陳旭昕 李虎明 唐儉 孟激光 韓志海

1中國人民解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學中心呼吸與危重癥醫(yī)學科（北京100048）；2中國人民解放軍總醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學部（北京100091）

彌漫性肺血管內(nèi)皮細胞損傷是急性肺損傷（acute lung injury，ALI）及急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）重要的病理特征。肺微血管內(nèi)皮細胞（pulmonary micro?vascular endothelial cell，PVEC）損傷后可導致肺泡毛細血管通透性增加及肺水腫的發(fā)生，其中氧化應(yīng)激是導致肺血管內(nèi)皮細胞損傷的重要機制之一［1-2］。研究［3-5］表明，骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow?derived mesenchymal stem cell，BM?MSC）對急性肺損傷具有保護作用。逆轉(zhuǎn)ALI/ARDS 中的氧化應(yīng)激失衡是MSC 發(fā)揮保護作用的重要機制，但肺損傷微環(huán)境中增高的氧化應(yīng)激水平也明顯制約了外部間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）的損傷修復(fù)作用［6］。血紅素加氧酶?1（Heme oxygenase?1，HO?1）是一種誘導性應(yīng)激蛋白，具有在病理狀態(tài)下穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境以及細胞保護功能［7］。HO?1 可通過減少活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生，減少組織脂質(zhì)過氧化以及促進抗氧化效應(yīng)元件來發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用［8］。上調(diào)BM?MSC 中HO?1 的表達，能否解除氧化應(yīng)激對于間充質(zhì)干細胞本身的影響，能否進一步提升MSC 對ALI 及靶細胞氧化應(yīng)激的保護作用有待進一步研究證實。因此，本研究擬利用Transwell 共培養(yǎng)體系，用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激PVEC，比較MSC 及HO?1 修飾的MSC 對PVEC 內(nèi)氧化應(yīng)激平衡，包括ROS含量、脂質(zhì)過氧化物（lipid peroxide，LPO）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平以及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH?PX）活性的影響，并探索MSC 調(diào)控PVEC 氧化應(yīng)激平衡可能的分子機制，以期為MSC 在ALI/ARDS 治療中的應(yīng)用提供更多的實驗室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑大鼠源性的BM?MSC 細胞由本室保存，HO?1 修飾的大鼠源性BM?MSC 即穩(wěn)定過表達HO?1 的MSC（MSC?HO?1）由本室建立，并完成細胞免疫表型及多能分化潛能鑒定［9］。人源性PVEC 細胞來源于美國模式培養(yǎng)物集存庫。LPS（Ecoil 0111：B4）及HO?1 活性檢測試劑盒購于美國Sigma。DMEM/F12 培養(yǎng)基和優(yōu)質(zhì)胎牛血清均購于GIBCO 公司。兔抗人HO?1 單克隆抗體、考馬斯亮藍蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒、RIPA 細胞裂解液、總蛋白提取試劑盒及活性氧（ROS）檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司。LPO、MDA 水平及SOD、GSH?PX 活性檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。兔抗人β?actin 多克隆抗體及辣根過氧化物酶標記的大鼠抗兔多克隆抗體（二抗）均購自Santa Cruz 公司。ECL?PLUS 發(fā)光試劑盒及蛋白Marker 均 購自Thermo Fisher 公 司。Transwell 細 胞共培養(yǎng)板（含0.4 μm 孔徑濾膜）購置美國康寧公司。其他生化試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.2 細胞培養(yǎng)大鼠BM?MSC、MSC?HO?1 及人源性PVEC 細胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為：37 ℃、5% CO2及95%濕度。隔1 d換液1次，2～3 d傳代1次。實驗用細胞均處于對數(shù)生長期。

1.3 細胞共培養(yǎng)及分組處理MSC 或MSC?HO?1與PVEC 細胞共培養(yǎng)于Transwell 共培養(yǎng)體系中。Transwell 體系的上室接種MSC 或MSC?HO?1（1 ×105/孔），而在下室接種PVEC（2 × 103/孔），建立共培養(yǎng)體系，培養(yǎng)條件同上。實驗共分4 組：A 組，PVEC+LPS 組，PVEC 細胞常規(guī)培養(yǎng)并給予終濃度為0.1 mg/mL 的LPS 刺激6 h［10］；B 組：PVEC/MSC+LPS 組，PVEC 細胞與MSC 共培養(yǎng)于Transwell 體系過夜后給予終濃度為0.1 mg/mL 的LPS 刺激6 h；C 組：PVEC/MSC?HO?1+LPS 組，PVEC 與MSC?HO?1細胞共培養(yǎng)于Transwell 體系過夜后給予終濃度為0.1 mg/mL 的LPS 刺激6 h；D 組：正常PVEC 組，常規(guī)培養(yǎng)PVEC 細胞并不予以任何處理。

1.4 PVECs 內(nèi)ROS 水平檢測采用DCFH?DA 法檢測細胞內(nèi)ROS 水平，根據(jù)上海碧云天生物公司活性氧檢測試劑盒說明書進行操作。各組共培養(yǎng)細胞，取出Transwell 嵌套，吸出下室培養(yǎng)液，加入0.25%胰蛋白酶消化PVECs，并加入小牛血清終止消化，PBS 洗滌兩次后離心收集PVECs；將活性氧檢測試劑盒中的DCFH?DA 按1∶1 000 無血清培養(yǎng)液稀釋，細胞樣本懸浮于稀釋好的DCFH?DA 中，調(diào)節(jié)細胞濃度為1 × 106/mL，37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，每隔5 min 輕輕顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸；用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞三次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH?DA；再用PBS 清洗2 次。流式細胞儀測量熒光強度（488 nm 激發(fā)波長，525 nm 發(fā)射波長），F(xiàn)lowjo 軟件分析數(shù)據(jù)。

1.5 PVECs 內(nèi)LPO、MDA 水平及SOD、GSH?PX活性檢測同上收集各組PVECs，采用硫代巴比妥酸法檢測LPO 及MDA 水平，采用黃嘌呤氧化法檢測SOD 活性，采用二硫代對硝基苯甲酸直接法檢測GSH?PX 活性，均按照南京建成生物工程研究所試劑盒附帶的說明書進行操作。蛋白濃度測定按碧云天生物技術(shù)公司說明書采用考馬斯亮藍法檢測PVEC 內(nèi)蛋白含量。

1.6 PVECs 內(nèi)HO?1 蛋白水平檢測同上收集各組PVECs，用總蛋白提取試劑盒提取細胞的總蛋白，考馬斯亮藍法檢測蛋白濃度后，以β?actin 為內(nèi)參照，取20 μg 樣品依次行SDS?PAGE 電泳、電轉(zhuǎn)至PVDF 膜，經(jīng)過脫脂牛奶封閉后，依次加入第一抗體、第二抗體，ECL 發(fā)光液中顯色。放入GBOX?HR 凝膠成像分析系統(tǒng)中進行攝像分析。

1.7 PVECs 內(nèi)HO?1 活性檢測同上收集各組PVECs，加入RIPA 細胞裂解液，收集上清，按照HO?1 活性檢測試劑盒操作。反應(yīng)總體積200 μL，加入還原型輔酶Ⅱ后反應(yīng)即開始，37 ℃避光反應(yīng)1 h 置于冰上終止反應(yīng)。用1 倍體積的氯仿萃取，獲得上清，采用分光光度計測定464 nm 和530 nm波長處的吸光度值，計算HO?1 活性。

1.8 統(tǒng)計學方法采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件進行分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK 檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MSCs?HO?1 共培養(yǎng)減少PVECs 中ROS 的產(chǎn)生在A組中，PVECs受LPS刺激后，PVECs內(nèi)ROS含量顯著增加，與其余組別相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；而與A 組相比，在B 組中即與MSC 共培養(yǎng)后，可減少LPS誘導的ROS生成，與MSC?HO?1共培養(yǎng)后（C 組），可進一步減少LPS 刺激的ROS 生成，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1、圖1。

圖1 流式細胞儀檢測各組PVECs 內(nèi)ROS 含量Fig.1 Analysisof the ROS levels in PVECs by flow cytometry

表1 各組PVECs 內(nèi)ROS 含量Tab.1 The intracellular accumulation of ROS in PVECs±s

表1 各組PVECs 內(nèi)ROS 含量Tab.1 The intracellular accumulation of ROS in PVECs±s

注：與A 組比較，*P<0.05；與B 組比較，#P<0.05；與D 組比較，△P<0.05

組別A 組（PVEC+LPS）B 組（PVEC/MSC+LPS）C 組（PVEC/MSC?HO?1+LPS）D 組（PVEC）F 值例數(shù)3 3 3 3 ROS（channel number）875.63±40.08△320.39±10.81*△123.50±16.48*#60.30±4.92*272.20

2.2 MSCs?HO?1 共培養(yǎng)減少PVECs 中LPO 及MDA 的產(chǎn)生在A 組中，PVECs 受LPS 刺激后，PVECs 內(nèi)LPO 及MDA 水平顯著增加，與其余組別相比差異均有統(tǒng)計學意義（P< 0.05）；而與A 組相比，在B 組中即與MSC 共培養(yǎng)后，可減少LPS 誘導的LPO 及MDA 的產(chǎn)生，而與MSC?HO?1 共培養(yǎng)后（C 組），可進一步減少LPS 刺激的LPO 及MDA 的產(chǎn)生，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2。

表2 各組PVECs 內(nèi)LPO 及MDA 水平Tab.2 The levels of LPO and MDA in PVECs±s

表2 各組PVECs 內(nèi)LPO 及MDA 水平Tab.2 The levels of LPO and MDA in PVECs±s

注：與A 組比較，*P<0.05；與B 組比較，#P<0.05；與D 組比較，△P<0.05

組別A組（PVEC+LPS）B組（PVEC/MSC+LPS）C組（PVEC/MSC?HO?1+LPS）D組（PVEC）F值例數(shù)3 3 3 3 LPO（nmol/gprotein）1.16±0.01△0.30±0.004*△0.22±0.02*#△0.11±0.02*842.83 MDA（nmol/gprotein）21.30±1.43△8.89±0.20*△3.17±0.70*#0.22±0.10*133.31

2.3 MSCs?HO?1 共培養(yǎng)增加PVECs 中SOD 及GSH?PX 的活性PVECs 給予LPS 刺激后，細胞內(nèi)SOD 及GSH?PX 活性顯著下降，與其余組別相比差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；而與A組相比，與MSC共培養(yǎng)后（B組），可增加SOD及GSH?PX 活性，而與MSC?HO?1 共培養(yǎng)后（C 組），可進一步提高SOD 及GSH?PX活性，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表3。

表3 各組PVECs 內(nèi)SOD 及GSH?PX 活性Tab.3 The activities of SOD and GSH?PX in PVECs ±s

表3 各組PVECs 內(nèi)SOD 及GSH?PX 活性Tab.3 The activities of SOD and GSH?PX in PVECs ±s

注：與A 組比較，*P<0.05；與B 組比較，#P<0.05；與D 組比較，△P<0.05

組別A組（PVEC+LPS）B組（PVEC/MSC+LPS）C組（PVEC/MSC?HO?1+LPS）D組（PVEC）F值例數(shù)3 3 3 3 SOD（U/mg protein）10.35±1.07△17.01±0.48*△36.97±2.10*#△50.30±0.59*218.770 GSH?PX（U/mg protein）28.60±8.20△151.89±1.72*△1 045.00±31.91*#△1 464.00±61.42*398.023

2.4 MSCs?HO?1 共培養(yǎng)促進PVECs 中HO?1 的表達正常PVECs 內(nèi)HO?1 蛋白表達相對較低，給予LPS 刺激后HO?1 的表達可顯著上調(diào)（A 組），差異有統(tǒng)計學意義（P< 0.05）；在B 組中，PVECs 內(nèi)HO?1 的表達被MSC 共培養(yǎng)上調(diào)，而與MSC?HO?1共培養(yǎng)后，PVECs 內(nèi)HO?1 的表達被進一步上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖2。

圖2 各組PVECs 內(nèi)HO?1 Western blot 分析Fig.2 Western blot analysis of HO?1 protein expression in PVECs

2.5 MSCs?HO?1 共培養(yǎng)促進PVECs 中HO?1 的活性正常PVECs 內(nèi)HO?1 活性相對較低（D 組），給予LPS 刺激后HO?1 的活性上調(diào)（A 組），差異有統(tǒng)計學意義（P< 0.05）；在B 組中，PVECs 內(nèi)HO?1的活性被MSC 共培養(yǎng)上調(diào)，而與MSC?HO?1 共培養(yǎng)后，PVECs 內(nèi)HO?1 的活性被進一步上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表4。

表4 各組PVECs 內(nèi)HO?1 活性比較Tab.4 The activities of HO?1 in PVECs ±s

表4 各組PVECs 內(nèi)HO?1 活性比較Tab.4 The activities of HO?1 in PVECs ±s

注：與A 組比較，*P < 0.05；與B 組比較，#P < 0.05；與D 組比較，△P<0.05

組別A 組（PVEC+LPS）B 組（PVEC/MSC+LPS）C 組（PVEC/MSC?HO?1+LPS）D 組（PVEC）F 值例數(shù)3 3 3 3 HO?1（pmol·mg?1·h?1）289.67±8.19△670.00±48.74*△1 100.00±57.73*#33.33±2.60*149.56

3 討論

氧化應(yīng)激是指機體內(nèi)氧化和抗氧化兩個系統(tǒng)失去平衡，當機體內(nèi)氧化系統(tǒng)增強或抗氧化系統(tǒng)減弱即會出現(xiàn)氧化應(yīng)激現(xiàn)象［11-12］。本研究結(jié)果顯示：與BM?MSC 比較，經(jīng)HO?1 修飾的BM?MSC（MSC?HO?1）可以進一步減輕LPS 誘導的PVEC 細胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，其機制可能與上調(diào)PVEC 細胞內(nèi)HO?1表達有關(guān)。

氧化系統(tǒng)主要包括ROS、LPO、MDA 和活性氮族等，抗氧化系統(tǒng)主要包括SOD、GSH?PX 和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶等［13］。生理情況下，ROS 等活性自由基具有殺滅病原體、清除腫瘤細胞和凋亡細胞的作用，但如果在病理狀態(tài)下，ROS 等產(chǎn)生過量，同時抗氧化系統(tǒng)無法抵消時就會引發(fā)氧化應(yīng)激，繼而導致細胞、組織損傷。在ALI/ARDS 的發(fā)生發(fā)展過程中，氧化應(yīng)激會導致肺血管內(nèi)皮細胞凋亡、損傷，從而使肺的毛細血管通透性增加，引發(fā)肺水腫及頑固性低氧［14-15］。本研究表明，PVEC 與MSC 共培養(yǎng)后可以減少LPS 誘導的ROS、LPO 及MDA 的產(chǎn)生，并增加抗氧化物質(zhì)SOD 及GSH?PX 的活性。而PVEC 與經(jīng)HO?1 修飾的BM?MSC 即MSC?HO?1共培養(yǎng)后，則可以進一步減少LPS誘導的ROS、LPO及MDA 的產(chǎn)生，并進一步增加抗氧化物質(zhì)SOD 及GSH?PX 的活性。這一結(jié)果提示MSC?HO?1 與MSC相比，MSC?HO?1 對改善LPS 誘導PVEC 細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的改善作用更為明顯，具體表現(xiàn)為進一步抑制了氧化物質(zhì)的產(chǎn)生并進一步促進了抗氧化物質(zhì)的生成。

血紅素加氧酶系統(tǒng)包括三種異構(gòu)體，即HO?1、HO?2 及HO?3［16］。與其他HO 異構(gòu)體不同，HO?1 是屬于誘導應(yīng)激蛋白，能被氧化物質(zhì)及炎癥因子誘導表達［16］。內(nèi)源性的HO?1 廣泛表達于多種細胞內(nèi)，具有維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及細胞保護作用，在過度炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)的疾病中起著重要的作用［17-18］。研究表明，過表達HO?1 可以減少細胞因子及ROS的產(chǎn)生，從而減少中性粒細胞浸潤及拮抗氧化應(yīng)激反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，給予LPS 刺激后可以誘導PVEC 細胞內(nèi)HO?1 表達增加，這屬于細胞正常的應(yīng)激反應(yīng)。而與MSC 及MSC?HO?1 共培養(yǎng)后，可進一步上調(diào)PVECs內(nèi)HO?1的表達，而MSC?HO?1共培養(yǎng)可使PVECs 內(nèi)HO?1 表達上調(diào)更為明顯。MSC 的旁分泌機制目前被認為是其發(fā)揮細胞保護作用及免疫調(diào)控效應(yīng)的主要機制，如何通過基因修飾增強MSC 的旁分泌效應(yīng)是近年的研究熱點［19］。HO?1 屬于非外泌性蛋白，其增強MSC 旁分泌效應(yīng)的機制尚不清楚，可能與促進白介素?10、肝細胞生長因子及角質(zhì)化細胞生長因子的外泌有關(guān)［9-10］。這些細胞因子可作用于PVEC 而提升PVEC 抵抗氧化應(yīng)激的能力包括抑制氧化物質(zhì)及促進抗氧化物質(zhì)和應(yīng)激保護性蛋白HO?1 的表達。因此，筆者推測MSC?HO?1 調(diào)控PVEC 內(nèi)氧化應(yīng)激的機制可能與上調(diào)PVEC 中HO?1 表達相關(guān)。調(diào)控HO?1 表達所涉及的信號通路眾多，比如絲裂素活化蛋白激酶、蛋白激酶A、蛋白激酶C 和磷脂酰肌醇3?激酶等［20］，MSC?HO?1 到底通過分泌細胞因子以及通過何種信號通路上調(diào)PVECs 內(nèi)HO?1 的表達尚待進一步實驗研究。

ALI/ARDS，尤其內(nèi)毒素性ALI/ARDS 以炎癥失控及氧化應(yīng)激失衡為主要特征［9-10］，在惡劣的局部微環(huán)境中氧化應(yīng)激損傷成為制約MSC 發(fā)揮有益效應(yīng)的重要瓶頸［9］。過表達HO?1 可提升MSC“應(yīng)對”局部惡劣微環(huán)境的能力［20-21］，增強MSC 的旁分泌效應(yīng)進而發(fā)揮保護靶細胞的作用。本研究結(jié)果顯示，MSC?HO?1 可顯著改善LPS 誘導的PVECs 氧化應(yīng)激失衡，其機制可能與上調(diào)PVECs 內(nèi)HO?1 表達有關(guān)，具體的分子機制尚需進一步研究。