石晶晶，張 林，江飛焰，王 曉，馮 固

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，北京 100193）

植物獲取土壤養(yǎng)分由根系直接途徑（direct pathway）和菌根途徑（mycorrhizal pathway）兩個相互獨立的吸收途徑共同完成。叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，以下簡稱AM真菌）的一端定殖于植物根系皮層細胞內(nèi)，通過叢枝結(jié)構(gòu)與宿主植物進行物質(zhì)交換，另一端的根外菌絲穿越根際養(yǎng)分耗竭區(qū)，擴大根系吸收養(yǎng)分（例如磷）的空間范圍[1]，從而提高植物對土壤養(yǎng)分的利用率。植物體內(nèi)大約20%的光合產(chǎn)物分配至AM真菌體內(nèi)[2]，一部分用于AM真菌自身的生長代謝，另一部分以富含碳水化合物的形式從根外菌絲分泌至土壤中，菌絲分泌物中的低分子量有機物（包括果糖、葡萄糖、二聚糖、低聚寡糖、糖原和有機酸等）能夠誘導(dǎo)包括解磷細菌在內(nèi)的某些細菌類群在菌絲附近或表面定殖[3-4]，形成菌絲際細菌。菌絲際細菌利用來自宿主植物的光合產(chǎn)物生存，同時參與土壤有機氮礦化、磷形態(tài)轉(zhuǎn)化和生物周轉(zhuǎn)過程，并通過菌絲將礦質(zhì)養(yǎng)分元素運輸至植物體內(nèi)[5-7]。目前對菌絲際細菌的研究大多集中于描述菌絲際細菌的群落結(jié)構(gòu)及其影響因素[8-9]，而對于菌絲際細菌的生態(tài)功能了解較少。

生物固氮是氮素循環(huán)中的重要過程，也是自然生態(tài)系統(tǒng)中有效氮的主要來源，據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織統(tǒng)計，地球上結(jié)合態(tài)氮總量的70%來源于生物固氮[10]?？梢赃M行生物固氮的是固氮細菌和古細菌[11]，根據(jù)其與植物的關(guān)系，固氮菌可分為共生固氮菌、聯(lián)合固氮菌和自生固氮菌。固氮菌通過體內(nèi)固氮酶催化生物固氮過程，nifH基因是編碼固氮酶鐵蛋白的基因，也是普遍用于鑒定環(huán)境中固氮菌的分子印跡[12]。前人研究發(fā)現(xiàn)，菌絲際可能存在一些常見的固氮菌種類[13-14]，AM真菌的孢子中存在內(nèi)生固氮菌，可能通過與固氮菌共生從生物固氮中獲益，孢子內(nèi)生固氮菌可能在孢子萌發(fā)過程中遷移至菌絲表面，成為菌絲際固氮菌[15-16]。然而，在生態(tài)系統(tǒng)中，菌絲際是否存在固氮菌定殖及其固氮能力特點尚不清楚。由于生態(tài)系統(tǒng)中有效磷缺乏，限制植物和微生物的生長，如果菌絲際定殖的細菌同時具備固氮和解磷雙重功能，那將對菌根途徑獲取氮磷元素具有重要意義。但是，迄今尚未有類似的研究報道。

本研究的目的是在田間原位條件下，探究侵染玉米根系的AM真菌根外菌絲表面是否存在具有固氮能力的細菌定殖，這類細菌是否同時具備溶解土壤難溶性磷的能力，從而揭示菌絲際細菌的功能多樣性，為進一步理解菌根途徑對宿主植物氮磷營養(yǎng)的貢獻機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌絲收集

菌絲收集在福建省漳州市詔安縣正禾有機農(nóng)場（23°44′N，117°10′E）的酸性赤紅壤和北京市上莊實驗站（40°08′N，116°11′E）的石灰性潮土中進行，宿主植物均為玉米。福建漳州的赤紅壤中采用PVC（聚氯乙烯）管收集菌絲方式（圖1），在玉米根系附近土壤中埋入兩側(cè)帶有30 μm尼龍膜的PVC管（直徑10 cm，高度12 cm），根系不能通過但菌絲可以通過，并在PVC管內(nèi)放置0.45 μm的尼龍膜，使AM真菌菌絲能夠貼膜生長。埋入3個月后，將PVC管從田間取出，取出0.45 μm膜，剪碎后置于裝有滅菌水的培養(yǎng)皿中，在體視鏡（SZX7，OLYMPUS，日本）下用鑷子挑出菌絲。北京上莊的潮土中同樣采用PVC管（直徑15 cm，高度10 cm）方式收集菌絲，但無內(nèi)置0.45 μm的尼龍膜，PVC管中土壤為菌絲室土壤。埋入3個月后，將帶有尼龍膜的PVC管從田間取出，用無菌水清洗菌絲室土壤，然后過500目篩，收集足量的菌絲。將收集到的菌絲浸泡在無菌水中，在體視鏡下用鑷子挑取菌絲，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?，保存時間不超過一周。

1.2 菌絲表面可培養(yǎng)固氮菌分離與純化

本試驗中，將能夠在無氮培養(yǎng)基中生長的細菌定義為固氮菌，nifH基因檢測和固氮酶活性測定作為補充指標(biāo)。在體視鏡下用火焰灼燒滅菌過的鑷子挑取保存的AM真菌菌絲，放入分離篩選無氮培養(yǎng)基中，在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，在分離篩選無氮培養(yǎng)基上連續(xù)進行3代選擇培養(yǎng)，獲得固氮能力穩(wěn)定的細菌，然后在LB固體培養(yǎng)基（Luria-Bertani培養(yǎng)基）上進行分離純化，得到純菌落。對分離純化得到的菌株進行革蘭氏染色，在顯微鏡下放大1 000倍觀察細菌的顏色、形態(tài)和大小，操作步驟主要包括：涂片固定-結(jié)晶紫初染-碘液媒染-酒精脫色-番紅復(fù)染-油鏡觀察。呈紫色的為革蘭氏陽性菌，呈紅色的為革蘭氏陰性菌。

分離篩選無氮培養(yǎng)基組分（1 L體系）：20 g蔗糖（sucrose）、0.1 g磷酸氫二鉀（K2HPO4）、0.4 g磷酸二氫鉀（KH2PO4）、0.2 g七水合硫酸鎂（MgSO4·7H2O）、0.01 g氯化鈉（NaCl）、0.01 g氯化鐵（FeCl3）、0.002 g二水合鉬酸鈉（Na2MoO4·2H2O）、14 g瓊脂粉（agar powder）。

1.3 菌株鑒定

對分離篩選出的純化菌株進行細菌DNA提取、nifH基因檢測和16S rRNA基因測序，鑒定固氮菌株種類。首先使用細菌基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN，目錄號：DP302）提取固氮菌DNA，提取的DNA用超微量核酸蛋白分析儀（Biodropsis BD-1000，五洲東方，中國）檢測純度和濃度，–20 ℃保存。

nifH基因檢測采用巢式PCR進行兩輪擴增[17]。第一輪擴增反應(yīng)體系25 μL：2 μL DNA模板、12.5 μL Premix Taq、正反引物（PolR和PolF，見表1）各0.5 μL（10 μmol·L–1）、1 μL牛血清蛋白（0.1% BSA）、8.5 μL ddH2O。反應(yīng)過程：95℃預(yù)變性5 min；55℃退火30 s，72℃延伸30 s，94℃變性30 s，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min。第二輪擴增反應(yīng)體系50 μL：1 μL 第一輪擴增產(chǎn)物、25 μL Premix Taq、正反引物（PolR和PolF-GCb）各1 μL（10 μmol·L–1）、2 μL牛血清蛋白（1% BSA）、20 μL ddH2O。反應(yīng)過程：95℃預(yù)變性5 min；60℃退火30 s，72℃延伸30 s，94℃變性30 s，循環(huán)30次；72℃延伸10 min。

表1 本研究使用的引物 Table 1 Primers used in this study

16S rRNA基因測序前用16S通用引物擴增條帶。反應(yīng)體系25 μL：3 μL DNA模板、12.5 μL Premix Taq、正反引物各0.4 μL（100 μmol·L–1）、0.5 μL牛血清蛋白（0.1% BSA）、8.2 μL ddH2O。反應(yīng)過程：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性20 S，60℃退火20 S，72℃延伸75 s，循環(huán)35次；72℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物在北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成測序和拼接，將固氮菌16S rRNA基因序列在NCBI（美國國家生物技術(shù)信息中心）官網(wǎng)的 Blast程序（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中進行同源性比對分析，查找出14條相近的細菌16S rRNA基因序列，用MEGA軟件（版本5.2），采用Neighbor-joining方法（鄰接法），“p-distance”（p距離模型）方式，自展1 000次構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 菌株固氮酶活性測定

采用乙炔還原法測定固氮菌的固氮酶活性，具體方法為：首先在LB液體培養(yǎng)基中對菌株進行兩次活化，活化后的菌液經(jīng)過離心收集菌體，滅菌水清洗2～3次，用測酶活限氮培養(yǎng)基懸浮洗滌后的菌體，并調(diào)節(jié)OD值（λ = 600 nm）約為0.4，取3.2 mL菌液加入20 mL厭氧管，用抽真空裝置抽出空氣并充入氮氣，抽充6次以盡量排出管內(nèi)的氧氣，然后向厭氧管中注射1.68 mL的乙炔氣體，在37℃，220 r·min–1的條件下脅迫培養(yǎng)3～4 d，用微量進樣針取100 μL的管內(nèi)氣體注入氣相色譜儀（GC-2010 Plus，島津，日本）測定乙烯含量。完成乙烯測定后，使用考馬斯亮藍法測定菌體蛋白含量，計算得到固氮菌的固氮酶活性，單位為nmol·mg–1·h–1（nmol為C2H4單位，mg為菌體蛋白單位，h為脅迫培養(yǎng)時間單位）。

測酶活限氮培養(yǎng)基組分（1 L體系）：26 mg二水合氯化鈣（CaCl2·2H2O）、30 mg七水合硫酸鎂（MgSO4·7H2O）、0.33 mg 一 水 合 硫 酸 錳（MnSO4·H2O）、7.6 mg 二 水 合 鉬 酸 鈉（Na2MoO4·2H2O）、3.4 g磷酸二氫鉀（KH2PO4）、26.3 g十二水合磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）、36 mg檸檬酸鐵（C6H5O7Fe·xH2O）、4 g葡萄糖（glucose）、0.3 g谷氨酸（L‐Glutamic acid）、10 μg生物素（Biotin）、10 μg對氨基苯甲酸（C7H7NO2）。

1.5 菌株解磷能力檢測和分泌吲哚乙酸（IAA）能力測定

利用NBRIP固體培養(yǎng)基（National Botanical Research Institute's phosphate growth medium）通過平板溶磷圈法檢測固氮菌株的溶磷能力，具體方法為：首先在LD液體培養(yǎng)基中對菌株進行兩次活化， 活化后的菌液經(jīng)過離心收集菌體，滅菌水清洗2～3次，滅菌水懸浮洗滌后的菌體，并調(diào)節(jié)OD值（λ = 600 nm）約為0.4，吸取5 μL菌液滴加入NBRIP固體培養(yǎng)基的平板上，30℃恒溫培養(yǎng)2～3 d，測定菌落直徑（d）和溶磷圈直徑（D），并計算比值（D/d），比值大小反映菌株的溶磷能力。

利用Salkowski比色法[18]測定固氮菌株分泌IAA的能力，具體方法為：菌株活化、洗滌方法同上，用滅菌水懸浮洗滌后的菌體，并調(diào)節(jié)OD值（λ = 600 nm）約為0.4，取100 μL菌液加入20 mL King培養(yǎng)液，30℃，160 r·min–1培養(yǎng)3 d，將培養(yǎng)液離心，吸取2 mL上清，加入2 mL Salkowski比色液，在黑暗中靜置30 min，立即測定OD（λ = 530 nm）值，根據(jù)IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出菌株分泌IAA的量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均采用Excel 2016進行整理，采用SPSS 21.0進行數(shù)據(jù)分析。對固氮酶活性數(shù)據(jù)和分泌IAA能力數(shù)據(jù)先進行方差同質(zhì)性檢驗（Levene’s檢驗），隨后進行單因素方差分析和LSD法（最小顯著差異法）多重比較（P＜ 0.05）。采用MEGA軟件（版本5.2）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié) 果

2.1 菌絲表面分離篩選固氮菌的鑒定

本研究分離篩選出23株能夠在無氮培養(yǎng)基上生長的固氮菌株。進而提取其DNA進行了nifH基因檢測（圖2），一部分菌株擴增出400 bp左右的目標(biāo)條帶。隨后對固氮菌的16S rRNA基因序列進行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建（圖3），結(jié)果表明23株固氮菌屬于3個門下的9個不同屬（表2），在門水平上：Proteobacteria（13株，56.5%）相對豐度最高，其次是Actinobacteria（7株，30.4%），相對豐度最低的是Firmicutes（3株，13%）。在屬水平上：Brevundimonas（6株，26%）和Microbacterium（6株，26%）相對豐度最高，其次是Sphingomonas（4株，17.4%）、Paenibacillus（2株，8.7%）、Variovorax（1株，4.3%）、Xenophilus（1株，4.3%）、Hydrocarboniphaga（1株，4.3%）、Arthrobacter（1株，4.3%）和Bacillus（1株，4.3%）。

表2 菌絲表面篩選出的固氮菌及其所屬門屬 Table 2 N2-fixing bacteria isolated from the surface of AM fungal extraradical hyphae

2.2 固氮菌的固氮酶活性

利用乙炔還原法檢測了分離出的23株固氮菌的固氮酶活性，11株細菌檢測到固氮酶活性（圖4）。其中，類芽孢桿菌（Paenibacillus）ZZ-3和鞘脂菌（Sphingomonas）SZ-8的固氮酶活相對較高，分別為2.97和2.92 nmol·mg–1·h–1。節(jié)桿菌（Arthrobacter）ZZ-15和短波單胞菌（Brevundimonas）SZ-1的固氮酶活性相對較低，分別為0.096和0.095 nmol·mg–1·h–1。

2.3 固氮菌的解磷能力和分泌IAA能力

采用平板溶磷圈法定性檢測到12株固氮菌具有活化有機磷的能力（表3），其中類芽孢桿菌（Paenibacillus）ZZ-1解植酸鈣能力最高，D/d值為3.58 ± 0.22。11株固氮菌具有溶解難溶性無機磷的能力，其中類芽孢桿菌（Paenibacillus）ZZ-3解磷酸三鈣能力最強，D/d值為2.77 ± 0.13。8株固氮菌 同時具有解有機磷和難溶性無機磷的能力，并且解有機磷的能力高于解難溶性無機磷的能力。利用Salkowski比色法測定到16株固氮菌具有分泌IAA能力（圖5），其中類芽孢桿菌（Paenibacillus）ZZ-1分泌IAA能力最強，IAA分泌量為688 μg·mL–1，16株能夠分泌IAA的菌中包括11株檢測到固氮酶活性的細菌。

表3 平板法測定固氮菌株溶磷圈直徑和菌落直徑比值 Table 3 Ratio of the diameters of phosphorus solubilizing halo（D）and colony（d）of the N-fixing bacteria strains（mean±SE，n=4）

同時具備固氮酶活性、解有機磷、解難溶性無機磷和分泌IAA能力的菌株有6株（圖6），分別為短波單胞菌（Brevundimonas）SZ-13和SZ-14、微桿菌（Microbacterium）SZ-9、鞘脂單胞菌（Sphingomonas）SZ-8、類芽孢桿菌（Paenibacillus）ZZ-1和節(jié)桿菌（Arthrobacter）ZZ-15。

3 討 論

3.1 AM真菌菌絲際存在固氮菌定殖

AM真菌的菌絲際和孢子中普遍有細菌定殖[13，19]。研究表明，菌絲際存在解磷細菌、脫硫細菌、氨氧化細菌、反硝化細菌等功能細菌。AM真菌與這些功能細菌互作可促進有機形態(tài)磷、氮和硫的礦化，通過根外菌絲運輸至宿主植物體內(nèi)，同時對土壤礦質(zhì)元素循環(huán)轉(zhuǎn)化過程產(chǎn)生影響[5，20-24]。因此，菌絲際微生物研究成為近年來土壤學(xué)、植物營養(yǎng)學(xué)和微生物生態(tài)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點。但是在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中，AM真菌根外菌絲表面是否定殖有固氮菌，以及這些固氮菌種類和功能特點的相關(guān)研究尚未見報道。本研究從田間玉米菌根的根外菌絲表面分離篩選出23株分布于9個不同屬的固氮菌， 其中，11株細菌具有固氮酶活性；12株細菌具有活化有機磷的能力，11株細菌具有溶解難溶性無機磷的能力；16株細菌具有分泌IAA的能力，6株細菌同時具有固氮酶活性、解有機磷、解難溶性無機磷和分泌IAA的能力（圖6）。就總數(shù)而言，篩選到23株細菌確實不多。這可能是由于無氮培養(yǎng)基的選擇性過強，不適宜大多數(shù)細菌生長。此外，盡管樣品采自福建赤紅壤和北京石灰性潮土兩種不同類型的土壤，但是在結(jié)果分析中并未比較土壤類型所導(dǎo)致的差異。這是因為分離篩選出的菌株樣本量小，代表性不夠。進一步的工作需要在更多的植物-土壤系統(tǒng)中開展大樣本采樣和分離篩選。

3.2 菌絲際細菌對AM真菌具有重要作用

菌絲際細菌對AM真菌的促生作用很早就引起人們的關(guān)注，Hildebrandt等[25]發(fā)現(xiàn)類芽孢桿菌屬的細菌具有促進AM真菌形成孢子的作用。Mansfeld-Giese等[26]從侵染黃瓜根系的AM真菌Glomus intraradices的菌絲際分離細菌時發(fā)現(xiàn)，類芽孢桿菌屬細菌（Paenibacillusspp.）的分離菌株數(shù)量最多。Andrade等[27]從三種AM真菌（Glomus etunicatum、Glomus intraradices和Glomus mosseae）菌絲際土壤中分離得到的菌株大多是節(jié)桿菌屬和芽孢桿菌屬細菌。Zhang等[28]采用高通量測序技術(shù)分析了田間條件下侵染玉米的AM真菌菌絲際細菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，根瘤桿菌屬的細菌相對豐度最高，相對豐度在50%以上。本研究從田間玉米菌根根外菌絲表面分離篩選到的菌株中，相對豐度最高的是短波單胞菌屬（6株，26%）和微桿菌屬細菌（6株，26%），同時也分離到2株類芽孢桿菌（ZZ-1和ZZ-3）、1株芽孢桿菌（ZZ-6）和1株節(jié)桿菌（ZZ-15），相對豐度分別為8.7%、4.3%和4.3%（表2）。其中，類芽孢桿菌屬細菌的固氮能力、解磷能力和分泌IAA能力均較強。這表明，類芽孢桿菌與AM真菌之間存在較為緊密的聯(lián)系，可能在AM真菌生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。此外，采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法獲取菌絲際細菌有一定局限性，不能很好地反映菌絲際的優(yōu)勢菌群，結(jié)合不依賴培養(yǎng)的測序方法可更好地認識和理解菌絲際細菌的群落組成。

3.3 菌絲際固氮菌與根際固氮菌有一定的差異和共同點

禾本科植物根際的自生和聯(lián)合固氮菌對植物的氮營養(yǎng)有顯著的貢獻。水稻根際的聯(lián)合固氮菌貢獻率占植物全氮的20%～25%[29-30]，聯(lián)合固氮菌對甘蔗的氮貢獻可達60%[31]。玉米根際存在聯(lián)合固氮菌和自生固氮菌定殖，常見固氮菌有腸桿菌（Enterobacterspp.）、拉恩氏菌（Rahnella aquatilis）、類芽孢桿菌（Paenibacillus azotofixans）、芽孢桿菌（Bacillus circulans）、固氮螺菌（Azospirillumspp.）、草螺菌（Herbaspirillum seropedicae）和克雷伯氏菌（Klebsiellasp.）[32-33]。本研究從侵染玉米根系的AM真菌根外菌絲表面分離篩選到的固氮菌中，包括玉米根際常見的類芽孢桿菌和芽孢桿菌，此外，還分離出玉米根際不常見的短波單胞菌屬（Brevundimonas）、微桿菌屬（Microbacterium）和鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）細菌（圖3），這表明AM真菌菌絲表面定殖的固氮菌與根際定殖的固氮菌種類存在一定的差異。固氮菌對不同碳源的感知和趨化不同[34]，因此，菌絲分泌物與根系分泌物組成成分的差異可能是造成根際和菌絲際固氮菌種類差異的原因[27]。禾本科植物根際的固氮菌通過生物固氮和促生作用兩種方式對宿主氮營養(yǎng)做出貢獻[35]。本試驗篩選到的固氮菌中包括類芽孢桿菌屬、芽孢桿菌屬、節(jié)桿菌屬和短波單胞菌屬的細菌，這些屬的細菌被報道具有促生能力[17]，因此，本研究對篩選菌株進行了分泌IAA能力的測定，發(fā)現(xiàn)16株固氮菌具有分泌IAA的能力，并且類芽孢桿菌屬的菌株分泌IAA能力最強，為688 μg·mL–1（圖5）。這表明AM真菌菌絲表面的固氮菌也可能同時發(fā)揮固氮作用和促生作用。

3.4 菌絲際細菌的多重功能性具有重要意義

自然界土壤中有效氮磷濃度和含量有限，是植物和土壤微生物生長的重要限制因素。菌絲表面同時定殖具有固氮、解磷和促生能力的細菌，甚至同一菌株兼具上述三種能力，這體現(xiàn)了菌根途徑微生物組的功能多樣性。菌絲際細菌同時具備固氮和解磷功能至少有如下益處：（1）增強細菌自身對環(huán)境的適應(yīng)性（低磷低氮水平的土壤），維持細菌群落的穩(wěn)定[36]；（2）多功能性的菌絲際細菌與AM真菌互作可更好地發(fā)揮對宿主植物營養(yǎng)狀況的改善作用。例如，在土壤有效氮水平較低時，細菌通過生物固氮作用獲取氮素，并可能將固定的氮以NH4+的形式分泌出來，被菌絲吸收，進而通過菌絲運輸至宿主植物體內(nèi)；在土壤有效磷水平較低時，細菌通過分泌有機酸或者磷酸酶活化難溶性無機磷和有機磷，促進AM真菌根外菌絲對磷的獲取和吸收，進而起到改善宿主植物磷營養(yǎng)狀況的作用；（3）菌絲表面的細菌可沿菌絲移動[37]，遷移至養(yǎng)分斑塊活化有機氮、有機磷和難溶性無機磷，增強菌絲對養(yǎng)分的吸收和利用率；部分細菌則可能遷移至根際，成為根際促生菌，直接發(fā)揮促進植物生長的作用。

4 結(jié) 論

農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中的AM真菌根外菌絲表面普遍存在多種固氮菌定殖，這些固氮菌具有固氮解磷雙重功能，并且大多具有分泌IAA的促生能力。宿主植物、AM真菌和菌絲際細菌三者之間可能存在協(xié)同作用，菌絲際細菌在AM真菌生長發(fā)育過程，以及AM真菌與宿主植物交換營養(yǎng)物質(zhì)過程中發(fā)揮重要作用，在作物生產(chǎn)中具有潛在的應(yīng)用價值。