白韜 田文海 唐康歲 彭濤 繆宜成 甘金城

廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院1血管外科，2疼痛科，3血管外科，4大血管外科，5科學(xué)實(shí)驗(yàn)室（廣西桂林541002）

胸主動(dòng)脈瘤是一種威脅生命的疾病，特征是無癥狀的胸主動(dòng)脈擴(kuò)張。患有胸主動(dòng)脈瘤的患者發(fā)生嚴(yán)重主動(dòng)脈并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)較高，如壁內(nèi)血腫、主動(dòng)脈夾層或破裂，甚至致命［1-2］。據(jù)估計(jì)，全世界每年與主動(dòng)脈瘤相關(guān)的死亡約為200 000 例［3］。由于迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)任何有效的藥物治療方法，手術(shù)修復(fù)仍然是主動(dòng)脈瘤的唯一治療方法［2］。胸主動(dòng)脈瘤是一種無聲疾病，目前仍需要新穎的靶向診斷工具來識(shí)別胸主動(dòng)脈瘤患者。血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）作為主動(dòng)脈介質(zhì)層中的主要細(xì)胞，已被認(rèn)為在維持主動(dòng)脈壁穩(wěn)態(tài)方面起著關(guān)鍵作用［4］。在人類和動(dòng)物模型中，導(dǎo)致主動(dòng)脈壁變性的因素包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor β，TGF?β）、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloprotease，MMP）等［5-6］。根據(jù)報(bào)道，TGF?β1 可以促進(jìn)人主動(dòng)脈（human aortic，HA）?VSMC 的增殖、遷移和表型轉(zhuǎn)換［7］，還可誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞增殖、膠原蛋白（collagen，Col）Ⅰ、Col Ⅲ合成與細(xì)胞表型分化［8］。TGF?β1 能夠刺激VSMC膠原生物合成并抑制膠原降解［9］。此外，細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化發(fā)生在胸主動(dòng)脈瘤的發(fā)展過程中，胸主動(dòng)脈瘤成纖維細(xì)胞顯示幾種MMP（MMP2、MMP11、MMP14）、膠原蛋白基因/彈性蛋白（Col1a1、Col1a2、Col3a1、Ern）和其他基質(zhì)蛋白的表達(dá)升高［10］。然而，目前仍缺乏關(guān)于MMP11 對(duì)TGF?β1 誘導(dǎo)的HA?VSMC 的增殖和膠原合成影響的報(bào)道。因此，本研究旨在通過測(cè)定MMP11 在TGF?β1 調(diào)控下HA?VSMC 的增殖和膠原合成中的功能，分析此過程中的相關(guān)機(jī)制，為胸主動(dòng)脈瘤的臨床防治提供新的研究方向和干預(yù)靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（HA?VSMC）購(gòu)自美國(guó)生物標(biāo)準(zhǔn)品收藏中心，TGF?β1 購(gòu)自美國(guó)Sigma?Aldrich 公司，MMP11 小干擾RNA si?MMP11、siRNA陰性對(duì)照si?NC購(gòu)自上海吉瑪公司，RIPA裂解緩沖液、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemilumi?nescence，ECL）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)ASPEN 公司，聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（0.45 μm）購(gòu)自美國(guó)Millipore 公司，RevertAid First Strand cDNA 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scien?tific 公司，SYBR?Green Premix Ex Taq 試劑盒購(gòu)自大連TaKaRa 公司，MTS 細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒購(gòu)買美國(guó)Promega 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與干預(yù)將在干冰保存中的HA?VSMC 懸液常規(guī)解凍、復(fù)蘇，以1 × 105細(xì)胞密度培養(yǎng)于含10%胎牛血清（Fetal calf serum，F(xiàn)BS）的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco′s modified eagle medium，DMEM）中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，以37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)HA?VSMC 達(dá)到90%融合時(shí)，胰蛋白酶消化進(jìn)行傳代。采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

TGF?β1 干預(yù)時(shí)，將HA?VSMC 接種于96 孔板，并使用含10% FBS 的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。然后將HA?VSMC 用等體積的PBS 洗滌一次以除去殘留的血清。血清饑餓24 h 后，將細(xì)胞用PBS 洗滌一次，并將0.1、1、5、10 ng/mL TGF?β1［7］加至細(xì)胞中，孵育24 h。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與干擾MMP11將HA?VSMC 分為對(duì)照組，0.1、1、5、10 ng/mL 組（0.1、1、5、10 ng/mL TGF?β1），5 ng/mL+si?NC 組（5 ng/mL TGF?β1+轉(zhuǎn)染si?NC）和5 ng/mL+si?MMP11 組（5 ng/mL TGF?β1+轉(zhuǎn)染si?MMP11）。干擾MMP11表達(dá)時(shí)，將HA?VSMC以1×105細(xì)胞密度接種于6孔板，24 h后，將細(xì)胞通過Opti?MEM 培養(yǎng)液、Lipo2000脂質(zhì)體與si?MMP11、si?NC 充分混勻，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 h 后吸去培養(yǎng)基，加入10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。轉(zhuǎn)染結(jié)束后，將5 ng/mL TGF?β1加至細(xì)胞中，孵育24 h，進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.4 Western blot每組HA?VSMC經(jīng)1.3中處理后，加入適量RIPA 裂解緩沖液常規(guī)提取蛋白，二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）法測(cè)定蛋白濃度。每組50 μg 體系下行十二烷基硫酸鈉?聚丙烯酰胺凝膠（SDS?PAGE）電泳，PVDF 膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫浸泡封閉2 h。按1∶1 000 比例在封閉緩沖液中稀釋細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、增殖細(xì)胞核抗原（Proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、ColⅠ、ColⅢ和MMP11一抗，將PVDF膜浸入一抗溶液中，在4 ℃下孵育過夜。次日用Tris?HCl?Tween 緩沖鹽溶液（Tris buffered saline with Tween，TBST）將PVDF 膜徹底清洗，15 min/次×3 次。用封閉緩沖液將HRP 標(biāo)記的二抗稀釋至1∶5 000 的稀釋度。37 ℃下將PVDF 膜浸泡在HRP 標(biāo)記的二抗中孵育1 h，再用TBST 徹底清洗PVDF 膜。最后將適量的ECL 底物溶液逐滴添加到每個(gè)膜上顯影，bio?rad 凝膠成像儀拍照分析。

1.5 細(xì)胞增殖檢測(cè)取HA?VSMC 接種于96 孔板中，每孔約5×103個(gè)細(xì)胞，根據(jù)1.3 分組進(jìn)行處理，分別在24 h 后加入MTS 試劑20 μL/孔，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置1 h，酶標(biāo)儀在490 nm 的波長(zhǎng)下讀取OD值，各平行孔取平均值。

1.6 MMP11 mRNA采用Trizol 試劑裂解HA?VSMC，提取RNA。按照RevertAid First Strand cDNA試劑盒和SYBR?Green Premix Ex Taq 試劑盒內(nèi)說明書中的方法及步驟進(jìn)行cDNA 合成與擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)體系10 μL。通過ABI 7500 快速儀器定量MMP11 的表達(dá)。以GADPH 作為內(nèi)參基因，用公式2?ΔΔCt計(jì)算MMP11 mRNA 表達(dá)情況。MMP11 序列為正向：5′?CCTAAAGGTATGGAGCGATGT?3′，反向：5′?CGATAGTCCAGGTCTCATCAT?3′。GADPH 引物序列正向：5′?GAAGGTGAAGGTCGGAGTC?3′，反向：5′?ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG?3′。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法將SPSS 22.0 軟件應(yīng)用于統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以（）表示。組間差異比較通過t檢驗(yàn)、SNK?q檢測(cè)或單因素方差分析進(jìn)行，當(dāng)P<0.05時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度TGF?β1對(duì)HA?VSMC增殖的影響見圖1 和表1，0.1、1、5 和10 ng/mL 濃度TGF?β1 處理HA?VSMC后，0.1、1、5和10 ng/mL組HA?VSMC中CyclinD1、PCNA 蛋白水平和HA?VSMC 增殖活性均高于對(duì)照組，以5 ng/mL 組CyclinD1、PCNA 蛋白水平和增殖活性最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖1 不同濃度TGF?β1 對(duì)HA?VSMC 增殖相關(guān)蛋白的影響Fig.1 Effects of different concentrations of TGF?β1 on proliferation related proteins of HA?VSMC

表1 不同濃度TGF?β1 對(duì)HA?VSMC 增殖的影響Tab.1 Effects of different concentrations of TGF?β1 on proliferation of HA?VSMC ±s

表1 不同濃度TGF?β1 對(duì)HA?VSMC 增殖的影響Tab.1 Effects of different concentrations of TGF?β1 on proliferation of HA?VSMC ±s

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

分組對(duì)照組0.1 ng/mL 1 ng/mL 5 ng/mL 10 ng/mL F 值P 值OD490 0.29±0.02 0.47±0.03*0.79±0.04*1.05±0.07*0.85±0.05*49.676<0.001 CyclinD1 0.37±0.02 0.49±0.03*0.69±0.04*0.83±0.05*0.62±0.03*25.915<0.001 PCNA 0.23±0.01 0.36±0.03*0.49±0.04*0.68±0.04*0.51±0.03*30.888<0.001

2.2 不同濃度TGF?β1 對(duì)HA?VSMC 膠原合成的影響見圖2 和表2，0.1、1、5 和10 ng/mL 濃度TGF?β1 處理HA?VSMC 后，0.1、1、5 和10 ng/mL 組HA?VSMC 中ColⅠ和ColⅢ蛋白水平均高于對(duì)照組，以5 ng/mL 組ColⅠ和ColⅢ蛋白水平最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖2 不同濃度TGF?β1 對(duì)HA?VSMC 膠原合成相關(guān)蛋白的影響Fig.2 Effects of different concentrations of TGF?β1 on collagen synthesis related proteins of HA?VSMC

表2 不同濃度TGF?β1 對(duì)HA?VSMC 膠原合成的影響Tab.2 Effects of different concentrations of TGF?β1 on collagen synthesis of HA?VSMC ±s

表2 不同濃度TGF?β1 對(duì)HA?VSMC 膠原合成的影響Tab.2 Effects of different concentrations of TGF?β1 on collagen synthesis of HA?VSMC ±s

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

分組對(duì)照組0.1 ng/mL 1 ng/mL 5 ng/mL 10 ng/mL F 值P 值ColⅠ0.22±0.01 0.35±0.02*0.49±0.04*0.63±0.05*0.45±0.03*24.520<0.001 ColⅢ0.17±0.01 0.31±0.02*0.42±0.03*0.57±0.03*0.39±0.03*34.732<0.001

2.3 不同濃度TGF?β1 對(duì)HA?VSMC 中MMP11表達(dá)的影響見圖3 和表3，0.1、1、5 和10 ng/mL組HA?VSMC 中MMP11 蛋白和MMP11 mRNA 水平均高于對(duì)照組；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖3 不同濃度TGF?β1對(duì)HA?VSMC中MMP11表達(dá)的影響Fig.3 Effects of different concentrations of TGF?β1 on the expression of MMP11 of HA?VSMC

表3 不同濃度TGF?β1 對(duì)HA?VSMC 中MMP11 表達(dá)的影響Tab.3 Effects of different concentrations of TGF?β1 on the expression of MMP11 of HA?VSMC ±s

表3 不同濃度TGF?β1 對(duì)HA?VSMC 中MMP11 表達(dá)的影響Tab.3 Effects of different concentrations of TGF?β1 on the expression of MMP11 of HA?VSMC ±s

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

分組MMP11 mRNAMMP11對(duì)照組1.01±0.050.25±0.02 0.1 ng/mL 1.37±0.08*0.38±0.03*1 ng/mL 5 ng/mL 10 ng/mL F 值P 值1.86±0.10*2.57±0.13*2.12±0.11*39.699<0.001 0.51±0.03*0.75±0.05*0.42±0.03*34.432<0.001

2.4 干擾MMP11 表達(dá)能逆轉(zhuǎn)TGF?β1（5 ng/mL）對(duì)HA?VSMC增殖的影響見圖4和表4，5 ng/mL+si?MMP11 組HA?VSMC 的MMP11、CyclinD1、PCNA蛋白水平和增殖活性均低于5 ng/mL+si?NC 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖4 干擾MMP11 表達(dá)能逆轉(zhuǎn)TGF?β1（5 ng/mL）對(duì)HA?VSMC 增殖相關(guān)蛋白的影響Fig.4 Interfering with MMP11 expression reversed the effects of TGF?β1（5 ng/mL）on HA?VSMC proliferation related proteins

表4 干擾MMP11 表達(dá)能逆轉(zhuǎn)TGF?β1（5 ng/mL）對(duì)HA?VSMC 增殖的影響Tab.4 Interfering with MMP11 expression reversed the effects of TGF?β1（5 ng/mL）on HA?VSMC proliferation ±s

表4 干擾MMP11 表達(dá)能逆轉(zhuǎn)TGF?β1（5 ng/mL）對(duì)HA?VSMC 增殖的影響Tab.4 Interfering with MMP11 expression reversed the effects of TGF?β1（5 ng/mL）on HA?VSMC proliferation ±s

注：與5 ng/mL+si?NC 組比較，*P<0.05

分組5 ng/mL+si?NC 5 ng/mL+si?MMP11 t 值P 值MMP11 0.78±0.04 0.36±0.02*9.773 0.001 OD 值（490 nm）0.98±0.04 0.51±0.03*10.720<0.001 CyclinD1 0.79±0.04 0.45±0.02*8.193 0.001 PCNA 0.66±0.03 0.34±0.01*11.392<0.001

2.5 干擾MMP11表達(dá)能逆轉(zhuǎn)TGF?β1（5 ng/mL）對(duì)HA?VSMC膠原合成的影響見圖5和表5，5 ng/mL+si?MMP11組HA?VSMC的ColⅠ和ColⅢ蛋白水平均低于5 ng/mL+si?NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖5 干擾MMP11 表達(dá)能逆轉(zhuǎn)TGF?β1（5 ng/mL）對(duì)HA?VSMC 膠原合成相關(guān)蛋白的影響Fig.5 Interfering with MMP11 expression reversed the effects of TGF?β1（5 ng/mL）on HA?VSMC collagen synthesis related proteins

表5 干擾MMP11 表達(dá)能逆轉(zhuǎn)TGF?β1（5 ng/mL）對(duì)HA?VSMC 膠原合成的影響Tab.5 Interfering with MMP11 expression reversed the effects of TGF?β1（5 ng/mL）on HA?VSMC collagen synthesis ±s

表5 干擾MMP11 表達(dá)能逆轉(zhuǎn)TGF?β1（5 ng/mL）對(duì)HA?VSMC 膠原合成的影響Tab.5 Interfering with MMP11 expression reversed the effects of TGF?β1（5 ng/mL）on HA?VSMC collagen synthesis ±s

注：與5 ng/mL+si?NC 組比較，*P<0.05

分組5 ng/mL+si?NC 5 ng/mL+si?MMP11 t 值P 值ColⅠ0.59±0.04 0.31±0.02*6.718 0.003 ColⅢ0.52±0.03 0.26±0.02*7.797 0.002

3 討論

TGF?β是分子量為25 kDa 普遍存在的蛋白質(zhì)，在組織修復(fù)中起重要作用。資料顯示，TGF?β途徑與胸主動(dòng)脈瘤和VSMC 表型轉(zhuǎn)換有關(guān)［11］。TGF?β1已被報(bào)道可以誘導(dǎo)VSMC 增殖［12］，還可促進(jìn)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞、HA?VSMC 共培養(yǎng)后的ColⅠ、Col Ⅲ蛋白表達(dá)［13］，這與本研究中觀察到的0.1、1、5 和10 ng/mL 濃度TGF?β1 提高增殖活性、上調(diào)增殖蛋白CyclinD1、PCNA 水平和ColⅠ、Col Ⅲ蛋白水平相吻合，提示TGF?β1 能夠促進(jìn)HA?VSMC 的增殖和膠原合成。

MMP 在調(diào)節(jié)多種不同類型細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生理過程中發(fā)揮重要作用［14-15］。在胸主動(dòng)脈瘤中，彈性蛋白、膠原蛋白和糖胺聚糖的含量減少，活性MMP及其抑制劑的數(shù)量失衡是造成這些變化的主要原因［16］。MMP?11 最早發(fā)現(xiàn)于乳腺癌［17］，通過增加增殖和減少凋亡來促進(jìn)乳腺腫瘤早期生長(zhǎng)［18］。根據(jù)報(bào)道，MMP11 是胰腺導(dǎo)管腺癌的腫瘤啟動(dòng)子［19］，MMP11 耗竭嚴(yán)重?fù)p害肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［20］。在SELVEY 等［21］測(cè)試的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物中，白介素1β、TGF?β、纖連蛋白和膠原V 處理48 h，使MMP?11 表達(dá)增加。本研究檢測(cè)到了相同的情況，即0.1、1、5 和10 ng/mL 濃度TGF?β1 處理HA?VSMC 后，MMP11 蛋白、MMP11 mRNA 水平升高，提示TGF?β1 可誘導(dǎo)MMP11 表達(dá)。但MMP11 對(duì)TGF?β1 誘導(dǎo)的HA?VSMC 增殖與膠原合成的影響尚未可知。本研究利用siRNA 干擾MMP11 表達(dá)，結(jié)果表明，干擾MMP11 表達(dá)后，TGF?β1 促進(jìn)HA?VSMC 增殖與膠原合成的作用被部分逆轉(zhuǎn)，這表明MMP11 可能有助于TGF?β1 誘導(dǎo)HA?VSMC 的增殖與膠原合成，為胸主動(dòng)脈瘤診治的潛在靶點(diǎn)提供了新的見解，至于MMP11 發(fā)揮作用的機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。