孫春霞 陳書坤 鄭磊

南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院檢驗科（廣州510515）

癌癥已經成為全球最嚴重的致死性疾病之一。據全球癌癥統(tǒng)計數據估計，2020年全球癌癥發(fā)病人數和死亡人數分別達到1 930 萬和1 000 萬［1］。研究［2］表明轉移和復發(fā)是癌癥患者死亡的主要原因，血行播散則是癌癥轉移和復發(fā)的主要途徑，因此檢測循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）對癌癥患者的轉移和復發(fā)的預測及療效監(jiān)測具有重要的臨床意義。CTCs 是由實體瘤脫落進入血液循環(huán)的腫瘤細胞，作為“液體活檢”的主要標本之一，具有無創(chuàng)、便捷和可實時監(jiān)測的特點，有助于實體瘤的早期檢測與預后評估，在個體化治療及療效監(jiān)測中具有重要臨床意義［3］。然而，CTCs 數量十分稀少，從數以萬計的血細胞中準確識別CTCs 成為了一項主要技術難題，極大阻礙其臨床應用［4］。目前，聯合多種上皮標志物及間質標志物檢測已經成為提高CTCs 檢出率的一個有效策略［5-6］，但該策略存在特異性不足的問題。因此，迫切需要開發(fā)特異性高的標志物，方便實體瘤外周血的CTCs 的鑒定。

本研究利用腫瘤細胞與血細胞脂質代謝水平差異的特點，使用原位鎖式探針雜交技術原位檢測腫瘤細胞和白細胞（WBC）的脂代謝相關基因PRKAA2 的差異表達，為PRKAA2 用于CTCs 的鑒定提供可靠的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系人肝癌細胞HepG2，宮頸癌細胞Hela，膠質瘤細胞U87 和前列腺癌細胞PC?3 均購自上海中科院細胞研究所細胞資源中心。

1.1.2 主要試劑與儀器LightCycler 480 實時熒光定量PCR 儀（瑞士Roche 公司）、倒置共聚焦熒光顯微鏡（日本尼康公司）、細胞涂片離心機（中國上海盧湘儀離心機儀器有限公司）、FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix（中國Tiangen 公司）、Fast?Fire qPCR PreMix（中國Tiangen 公司）、Ampligase?DNA Ligase（美國Lucigen 公司）、Rnase H，Rever?taid H Minus Rt Ea，Ribolock Rnase Inhibitor Ea，Phi29 DNA Polymerase Ea（美國Thermo Fisher Scien?tific 公司）、LymphoprepTM（加拿大Stemcell 公司）、qRT?PCR 引物（中國BGI 公司）、原位雜交引物和探針（中國BGI 公司）、CellTrace CFSE Cell Prolifer?ation，CFSE，Slowfade gold antifade reagent，2?（4?Amidinophenyl）?6?indolecarbamidine dihydrochlori?de，DAPI（美國Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.1.3 引物和探針原位鎖式探針實驗的熒光檢測探針來源于文獻［7］，引物和檢測探針使用Inte?grated DNA technology 網 站（https：//sg.idtdna.com/pages）進行設計，并在Blastn（https：//blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi）網站的refseq_rna 數據庫中行序列比對以獲取特異性的引物（引物，鎖式探針和檢測探針序列見表1-2）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)使用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，并將細胞置于37 ℃、5% CO2孵箱中，待細胞匯合度為80%～90%時采用0.25%胰蛋白酶消化收獲細胞。

1.2.2 提取WBC按照說明書使用Lymphoprep試劑提取健康體檢者外周血WBC，具體操作如下：在15 mL離心管中加入Lymphoprep分離液2 mL，取2 mL 3%FBA?PBS 稀釋等量全血，稀釋后血液疊加在Lymphoprep分離液上，1 200 g離心10 min后棄上清，3%FBS?PBS 離心洗滌后收集WBC 沉淀。

1.2.3 腫瘤細胞和WBC 的PRKAA2 mRNA 定量檢測按照TRIZOLTM 試劑說明書步驟分別抽提腫瘤細胞和WBC 的總RNA。使用FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒逆轉錄RNA，取1 μg RNA 合成cDNA。采用FastFire qPCR PreMix試劑盒用于qRT?PCR 反應，反應體系為20 μL。引物序列見表1，GAPDH 作為內參基因。反應程序如下：95 ℃預變性1 min；95 ℃變性5 s，60 ℃退火/延伸15 s，共40個循環(huán)。使用LightCycler 480實時熒光定量PCR儀檢測樣本熒光信號。使用2?ΔΔCT法計算基因相對表達量。

表1 熒光定量PCR 引物序列Tab.1 Primer sequences of fluorescence quantitative PCR

1.2.4 原位鎖式探針雜交實驗（1）制片：摻入實驗中，將對數生長期的腫瘤細胞消化成單個細胞，加入終濃度為5 μmol/L 的細胞追蹤染料CFSE（溶于1 mL PBS 中）后37 ℃水浴20 min，加5 mL 完全培養(yǎng)基37 ℃水浴30 min，PBS 清洗3 次，獲取細胞沉淀。腫瘤細胞、WBC和WBC混合CFSE標記腫瘤細胞置于細胞甩片離心機，1 600 r/min 離心3 min，制成細胞玻片樣本，3.7%多聚甲醛固定10 min，-20 ℃冰箱保存。（2）雜交實驗：詳細過程參照文獻［9］，主要程序包括以下步驟：（1）加入Revertaid H minus RT 酶逆轉錄體系，45 ℃孵育3 h；（2）加入Rnase H，Ampligase?DNA Ligase 酶體系37 ℃孵育30 min，45 ℃孵育45 min；（3）加入Phi29 DNA polymerase 酶體系室溫滾環(huán)擴增過夜；（4）加熒光標記檢測探針置于37 ℃孵箱雜交30 min；（5）最后用1∶5 000 DAPI 復染細胞核，再滴加Slowfade gold antifade reagent 抗淬滅封片劑封片，4 ℃保存；（6）共聚焦熒光顯微鏡成像和分析。

1.3 統(tǒng)計學方法使用SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計分析，數據采用均數±標準差表示，正態(tài)分布兩組均數比較采用t檢驗，方差不齊時則采用校正t檢驗。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

表2 原位鎖式雜交實驗的引物和探針序列Tab.2 Primer and probe sequences for in situ padlock hybridization experiments

2 結果

2.1 PRKAA2 在WBC 與多種腫瘤細胞中的表達水平THPA 數據庫（https：//www.proteinatlas.org/）的RNA 測序數據［8］顯示PRKAA2 基因在WBC 中幾乎不表達（圖1A）。應用qRT?PCR 實驗，驗證該基因在HepG2、U87、Hela、PC?3 細胞系和WBC 中的表達差異，結果見圖1B、表3，HepG2、U87、Hela和PC?3 細胞系中的PRKAA2 mRNA 水平顯著高于WBC，差異具有統(tǒng)計意義（均P<0.05）。

圖1 PRKAA2 在WBC 與多種腫瘤細胞系中的表達水平Fig.1 The mRNA level of PRKAA2 in WBC and multiple tumor cell lines

表3 PRKAA2 mRNA 在Hela、U87、PC?3、HepG2 和WBC細胞中相對表達量（2?ΔΔCT）Tab.3 PRKAA2 mRNA levels in Hela，U87，PC?3，HepG2 cancer cells and WBC（2?ΔΔCT）±s

表3 PRKAA2 mRNA 在Hela、U87、PC?3、HepG2 和WBC細胞中相對表達量（2?ΔΔCT）Tab.3 PRKAA2 mRNA levels in Hela，U87，PC?3，HepG2 cancer cells and WBC（2?ΔΔCT）±s

注：P 值均為與WBC 比較所得

?ΔΔCT 樣本WBC Hela U87 PC?3 HepG2 PRKAA2（2）1.12±0.73 429.40±109.6 206.18±15.5 57.11±7.67 778.70±156.9 P 值0.002 0.002<0.001 0.013

2.2 PRKAA2 基因在HepG2、U87、Hela、PC?3 細胞中特異性高表達使用ACTB基因作為陽性對照，原位鎖式探針技術檢測HepG2、U87、Hela、PC?3 細胞系和WBC的PRKAA2 mRNA，結果見圖2，HepG2、U87、Hela 和PC?3 細胞顯示為DAPI+/PRKAA2+/ACTB+，而WBC 顯示為DAPI+/PRKAA2-/ACTB+，表明PRKAA2 基因在HepG2、U87、Hela 和PC?3 細胞中特異性高表達。

圖2 腫瘤細胞HepG2、Hela、U87、PC?3 與WBC 的PRKAA2 mRNA 信號熒光圖 標尺：10 μM（放大倍數400×：目鏡10×，物鏡40×）Fig.2 Fluorescent images of PRKAA2 mRNA in cancer cells（HepG2，Hela，U87，PC?3）and WBC（magnification power：400×：eyepiece 10×，objective 40×）

2.3 檢測PRKAA2mRNA 熒光信號可準確鑒定腫瘤細胞實驗采用原位鎖式探針雜交技術檢測PRKAA2 以識別CTCs。HepG2、U87、Hela 和PC?3腫瘤細胞被預先標記CFSE 熒光染料并摻入1 mL健康體檢者外周血中以模擬臨床樣本，內參基因ACTB 作為陽性對照。結果見圖3，WBC（DAPI+/CFSE-）未檢測到PRKAA2 信號，而幾乎所有腫瘤細胞（DAPI+/CFSE+）均檢測到PRKAA2 信號。CFSE 和PRKAA2 在共聚焦熒光顯微鏡下實現良好的熒光信號共定位，表明檢測PRKAA2 mRNA 熒光信號可準確鑒定腫瘤細胞。

圖3 PRKAA2 mRNA 與CFSE 共定位熒光圖（放大倍數400×：目鏡10×，物鏡40×）Fig.3 Fluorescent images show co-localization of PRKAA2 mRNA and CFSE（magnification power：400×：eyepiece 10×，objective 40×）

3 討論

脂肪由磷脂、脂肪酸、甘油三酯、鞘脂、膽固醇和膽固醇酯等分子組成，是所有細胞膜的重要組成部分，也是特定條件下細胞的重要能量來源［9-10］。脂質代謝異常是眾多代謝性疾病，如心血管疾病、非酒精性脂肪肝、糖尿病、胰腺炎發(fā)生發(fā)展的關鍵因素［11-14］。越來越多的證據［15-17］表明，脂肪代謝異常即脂代謝重編程有利于癌細胞的存活、增殖、侵襲和轉移，在腫瘤惡性生物學行為中起著關鍵的作用。因此，靶向脂質代謝調節(jié)相關通路已成為一種新的抗癌策略［18-19］。

本實驗室長期致力于CTCs 的富集和鑒定的研究，經脂代謝基因芯片篩選發(fā)現PRKAA2 在肝癌細胞中的表達水平顯著高于WBC。本研究發(fā)現，除了肝癌細胞，在前列腺癌、宮頸癌、膠質瘤等細胞中其表達量均和WBC 有統(tǒng)計學差異，這和PRKAA2 的功能密切相關：PRKAA2 基因編碼腺苷酸活化蛋白激酶（AMP?activated protein kinase，AMPK）的α2 催化亞基蛋白，該蛋白通過磷酸化乙酰輔酶A 羧化酶1（ACC1）、磷酸化線粒體相關亞型ACC2 和介導轉運蛋白CD36 轉位到質膜，達到抑制脂肪酸合成、上調脂肪酸氧化水平、激活脂肪酸攝取的效果，從而在應激條件下維持腫瘤細胞的代謝穩(wěn)態(tài)［20］。由于腫瘤細胞與正常細胞的脂代謝差異，PRKAA2 作為一個潛在的“通用型”腫瘤細胞標志物的優(yōu)勢如下：（1）可從細胞代謝功能上直接辨別癌與非癌，特異性高；（2）不局限于某種特定腫瘤細胞，有望提高CTCs 檢測通量，并且省時、經濟。因此，PRKAA2 有望成為極具潛力的CTCs 鑒定標志物。

本研究使用的原位鎖式探針雜交技術整合了滾環(huán)擴增法，可在細胞原位檢測單個PRKAA2 mRNA 信號，具有靈敏度高、特異性強和信噪比高的特點［7］，為得到準確可靠的實驗結果提供堅實的技術保障。我們將腫瘤細胞摻入外周血模擬CTCs，采用原位鎖式雜交技術可視化檢測PRKAA2熒光信號，結果表明對PRKAA2 的熒光信號檢測可從大量背景WBC 中準確識別腫瘤細胞，為PRKAA2 用于CTCs 的鑒定提供理論基礎和技術保障。

總之，本研究初步證實，檢測標志物PRKAA2可特異鑒定多種類型的腫瘤細胞，并有望準確定量多種癌癥起源CTCs，對腫瘤的輔助診斷、治療檢測和預后評估等提供重要的臨床價值。然而，本課題局限于體外實驗，尚未進行體內實驗，后續(xù)的研究中會納入多腫瘤類型及擴大樣本量，來進一步驗證PRKAA2 作為泛癌CTCs 鑒定標志物的臨床應用價值。