

圖3 利用CCK?8 法檢測SRC?shRNA 對SCC127 細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effect of SRC?shRNA on proliferation of SCC127 cells by CCK?8 assay

2.5 沉默SRC 抑制TSCC 細(xì)胞系SCC127 細(xì)胞的侵襲能力Transwell 侵襲實驗結(jié)果顯示，與NC?shRNA 組相比，SRC?shRNA 組穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.05），結(jié)果表明Src 能夠抑制TSCC SCC127 細(xì)胞的侵襲能力。見圖4。

圖4 Transwell 侵襲實驗檢測對照組與實驗組TSCC SSC127 細(xì)胞的侵襲能力Fig.4 Transwell invasion assay was used to detect the invasion ability of human tongue carcinoma SSC127 cells in the control and the experimental groups

2.6 沉默SRC抑制TSCC細(xì)胞系SCC127細(xì)胞的遷移能力劃痕實驗檢測結(jié)果顯示，24 h SRC?shRNA組遷移率為（60.93±1.27）%，NC?shRNA組為（77.40± 2.24）%，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.001），提示沉默SRC 能夠抑制人TSCC 細(xì)胞系細(xì)胞的遷移能力。見圖5。

圖5 劃痕實驗檢測對照組與實驗組TSCC SSC127 細(xì)胞遷移能力Fig.5 Detection of migration ability of human tongue cancer SSC127 cells in control and experimental groups by scratch test

3 討論

TSCC 是口腔頜面部常見的惡性腫瘤,其生物學(xué)特征主要表現(xiàn)為局部浸潤生長以及頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。TSCC 的發(fā)生發(fā)展是一個多因素、多基因參與、多步驟的復(fù)雜過程，通過合理檢測腫瘤標(biāo)志物有助于TSCC 的早期診斷和預(yù)后監(jiān)測，然而單一腫瘤標(biāo)志物具有局限性，應(yīng)用多種標(biāo)志物聯(lián)合檢測以增加其敏感性和特異性，對TSCC 患者頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移進(jìn)行監(jiān)測，具有較高的社會效益［13］。

Src 作為Src 家族蛋白酪氨酸激酶（Src family protein tyrosine kinases，SFKs）的核心成員，在有絲分裂、細(xì)胞生長和腫瘤發(fā)生等方面發(fā)揮了重要作用［14-16］。先前研究表明，Src 在維持細(xì)胞侵襲性表型而非細(xì)胞周期進(jìn)程中起作用［17］。在腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程中，Src 可以與整合素（Integrin）家族的不同亞型作用，從而影響細(xì)胞的運(yùn)動和轉(zhuǎn)移［18］。Integrins 為α和β亞單位非共價結(jié)合形成的一種跨膜二聚體受體。上調(diào)integrin α和β可增加癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［19-20］。Intergrins 介導(dǎo)的細(xì)胞黏附作用能夠誘導(dǎo)FAK 產(chǎn)生自磷酸化，從而產(chǎn)生可與Src的SH2 區(qū)結(jié)合的位點(diǎn)，F(xiàn)AK 與SH2 形成同步化黏著斑FA 連接，這是調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)［21］。活化的FAK?Src復(fù)合可通過聚集并磷酸化p130CAS蛋白激活Rac1 活性來促進(jìn)膜突出的形成［22］。此外，Src 的SH3 區(qū)還可與intgerin?β3 直接作用，募集并磷酸化Syk，激活Rac1，刺激板狀偽足形成及細(xì)胞擴(kuò)散［23-24］。已有文獻(xiàn)報道多種人腫瘤都有較高水平的Src 蛋白表達(dá)，如乳腺癌、結(jié)直腸癌和胰腺癌［19，25-26］。HERMIDA?PRADO 等［27］研究發(fā)現(xiàn)Src 表達(dá)與喉癌疾病進(jìn)展、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤復(fù)發(fā)呈正相關(guān)，這些都證明了Src 在癌癥發(fā)生發(fā)展中的作用。已有多種Src 抑制劑被批準(zhǔn)應(yīng)用于治療多種惡性腫瘤，如博舒替尼、達(dá)沙替尼、帕納替尼、塞卡替尼等。其中塞卡替尼在復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移頭頸部鱗癌的臨床試驗中無反應(yīng)［28］，而達(dá)沙替尼聯(lián)合西妥昔單抗治療有36%轉(zhuǎn)移性頭頸部鱗癌患者無疾病進(jìn)展［29］。

本研究結(jié)果表明Src 在口腔TSCC 組織中高表達(dá)，進(jìn)一步對患者的臨床病理學(xué)特征進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，Src 蛋白的表達(dá)與患者的年齡、性別無關(guān)，但與患者的腫瘤分化程度、臨床分期、T 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，臨床分期越晚、T 分期越晚、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度越低者的Src 蛋白表達(dá)率越高，提示Src 在TSCC 發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。利用sh?RNA 下調(diào)SRC 的表達(dá)后，可以抑制TSCC 細(xì)胞系SCC127 的增殖，并可以抑制SCC127 的侵襲遷移能力，提示Src 可以促進(jìn)TSCC 細(xì)胞的增殖和侵襲遷移。

綜上所述，Src 蛋白在TSCC 中高表達(dá)，且與TSCC 患者預(yù)后不良因素相關(guān)，下調(diào)SRC 可以促進(jìn)TSCC 細(xì)胞系SCC127 的增殖、侵襲和遷移能力，說明Src 蛋白在TSCC 的發(fā)展過程中起一定的作用，可為日后TSCC 臨床治療提供新的靶點(diǎn)。