唐修峰，秦 華，匡 璐，王欣欣，宋玉翔，高 豪，劉林夢，任 一，單 軍，張煥朝，王保戰(zhàn)，5?

（1. 南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，南京 210037；2. 土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點實驗室（中國科學(xué)院南京土壤研究所），南京 210008；3. 浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國家重點實驗室，杭州 311300；4. 上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，上海 201318；5. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京 210095）

硝化作用被認(rèn)為是全球氮循環(huán)的關(guān)鍵步驟，是由微生物驅(qū)動通過亞硝酸根，將氨氧化成硝酸根的過程[1]。而氮素作為森林生態(tài)系統(tǒng)中主要的限制性營養(yǎng)元素[2]，其硝化作用產(chǎn)生的硝酸鹽更易通過淋溶作用導(dǎo)致氮素流失和地下水污染等，此外硝酸根還可通過反硝化作用產(chǎn)生重要的溫室氣體氧化亞氮（N2O）。自1892年Winogradsky[3]發(fā)現(xiàn)氨氧化細菌（Ammonia-oxidizing bacteria，AOB）以來，人們一直認(rèn)為硝化過程由兩類微生物接力完成，分別為AOB催化的氨氧化過程和亞硝酸鹽氧化細菌（Nitrite-oxidizing bacteria，NOB）催化的亞硝酸氧化過程，其中氨氧化過程被認(rèn)為是硝化作用的限速步驟[4]。2005年，美國科學(xué)家David A. Stahl團隊[5]從海洋中分離出第一株氨氧化古菌（Ammonia- oxidizing archaea，AOA），證明除細菌外，古菌也能夠催化地球上的氨氧化過程。2015年，Daims[6]和van Kessel[7]等均發(fā)現(xiàn)了具有氨氧化活性的硝化螺旋細菌（Nitrospira），并證明其可將 4NH+氧化成NO3-，稱為完全硝化微生物（Complete ammonia oxidizer，comammox）。Comammox的發(fā)現(xiàn)打破了上百年來人們認(rèn)為硝化過程必須由兩類微生物接力完成的傳統(tǒng)觀念，使人們再次認(rèn)識到硝化微生物的物種多樣性和生理代謝機制的復(fù)雜。

酸性pH和低氨分子濃度是森林土壤的兩個重要特征。一般認(rèn)為酸性pH選擇了嚴(yán)格嗜酸group 1.1a-associated AOA類群[8-10]，且DNA-SIP（穩(wěn)定性同位素示蹤）實驗證明該類AOA主導(dǎo)了森林土壤氨氧化過程[11]。但也有一些研究發(fā)現(xiàn)group 1.1b AOA可存在于酸性土壤[1，12]，且能主導(dǎo)某些酸性農(nóng)田土壤氨氧化過程[13]，以及group 1.1b AOA在酸性森林土壤中也廣泛存在，且在轉(zhuǎn)錄組水平發(fā)揮了較高的活性[14-15]。盡管關(guān)于AOB適應(yīng)酸性pH及其相對應(yīng)的低NH3環(huán)境的機制目前多為推測[16-17]，但不少森林土壤中確實存在β-proteobacterium（β-變形菌門）中Nitrosospira（亞硝化螺旋菌）屬AOB，而Nitrosomonas（亞硝化單胞菌）AOB較少檢測到[18-20]。最近日本科學(xué)家又從pH 3.0左右的酸性茶園土壤中分離到耐酸γ-proteobacterium（γ-變形菌門）AOB菌株[21]，然而森林土壤中是否存在耐酸 γ-proteobacterium AOB仍不清楚。此外最近備受關(guān)注的comammox，其在森林土壤中生理生態(tài)的研究也剛剛起步，而已報道的comammoxamoA基因PCR引物易產(chǎn)生非特異性擴增，可能導(dǎo)致其基于實時熒光定量PCR（qPCR）的豐度被嚴(yán)重高估[22]。土壤總DNA宏基因組測序由于不受PCR引物偏好性等限制，因此在土壤氨氧化微生物amoA基因相對豐度和群落組成的研究中更具優(yōu)勢。

馬尾松林（Pinus massoniana）是我國南方廣泛分布的主要人工林之一，具有高經(jīng)濟價值、耐干旱貧瘠等特點[23]，其土壤為典型的酸性森林土壤。本文以浙江省建德市人工馬尾松林土壤為研究對象，綜合利用qPCR、凝膠電泳半定量和土壤總DNA宏基因組測序等手段，研究酸性森林土壤中AOA、AOB和comammox三種氨氧化微生物的豐度和群落組成等，以期加深對酸性森林生態(tài)系統(tǒng)中氨氧化微生物潛在生理生態(tài)學(xué)特征的認(rèn)識。

1 材料與方法

1.1 供試材料

土壤樣品于2017年4月采自浙江省建德市人工馬尾松林（119°28′E，29°48′N），該地區(qū)屬亞熱帶海洋型季風(fēng)氣候，海拔約200 m，年均氣溫17.4 ℃，年均降水1 600 mm。土壤類型為凝灰?guī)r發(fā)揮的紅壤，選擇3個林齡均為55年的馬尾松林（間隔約2 000 m），分別標(biāo)記為M1、M2和M3。五點法采集0～20 cm土壤，每個馬尾松林采集3個樣品，樣品分成兩份，一份保存于–20 ℃用于提取土壤總DNA，另一份4 ℃保存用于土壤理化性質(zhì)測定。

1.2 土壤理化性質(zhì)測定

土壤含水量采用烘干法。pH采用電位法測量，水土比為5∶1。有機碳含量通過濃硫酸-重鉻酸鉀法測定。全氮和堿解氮的含量分別采用半微量凱氏定氮法和堿解擴散法。有效磷測定采用0.05 mol·L–1HCl和0.025 mol·L–1（1/2H2SO4）浸提—鉬銻抗比色法。速效鉀測定采用乙酸銨浸提—火焰光度法。經(jīng)測定三個森林土壤pH為3.88～4.16，含水量173.1～203.4 g·kg–1，有機碳14.01～16.62 g·kg–1，全 氮 0.76～1.02 g·kg–1，堿 解 氮 123.24～142.81 mg·kg–1，有效磷6.34～10.49 mg·kg–1，速效鉀56.12～60.15 mg·kg–1。

1.3 土壤DNA提取

土壤微生物總DNA提取采用Fast DNA Spin kit for soil試劑盒（MP Biomedicals，美國）。根據(jù)試劑盒操作說明提取土壤微生物總DNA，并使用Nanodrop ND-1000 超微量分光光度計（NanoDrop Technologies，Wilmington，DE，美國）和1%的凝膠電泳檢測DNA濃度和質(zhì)量，將DNA于–20 ℃保藏。

1.4 實時熒光定量PCR和凝膠電泳半定量分析

利用美國伯樂公司CFX96實時熒光定量PCR儀（Bio-Rad Laboratories，Hercules，美國）對人工馬尾松林土壤中AOA、AOB和comammox的amoA基因進行定量分析。反應(yīng)體系為20 μL：10 μL SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa，日本），上下游引物0.5 μmol·L–1，2 μL（約1～10 ng）模板DNA，補充6 μL雙蒸水。qPCR引物和反應(yīng)條件見表1[22，24-26]。本實驗每個樣品設(shè)置三個重復(fù)，每個重復(fù)包含三個測試平行。將含有AOA、AOB和comammoxamoA基因的單克隆質(zhì)粒DNA梯度稀釋成101～109的標(biāo)準(zhǔn)濃度作為qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過瓊脂糖凝膠電泳檢查熒光定量PCR擴增產(chǎn)物的特異性。

表 1 定量PCR擴增引物及反應(yīng)條件 Table 1 Quantitative PCR amplification primers and their reaction conditions

本實驗和已報道研究[27]均發(fā)現(xiàn)目前已知的comammox的amoA基因PCR引物易導(dǎo)致非特異性擴增，致使amoA基因豐度高估。因此利用凝膠電泳半定量法對qPCR結(jié)果進行數(shù)值初步矯正。即通過1.2%凝膠電泳和Bio-Rad公司的Quantity one v4.6.6軟件檢測待測樣品qPCR產(chǎn)生的目標(biāo)條帶和非目標(biāo)的相對灰度值，從而計算目標(biāo)條帶占泳道中總灰度值的百分比，進而用該百分比乘以qPCR檢測結(jié)果，即得到樣品中comammox的amoA基因?qū)嶋H拷貝數(shù)。同時我們將進一步用宏基因組中AOA、AOB和comammox三種amoA基因相對豐度，以及AOA和AOB的amoA基因的qPCR結(jié)果，進一步進行計算驗證（見1.5）。

1.5 宏基因組測序和功能基因拼接及其相對豐度計算

委托上海美吉生物對土壤總DNA進行150 bp雙端測序（Illumina HiSeq 2 000）。每個樣品分別產(chǎn)生約48Gb的原始數(shù)據(jù)，然后通過SeqPrep（https：//github.com /jstjohn/SeqPrep）去除末端測序接頭（adaptor），然后利用Sickle（https：//github.com/ najoshi/sickle）以默認(rèn)參數(shù)對原始序列進行了質(zhì)量控制和過濾，三個樣品分別得到約42G bp高質(zhì)量數(shù)據(jù)。使用metaSPAdes（version 3.10）宏基因組拼接軟件對測序數(shù)據(jù)進行de novo從頭組裝，k-mer參數(shù)設(shè)置為21～53。使用Glimmer 3.0進行開放閱讀框（ORFs）預(yù)測。以NCycDB數(shù)據(jù)庫[28]中AOA和AOB的amoA基因以及Pjevac[22]、Daims[6]和Li[29]等文章中的comammox的amoA基因為參考序列，利用BLASTX與宏基因組拼接片段進行比對，提取Evalue ≤10–5且同源性高于70%的contigs作為amoA的候選序列，并進一步通過NCBI的nr數(shù)據(jù)庫注釋以及構(gòu)建amoA進化樹等手段進行驗證去除錯誤注釋的amoA基因序列。

分別采用兩種方法計算宏基因組中AOA、AOB和comammox的amoA基因相對豐度。第一種方法，基于Mapped到amoA基因的HiSeq reads數(shù)統(tǒng)計。第二種方法，統(tǒng)計宏基因組中參與三種amoAcontigs拼接所用的HiSeq reads數(shù)，reads數(shù)高低反映了該類基因的相對豐度高低。即根據(jù)amoA基因參考序列，通過BLASTX與原始reads進行比對，統(tǒng)計其中Evalue ≤10–5，同源性≥70%，blast hit區(qū)域大于25個氨基酸長度的reads數(shù)目，通過比較三種amoA基因mapping的reads總數(shù)，確定三者間的相對豐度。

1.6 系統(tǒng)發(fā)育進化樹構(gòu)建

首先通過MOTHUR軟件[30]按照95%序列同源性提取AOA、AOB和comammox的amoA基因的OTUs（operational taxonomic unit）代表性序列，然后利用MEGA 7.0軟件的最大似然法（Maximum likelihood）構(gòu)建三種氨氧化微生物amoA基因的進化樹。

2 結(jié) 果

2.1 AOA、AOB和comammox amoA 基因豐度

qPCR結(jié)果顯示酸性馬尾松林土壤中AOA和AOB的amoA基因豐度分別為2.61×106copies·g–1和1.45×106copies·g–1（圖1a）?；谝颪tsp-amoA- 162F/359R和引物comaA/B-244F/659R的qPCR結(jié)果顯示comammoxamoA基因拷貝數(shù)分別為4.14× 106copies·g–1和2.64×106copies·g–1。然而，凝膠電泳圖顯示兩組引物的qPCR結(jié)果均有明顯的非特異性擴增，導(dǎo)致comammox的amoA基因qPCR結(jié)果的高估（圖1a）。通過凝膠電泳和Quantity one v4.6.6對comammox的amoA基因目標(biāo)條帶進行半定量估算后，得到兩種引物擴增的comammoxamoA基因總拷貝數(shù)分別為 1.38×106copies·g–1和 1.47×106copies·g–1（圖1a）。因此，氨氧化微生物功能基因amoA的相對豐度，comammox：AOA為0.53～0.56；comammox：AOB為0.95～1.01（圖1a）。

基于宏基因組Mapped到amoA基因的HiSeq reads數(shù)目和參與amoAcontigs拼接的HiSeq reads數(shù)目分析發(fā)現(xiàn)，三類氨氧化微生物amoA基因相對豐度為：comammox：AOA約為0.55和0.29，comammox：AOB約為0.98和0.59（圖1b）。

2.2 AOA、AOB和comammox的系統(tǒng)發(fā)育和群落組成

目前AOA主要包括Nitrosopumilus（group 1.1a）、Nitrosotalea（group 1.1a-associated）、Nitrososphaera（group 1.1b）和Nitrosocaldus（ThAOA）[31]。宏基因組分析發(fā)現(xiàn)，馬尾松林AOA其主要類群為group 1.1b，約占AOA總豐度的85.66%～88.07%，其次為group 1.1a-associated，占11.93%～14.34%，未檢測到group 1.1a和Nitrosocaldus類群（圖2）。

AOB 主要分為 β-AOB（Nitrosospira和Nitrosomonas）和γ-AOB（Nitrosococcus，亞硝化球菌屬）[32]。其中Nitrosospira包含cluster 1～4、cluster 0、Nitrosospirasp. Nsp65和Nitrosospirasp. Nsp57/58等分支[33-34]。Nitrosomonas包含N. europaea/N. mobilis、N. communis、N. marina、N. oligotropha、N. cryotolerans、Nitrosomonassp. Nm143和cluster 5等分支[35]。宏基因組分析顯示，Nitrosospira是AOB的主要類群，占AOBamoA基因總豐度的51.71%～63.96%，主要隸屬于cluster 3、0和Nitrosospira-like（圖 3），而Nitrosomonas占 36.04%～48.29%，主要隸屬于Nitrosomonas communis和Nitrosomonas oligotropha（圖 3）。

目前報道的comammox均來源于Nitrospiralineage Ⅱ，且主要分為clade A和clade B兩支[6-7]，近期有研究將comammox clade A進一步分為兩個單系群，clade A.1和clade A.2[36]。土壤宏基因組分析發(fā)現(xiàn)，酸性森林土壤中comammox的主要類群為clade B，占comammoxamoA基因總豐度的63.39%～71.39%，此外clade A.1占總序列數(shù)的28.61%～36.61%，未檢測到clade A.2序列（圖4）。

3 討 論

馬尾松林土壤屬于典型酸性森林土壤。為了得到AOA、AOB和comammoxamoA基因準(zhǔn)確豐度，本研究同時使用了qPCR、凝膠電泳半定量和宏基因組三種方法進行數(shù)據(jù)比較分析。qPCR和宏基因組均表明AOAamoA基因豐度約為AOBamoA基因的兩 倍（圖1）。而comammoxamoA基因的兩套引物存在明顯的非特異擴增，該結(jié)果與Beach和Noguera[27]研究結(jié)果一致（圖1a）。通過凝膠電泳半定量對qPCR結(jié)果進行矯正以及宏基因組測序分析都發(fā)現(xiàn)，comammoxamoA基因拷貝數(shù)和AOB的amoA基因處于同一個水平，均為AOAamoA基因拷貝數(shù)的50%左右（圖1）。然而，目前comammox的qPCR 定量仍處于起步階段。而凝膠電泳半定量也存在一定缺陷，其反映是qPCR結(jié)束時目標(biāo)電泳條帶和非目標(biāo)電泳條帶的灰度值之比，無法真正反映qPCR反應(yīng)過程中特異擴增和非特異擴增釋放的熒光信號強度之比。此外，凝膠電泳半定量目標(biāo)條帶位置，仍可能包含非特異擴增的序列。而宏基因組技術(shù)目前成本較高，數(shù)據(jù)分析也較繁瑣。因此，仍需進一步發(fā)展comammoxamoA基因qPCR更有效的引物，或選擇comammox基因組中其他marker基因設(shè)計qPCR引物。

pH和NH3濃度是影響酸性土壤氨氧化微生物群落最重要的兩個環(huán)境因子。自首株嚴(yán)格嗜酸AOA菌株分離以來[8]，大量基于DNA-SIP實驗證據(jù)表明group 1.1a-assocaited AOA主導(dǎo)了很多酸性土壤的氨氧化過程[9，11，37]。然而我們發(fā)現(xiàn)group 1.1b AOA也可以在某些酸性土壤中發(fā)揮著主導(dǎo)作用[13]。James I. Prosser團隊[38-39]通過全球、區(qū)域和田塊三個尺度研究發(fā)現(xiàn)group 1.1b AOA也存在于酸性土壤中，且亞枝cluster 11被認(rèn)為嗜酸生長。本研究發(fā)現(xiàn)馬尾松林土壤中g(shù)roup 1.1b AOA占據(jù)數(shù)量上的優(yōu)勢，而group 1.1a associated僅占12%（圖2）。此外，酸性土壤中NH3而被大量離子化成NH4+，而目前認(rèn)為氨氧化微生物的底物為氨分子而非銨離子[40]，因此推測酸性土壤中g(shù)roup 1.1b AOA能夠適應(yīng)較低氨環(huán)境。

酸性土壤中AOB的貢獻長期以來一直存在較大爭議。在AOA發(fā)現(xiàn)前，一直認(rèn)為AOB驅(qū)動了酸性土壤的氨氧化過程。但后來發(fā)現(xiàn)分離于酸性土壤的Nitrosospira和Nitrosomonas純菌株都不能在實驗室內(nèi)的酸性pH條件下生長[16]。Prosser等[16-17]推測可能有三種原因：（1）土壤中存在微域中性或堿性pH環(huán)境；（2）AOB在土壤中形成生物膜或團聚體抵抗酸性pH；（3）很多AOB菌株具有尿素水解酶活性，能夠通過利用尿素抵抗（酸性土壤中）低氨脅迫。我們認(rèn)為第三種解釋可能混淆了酸性pH和低氨濃度兩種環(huán)境脅迫，通過利用尿素確實可以應(yīng)對低氨寡營養(yǎng)脅迫，但該AOB菌株能夠在酸性pH條件下生存，還必須同時能夠抵抗低pH脅迫。推測James I. Prosser等當(dāng)時實驗選擇的Nitrosospira純菌株本身能夠耐受酸性pH，它只需要在此基礎(chǔ)上通過利用尿素應(yīng)對低氨脅迫即可在酸性pH培養(yǎng)基中生長。這點可以通過Prosser等[16-17]兩篇文章中推測出來，五株來源于酸性土壤的AOB純菌株均可以利用尿素，但只有一株Nitrosospira菌株可以通過利用尿素在酸性pH培養(yǎng)基中生長。因此，利用尿素對以上來源于酸性土壤的五株AOB純菌株來說是適應(yīng)酸性pH的必要但非充分條件。2017年Hayatsu等[21]分離得到在不添加尿素條件下，能夠在酸性pH中生長的AOB純菌株γ-proteobacterium TAO100。然而目前β-proteobacterium AOB適應(yīng)酸性土壤的分子生物學(xué)機制仍不清楚。。

作為最新發(fā)現(xiàn)的comammox，其在地球各個生境中的分布規(guī)律備受關(guān)注。目前發(fā)現(xiàn)comammox在土壤、沉積物、灘涂、植物葉表、地下水、飲用水以及廢水處理系統(tǒng)均有分布[6-7，22，36]。本研究發(fā)現(xiàn)酸性森林土壤也存在豐度與AOB（每個AOB細胞平均含有1.5個拷貝的amoA基因）相當(dāng)?shù)腸omammox 類群（圖1），其中clade B占comammox總類群的64%，而clade A約占36%。該結(jié)果和已報到森林土壤中comammox群落組成基本一致[22，36]。不同的是，Xia等[36]發(fā)現(xiàn)森林土壤中clade A主要隸屬于clade A.2分支，而本研究發(fā)現(xiàn)馬尾松林土壤中clade A主要隸屬于clade A.1（圖4）。以上數(shù)據(jù)暗示comammox無論在clade B還是clade A類群中都存在能夠適應(yīng)酸性土壤環(huán)境的物種。Michael Wagner課題組[41]繼2015年發(fā)現(xiàn)第一株comammox純菌株后，也明確了已知的comammox純菌株對底物氨具有很高的親和力，其親和力高于所有已知AOB菌株和絕大部分土壤來源的AOA菌株，因此這可以從一定程度解釋comammox如何適應(yīng)酸性土壤中的低NH3脅迫。然而，comammox如何適應(yīng)酸性pH脅迫仍不清楚。

4 結(jié) 論

本文利用qPCR、凝膠電泳半定量和宏基因組測序等技術(shù)研究酸性森林土壤氨氧化微生物的群落結(jié)構(gòu)。qPCR顯示AOA和AOB的amoA基因豐度為2.61×106copies·g–1和 1.45×106copies·g–1。而comammoxamoA基因的擴增引物產(chǎn)生明顯的非特異性擴增，導(dǎo)致qPCR結(jié)果的高估。半定量和宏基因組分析發(fā)現(xiàn)，氨氧化微生物amoA基因相對豐度為：comammox：AOA=0.55，comammox：AOB=0.98，推算comammoxamoA基因真實豐度為（1.38～1.47）×106copies·g–1。此外，AOA主要類群為group 1.1b占其總豐度的88.07%，而經(jīng)典嗜酸類群group 1.1a-associated僅占11.93%。AOB主要類群為Nitrosospira（63.96%），而Nitrosomonas為36.04%。comammox主要類群為clade B（63.39%），而clade A僅占36.61%且均隸屬于clade A.1亞枝。

致 謝感謝浙江農(nóng)林大學(xué)孫凱和張云晴等同學(xué)在樣品采集和理化性質(zhì)測試中給予的幫助！