劉軍剛 劉洋 哈慶

口腔癌是發(fā)生在頭頸部的常見的惡性腫瘤之一，其中鱗狀細胞癌為最常見的發(fā)病類型，約占90%左右，一般預(yù)后較差[1]。眾多基因在轉(zhuǎn)錄、翻譯等過程中發(fā)生改變，都可成為口腔癌發(fā)病的誘因[2]，miR-543在口腔鱗癌細胞中呈明顯的高表達，當miR-543過表達后，可明顯促進腫瘤細胞的增殖、侵襲與遷移，同時抑制細胞的凋亡[3]；使用miRCURY LNATM microRNA 數(shù)據(jù)庫對人口腔鱗癌細胞(oral squamous cell carcinomas,OSCC)細胞系中的癌基因miRNAs進行功能性篩選，鑒定出miR-361-3p對OSCC的生長抑制程度最大，靶向敲除miR-361-3p可能是一種有效的治療OSCC的方法[4]。自噬是一種機體的自我保護機制，是將自身代謝的細胞質(zhì)蛋白或細胞器一并吞噬，進入囊泡，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其包裹的內(nèi)容物的過程，使機體細胞得到穩(wěn)定的代謝與更新。當機體受到某些炎癥、輻射或有害物質(zhì)等侵害時，miRNAs的表達發(fā)生改變的同時，機體穩(wěn)定的自噬通路也受到破壞，部分自噬相關(guān)蛋白發(fā)生改變，影響病情的發(fā)生發(fā)展。有文獻發(fā)現(xiàn)miR-181c-5p在口腔癌細胞的表達明顯降低[5]，且在miRWalK 2.0數(shù)據(jù)庫中檢索到自噬基因Beclin1[6]為miR-181c-5p的潛在靶基因，Beclin1過表達在OSCC的侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后過程中起重要作用[7]。本實驗探究miR-181c-5p對口腔鱗癌的增殖和凋亡的影響以及可能的作用機制，為口腔鱗癌的早期診斷與基因治療開辟新的途徑。

1 材料與方法

1.1 主要材料 胎牛血清購自四季清生物技術(shù)公司；RPM1640培養(yǎng)基購自Gibco公司；CCK8購自美國Solarbio公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生物技術(shù)有限公司；TransLipid HL Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑購自北京全世金生物技術(shù)公司；雙熒光素酶檢測試劑盒購自Promega公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo公司；Beclin1、Bcl-2蛋白印記抗體購自Abgent公司；Annexin V-PE/7-AAD凋亡試劑盒購自上海碧云天公司，hsa-miR-181c-5p、Beclin1-3’UTR引物序列購自華大基因有限公司；miR-181c-5p模擬物(mimic)/抑制物(inhibitor)序列引物購自上海吉瑪公司。口腔鱗癌細胞株SCC-090、正?？谇火つぜ毎鹔OMF購自上海ATCC細胞庫。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養(yǎng)與處理：在37℃、5%CO2及飽和濕度的條件下，應(yīng)用10%胎牛血清的RPM1640培養(yǎng)基培養(yǎng)SCC-090及hOMF細胞。將細胞分裝于12孔板中，分為4組處理：正常細胞組：hOMF細胞；SCC-090組：SCC-090細胞不做任何處理；雷帕霉素組：SCC-090細胞中加入雷帕霉素100 ng/ml作用1 h；3-MA組：SCC-090細胞加入3-MA 20 nmol/L作用10 h。

1.2.2 miR-181c-5p含量的檢測：常規(guī)提取1.2.1中處理后的各組細胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后采用qRT-PCR法檢測miR-181c-5p的含量，試驗檢測結(jié)果應(yīng)用相對定量法(2-△△Ct)進行計算。

1.2.3 miR-181c-5p與Beclin1靶向作用的驗證

1.2.3.1 qRT-PCR檢測miR-181c-5p及Beclin1 mRNA的表達 實驗分組：空白對照組：未經(jīng)任何處理的SCC-090細胞；miR-181c-5p過表達組：miR-181c-5p mimic轉(zhuǎn)染后的SCC-090細胞；miR-181c-5p抑制表達組：miR-181c-5p inhibitor轉(zhuǎn)染后的SCC-090細胞。提取各組細胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后擴增miR-181c-5p及Beclin1 mRNA，試驗檢測結(jié)果應(yīng)用相對定量法(2-△△Ct)進行計算。

1.2.3.2 Western-blot檢測Beclin1蛋白表達量:培養(yǎng)SCC-090細胞，細胞按1.2.3.1的分組與處理后收集細胞，提取總蛋白，檢測各組細胞中Beclin1基因的蛋白表達，以GAPDH為內(nèi)參分析目的蛋白的表達情況。

1.2.3.3 雙熒光素酶基因檢測miR-181c-5p與Beclin1熒光表達量:培養(yǎng)293T細胞，將含有Beclin1野生型(Beclin1/Wild)的含有綠色熒光的質(zhì)粒和Beclin1突變型(Beclin1/Mut)的質(zhì)粒分別與miR-181c-5p mimic和miR-181c-5p inhibitor共轉(zhuǎn)染，以海蜃熒光素酶(PRL-TK)作為內(nèi)參，反應(yīng)48h后上機檢測。

1.2.4 CCK8檢測SCC-090細胞增殖:將培養(yǎng)好的SCC-090細胞分裝到96孔板中，以SCC-090細胞作為空白對照，分別向細胞中加入miR-181c-5p mimic及雷帕霉素100 ng/ml，分別于12、24、48和72 h后終止反應(yīng)，加入20 μl CCK8(5 mg/ml)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，應(yīng)用酶標儀檢測490 nm處的吸光度值。

1.2.5 細胞凋亡檢測:按1.2.4試驗分組處理細胞，PBS洗滌各組細胞，4℃離心機2 000 r/min離心5 min，分別加入5 μl Annexin V-PE及5 μl 7-AAD，混勻后避光放置20 min，加入250 μl的Binding Buffer后流式細胞儀檢測細胞凋亡率。同時應(yīng)用Western blot檢測各組中凋亡基因Bcl2的蛋白表達。

2 結(jié)果

2.1 雷帕霉素、3-MA刺激細胞后miR-181c-5p的表達 Real TimePCR檢測了hOMF、SCC-090細胞、雷帕霉素刺激后的SCC-090細胞及3-MA刺激后的SCC-090細胞中miR-181c-5p的表達情況，SCC-090細胞中miR-181c-5p的表達量較hOMF細胞中有所降低；而雷帕霉素刺激SCC-090細胞后，miR-181c-5p表達較未處理的SCC-090細胞組明顯升高；3-MA刺激SCC-090細胞后，miR-181c-5p表達量有所降低。見表1。

表1 4組細胞中miR-181c-5p表達量的比較

2.2 建立細胞模型并檢測miR-181c-5p及Beclin1 mRNA的相對含量 應(yīng)用miR-181c-5p mimic及inhibitor分別轉(zhuǎn)染SCC-090細胞，建立miR-181c-5p過表達及抑制表達的細胞模型，SCC-090細胞作為control，結(jié)果顯示miR-181c-5p mimic轉(zhuǎn)染后miR-181c-5p明顯升高,Beclin1 mRNA明顯降低；miR-181c-5p inhibitor轉(zhuǎn)染后miR-181c-5p表達量降低，Beclin1 mRNA有所升高。見表2。

表2 3組細胞中miR-181c-5p及Beclin1 mRNA表達量比較

2.3 Beclin1蛋白檢測結(jié)果 Western blot檢測各組蛋白的表達情況，結(jié)果顯示：與control組相比，miR-181c-5p mimic轉(zhuǎn)染細胞后，Beclin1蛋白表達有所降低；miR-181c-5p inhibitor轉(zhuǎn)染細胞后，Beclin1蛋白有所增加。見圖1，表3。

表3 3組細胞中Beclin1蛋白表達量比較

圖1 Beclin1的蛋白表達

2.4 熒光素酶活性檢測 Beclin1/Wild共轉(zhuǎn)染的細胞中，miR-181c-5p mimic的熒光量比miR-181c-5p inhibitor的熒光量降低近10倍；Beclin1/Mut分別與miR-181c-5p mimic和miR-181c-5p inhibitor共轉(zhuǎn)染，表達量無明顯變化。見表4。

表4 雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果

2.5 miR-181c-5p及雷帕霉素對細胞增殖的影響 與SCC-090對照組相比，miR-181c-5p過表達組及雷帕霉素組的SCC-090細胞在轉(zhuǎn)染12 h、24 h、48 h及72 h 后，細胞增殖明顯被抑制。見表5。

表5 3組細胞不同時間點細胞增殖比較

2.6 miR-181c-5p及雷帕霉素對細胞凋亡能力的影響 應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測雙染后的細胞凋亡率。miR-181c-5p組細胞凋亡比率明顯高于空白對照組(P<0.05)，雷帕霉素組細胞凋亡率也高于空白對照組(P<0.05)，miR-181c-5p組細胞凋亡更為明顯。見圖2，表6。

圖2 細胞凋亡率(R5與R7分別是早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞)

表6 3組細胞細胞凋亡比較

2.7 Western blot檢測凋亡基因Bcl2的表達 與control組相比，miR-181c-5p mimic組及rapamycin組的Bcl-2蛋白表達條帶明顯變淡(P<0.05)。見表7，圖3。

圖3 Bcl-2的蛋白表達

表7 3組細胞中Bcl-2蛋白表達量比較

3 討論

OSCC是發(fā)生在口腔內(nèi)的最常見的腫瘤類型,每年近50萬的患者診斷為口腔鱗癌[8]。已有大量報道OSCC與口腔鱗癌的病情、治療及預(yù)后存在相關(guān)性，如miR-92a在OSCC中明顯高表達，在裸鼠體內(nèi)，miR-92a通過抑制FOXP1的表達促進腫瘤生長并改變腫瘤細胞的生長周期[9]；miR-186在OSCC原代細胞、Tca8113及SCC-25等細胞系中均有不同程度的過表達，且miR-186可抑制癌基因PTPN11(Protein Tyrosine Phosphatase Nonreceptor 11)，進一步影響蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2的編碼[10]；miR-21作為一種公認的致癌基因，在口腔癌Cal-27及SCC-090細胞系中其可靶向作用PDCD4基因的表達，調(diào)控PI3K/Akt/FOXO1信號通路，抑制腫瘤細胞的凋亡[11]；miR-99b-3p與miR-100-5p也被作為OSCC的新的預(yù)后標志物，miR-99b-3p升高，OSCC有晚期進展的趨勢，而miR-100-5p表達升高，則患者生存率明顯下降[12]。

自噬是一種自身的代謝途徑，持續(xù)保護機體的穩(wěn)定；Beclin1基因作為一種重要的自噬調(diào)控基因[13]，其過表達可明顯促進OSCC的侵襲和腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移，直接影響患者的預(yù)后[7]；Beclin1可參與自噬的啟動；可與PI3K(Ⅲ型磷酸肌醇激酶)及p150相結(jié)合，形成自噬體，激活其他的ATG蛋白，有效的調(diào)控機體自噬的發(fā)生。當自噬抑制劑3-MA抑制Beclin1等自噬基因表達后，可明顯抑制細胞的增殖，康普瑞汀(Combretastin A4,CA)作為一種可以誘導細胞自噬的化療藥物，當Beclin1等自噬基因降低時可明顯增強其對腫瘤的化療效果[14]。Qiu等[15]以口腔鱗癌細胞系SCC-090作為目的細胞，證實丹參酮Ⅱa(Tanshinone IIA,TAN)可通過激活自噬Beclin-1/Atg7/Atg12-Atg5信號通路，并抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，參與口腔鱗癌細胞的凋亡，發(fā)揮其抑制腫瘤的作用。細胞質(zhì)高遷移率族蛋白B1(Cytoplasmic high mobility group box 1，HMGB1)是一種自噬調(diào)節(jié)因子，HMGB1與Beclin1形成復合物，當口腔鱗癌發(fā)生耐藥后，該復合物的表達明顯增加[16]。

本課題從miRNA和自噬的視角研究口腔鱗癌發(fā)病機制。實驗結(jié)果顯示miR-181c-5p表達量升高；當3-MA抑制細胞自噬后,miR-181c-5p表達量降低，說明miR-181c-5p參與SCC-090細胞的自噬反應(yīng)；qRT-PCR檢測結(jié)果證實miR-181c-5p mimic可明顯上調(diào)其表達，miR-181c-5p inhibitor明顯抑制了其表達；miR-181c-5p過表達后，Beclin1 mRNA及蛋白的表達明顯降低，而miR-181c-5p表達降低后，Beclin1的mRNA及蛋白的水平反而升高，說明miR-181c-5p與Beclin1基因之間呈反向抑制關(guān)系；熒光素酶檢測證明，miR-181c-5p與Beclin1之間是存在堿基互補關(guān)系的；最后通過細胞增殖實驗及細胞凋亡檢測發(fā)現(xiàn)，miR-181c-5p及雷帕霉素都可明顯抑制口腔鱗癌SCC-090細胞的增殖且促進細胞的凋亡，且miR-181c-5p的作用強度更明顯。因此我們推測miR-181c-5p可能通過調(diào)控細胞自噬基因Beclin1的表達影響口腔鱗癌的細胞增殖與凋亡，為口腔鱗癌的早期診斷與治療提供新的方向。