馬 靜，盧永強，張 琦，李肖肖，肖 棟，陳 浮?

（1. 中國礦業(yè)大學(xué)低碳能源研究院，江蘇徐州 221008；2. 中國礦業(yè)大學(xué)環(huán)境與測繪學(xué)院，江蘇徐州 221116；3. 中國礦業(yè)大學(xué)煤炭資源與安全開采國家重點實驗室，江蘇徐州 221116）

中國50%煤炭產(chǎn)能位于生態(tài)脆弱的黃土高原，采礦造成地表形變、沉陷、裂縫、滑坡，加劇了水土流失、植被衰減、土壤退化和生物多樣性銳減等問題[1-3]。采煤每年損毀土地達4.88萬hm2，累積損毀土地超 800萬hm2。全域生態(tài)空間修復(fù)是新時代生態(tài)文明建設(shè)的重大任務(wù)之一，但如此大規(guī)模的修復(fù)僅靠人工是無法實現(xiàn)的。為此，激發(fā)礦山生態(tài)系統(tǒng)的自恢復(fù)能力倍受關(guān)注[4]。土壤理化特征、種子庫、微生物等多因素決定了生態(tài)系統(tǒng)的自恢復(fù)能力，其中微生物對生態(tài)恢復(fù)起著重要的催化作用[5]。半干旱受損礦山由于缺水、土壤貧瘠和環(huán)境污染等問題，如僅實施植被重建、地形改造、土壤改良等工程，而離開微生物參與，則生態(tài)恢復(fù)潛力受限，恢復(fù)效果和速率差[1-3]。因此，礦山生態(tài)修復(fù)必須重視土壤微生物演替、生態(tài)過程及其恢復(fù)潛力。

微生物是生態(tài)系統(tǒng)的關(guān)鍵組分，在全球生態(tài)修復(fù)、環(huán)境監(jiān)測及污染治理、生物保護等方面具有重要的價值[6-7]。近幾年有關(guān)礦山土壤微生物的研究明顯增多，采煤擾動改變了土壤環(huán)境的立地條件，不可避免地造成微生物適應(yīng)性下降，且微生物生物量亦呈下降態(tài)勢[8]。如，Chen等[9]發(fā)現(xiàn)，內(nèi)蒙古錫林郭勒采煤活動造成了土壤微生物多樣性下降。煤礦開采帶來的土壤破壞，給微生物群落和相應(yīng)的生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)帶來不利影響[10]。Sun等[11]發(fā)現(xiàn)，土壤微生物在采煤礦區(qū)塌陷后減少。Ezeokoli等[12]發(fā)現(xiàn)叢枝菌根真菌群落隨著煤礦塌陷區(qū)復(fù)墾時間的增加而呈顯著變化。礦山復(fù)墾則偏向積極作用。一些學(xué)者開始關(guān)注土壤微生物群落變化與環(huán)境要素之間的關(guān)系。Dimitriu等[13]報道了采礦干擾后土壤細菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的變化。此外，不同物種之間的相互作用通常形成復(fù)雜的生態(tài)網(wǎng)絡(luò)，它控制著菌群組裝，從而影響了群落結(jié)構(gòu)與功能[14]。微生物菌屬之間相互作用對了解環(huán)境變化下微生物群落組裝的動力學(xué)至關(guān)重要。盡管從全球圖譜到特定環(huán)境微生物生態(tài)網(wǎng)絡(luò)日益受關(guān)注，但對采礦沉陷環(huán)境中土壤微生物的相互作用知之甚少[15]。

近十年高通量測序打開了微生物黑箱之門，但如何提取、分析與綜合海量信息一直是難點[16]。分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)方法利用測序數(shù)據(jù)可視化表達微生物種群復(fù)雜的潛在互作關(guān)系，探索不同生態(tài)過程、生態(tài)功能穩(wěn)定性與復(fù)雜性及關(guān)鍵類群作用[17]。Zhou等[14]和Luo等[18]使用該方法研究了CO2水平升高和土豆連作環(huán)境下土壤細菌種群在網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)、互作關(guān)系、關(guān)鍵物種上聯(lián)系和差異。采礦作為高強度擾動，勢必影響土壤物質(zhì)養(yǎng)分循環(huán)。探索微生物種群的互作關(guān)系、尋找適應(yīng)沉陷環(huán)境的關(guān)鍵類群、厘清礦山微生物群落分布的主控因素，對重建礦山生態(tài)系統(tǒng)自恢復(fù)力至關(guān)重要[19]。為此，選取黃土高原東坪煤礦、大柳塔煤礦采礦沉陷區(qū)作為研究對象，利用高通量測序技術(shù)和生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析方法，探索在礦山干旱、貧瘠、污染等特定環(huán)境條件下土壤微生物的發(fā)育與適應(yīng)狀況、微生物種群與環(huán)境之間互作及互饋機制，尋找對生態(tài)自恢復(fù)起關(guān)鍵作用的功能類群，為黃土高原生態(tài)恢復(fù)和綠色礦山建設(shè)服務(wù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

黃土高原聚集了中國50%煤炭生產(chǎn)能力，資源儲量豐富，開采歷史悠久，生態(tài)破壞嚴(yán)重。本研究區(qū)選取東坪煤礦和大柳塔煤礦，二者均為黃土高原典型的采礦沉陷區(qū)。東坪煤礦位于山西省陽泉市盂縣（113°15′E～113°18′E，38°01′N～38°03′N），屬于溫帶大陸性氣候，年均氣溫8.7℃，年均降水450.0～550.4 mm。1982年正式投產(chǎn)，多年采礦造成地表塌陷、裂縫縱橫，水土流失嚴(yán)重，土壤貧瘠，植被覆蓋下降，甚至形成裸地。大柳塔煤礦位于陜西省榆林 市 神 木 縣（110°12′E～110°23′E，39°13′N～39°22′N），屬于溫帶大陸性氣候，年均氣溫8.6℃，年均降水290.4～410.3 mm。1996年正式開采，地下采空區(qū)占比70%，長期開采造成地下水位下降，地表干砂層增厚，土壤含水率下降，灌木、草類大面積枯死。

1.2 樣品采集與分析

2018年 8月 15日—18日在東坪煤礦（Dongping，記為DP）和大柳塔煤礦（Daliuta，記為DLT）沉陷區(qū)分別采集了24個樣品。土壤水分（soil water content，SWC）、溫度（soil temperature，ST）采用便攜式溫度濕度儀（TR-6，廣東順科達，廣州）現(xiàn)場速測法測定。再五點采樣法采集0～10 cm表土混合樣500 g，使用無菌專用袋密封包裝，車載冰箱冷藏送回實驗室處理。一份新鮮土樣泡沫箱冷藏、密封后直接郵寄至上海派森諾測序，另一份土樣室內(nèi)自然風(fēng)干后剔除石礫、動植物殘體，磨碎過100目篩，測定土壤理化和酶活性質(zhì)[20-21]。

土壤pH和電導(dǎo)率（electronic conductivity，EC）采用電位法（水∶土=1∶5）測定（DDS-307A，上海雷磁）。土壤機械組成和土壤黏粒占比（clay percent，CP）采用比重計法測定。土壤有機質(zhì)（soil organic matter，SOM）采用重鉻酸鉀氧化—比色法測定，土壤有效磷（available phosphorus，AP）釆用碳酸氫銨浸提—鉬銻抗比色法測定，土壤速效鉀（available potassium，AK）釆用醋酸銨浸提—火焰光度計（TAS-990，北京普析）法測定，土壤銨態(tài)氮（ammonium nitrogen，AN）用氯化鉀浸提—紫外分光光度法測定，土壤硝態(tài)氮（nitrate-nitrogen，NN）用氯化鈣浸提—紫外分光光度法測定[20]。脫氫酶（dehydrogenase，DHG）活性采用氯化三苯基四氮唑法測定，脲酶（urease，URA）活性用苯酚鈉—次氯酸鈉比色法測定，蛋白酶（protease，PRO）活性用茚三酮比色法測定[21]。

1.3 DNA提取與純化及PCR擴增和高通量測序

采用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit提取48個土壤樣品的DNA，對16S rRNA的V4和V5區(qū)進行PCR擴增，引物為515F（5’-GTGCCAGCMGCCG CGGTAA-3’）和 907R（CCGTCAATTCMTTTRA GTTT）；98℃預(yù)變性2 min，98℃變性15 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，25個循環(huán)，72℃延伸5 min，降溫至10℃，進行PCR擴增。再用2%瓊脂糖凝膠電泳進行PCR擴增產(chǎn)物檢測，用凝膠回收試劑盒（Axygen，美國）對目標(biāo)片段進行切膠回收。按照前述電泳定量結(jié)果，選取Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit熒光試劑，Microplate reader（FLx800，BioTek，美國）定量儀器，將PCR擴增回收產(chǎn)物進行熒光定量，對各樣本按等比混合。利用 Illumina公司（Illumina，美國）開發(fā)的文庫制備試劑盒制備測序文庫。構(gòu)建好的合格文庫，使用HiSeq2500 PE2500（Illumina，美國）進行上機測序，具體委托上海派森諾測序。

1.4 分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析

選取 16S rRNA 測序數(shù)據(jù)使用 http：//ieg4.rccc.ou.edu/mena平臺構(gòu)建和統(tǒng)計分析土壤微生物分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)，本研究共構(gòu)建了4個網(wǎng)絡(luò)[14，17]。具體方法為：平行樣本中的 OTU（operational taxonomic unit，操作分類學(xué)單位）數(shù)加和大于等于120的OTU（前75%）按log10轉(zhuǎn)換，計算OTUs之間的皮爾森（Pearson）相關(guān)系數(shù)，并轉(zhuǎn)換為相似矩陣。選擇最優(yōu)相似閾值，利用每對節(jié)點之間的連接強度構(gòu)成鄰接矩陣，分析最近鄰間距分布特征值預(yù)測分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)。利用Cytocape 3.7.1軟件可視化處理分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)，一個網(wǎng)絡(luò)被分成多個模塊，每個模塊代表一個功能單位。利用模塊內(nèi)連接度（Zi）與模塊間連接度（Pi）對網(wǎng)絡(luò)節(jié)點功能進行劃分。網(wǎng)絡(luò)節(jié)點代表微生物群落中的種群或環(huán)境因子，節(jié)點之間的連接線代表物種或者環(huán)境因子之間的相互關(guān)系。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

基于galaxy平臺（http//：mem.rcees.ac.cn.8080/）計算阿爾法（Alpha）多樣性指數(shù)，并進行主成分分析（principal component analysis，PCA）、非度量多維尺度（non-metric multidimensional scaling，NMDS）分析、典范對應(yīng)分析（canonical correspondence analysis，CCA）、曼特爾檢驗（Mantel Test）及熱圖分析。采用SPSS 20.0 軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA，analysis of variance）；用Origin9.0軟件繪制土壤微生物群落在不同分類水平上的豐度圖。

2 結(jié) 果

2.1 采煤沉陷對土壤環(huán)境因子的影響

從圖1可以看出，采煤沉陷對土壤環(huán)境因子產(chǎn)生了顯著的影響，但不同的沉陷深度對土壤環(huán)境因子的影響程度不同，方向不一。DLT沉陷區(qū)土壤pH、土壤溫度隨沉陷深度變大，土壤有機質(zhì)、含水率、溫度隨沉陷深度減小，土壤有機質(zhì)、含水率、黏粒占比隨沉陷深度變大，但AN呈隨機分布。盡管DLT和DP均處黃土高原，但采煤沉陷造成的土壤環(huán)境 因子變化差異明顯。地形特征與植被覆蓋變化可能是重要因素，DLT屬內(nèi)蒙草原，地形平坦，沉陷深處通常土壤沙化、植被退化、鹽度上升，沉陷淺處一般維持草或灌草；DP則為丘陵區(qū)，沉陷對其影響不明顯，但會造成坡面上部的拉伸、斷裂以及下部的擠壓。上部盡管沉陷深度小，但根系和水份受損嚴(yán)重，植被枯死。因此，DLT和DP土壤環(huán)境因子對采煤沉陷表現(xiàn)為不同的響應(yīng)。

2.2 采煤沉陷對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和組成的影響

本研究DP全部24個樣品共檢測到1 152 916條有效序列，每個樣品序列數(shù)量介于30 615～54 632條。DLT全部24個樣品共檢測到902 912條有效序列，每個樣品序列數(shù)量介于32 834～41 666，分布更為均勻。采用97%相似水平對測序獲得的OTU進行歸類劃分，土壤微生物Alpha多樣性計算結(jié)果見表1。超1指數(shù)顯示DP土壤微生物群落豐富度高于DLT，但香農(nóng)（Shannon）指數(shù)接近，又說明兩處微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性幾乎相同。反辛普森（Inv_Simpson）指數(shù)、皮洛均勻度（Pielou_evenness）指數(shù)和辛普森均勻度（Simpson_evenness）指數(shù)的計算結(jié)果表明DLT土壤微生物群落均勻度高于DP。

表1 東坪和大柳塔煤礦采煤沉陷區(qū)土壤微生物Alpha多樣性指數(shù) Table 1 Alpha diversity index of soil microorganisms in mining subsidence area of DP and DLT Coal Mine

DP和DLT各24個樣品中的微生物被歸類為34和39個細菌門，放線菌門（Actinobacteria）最為豐富，分別占25.6%和28.9%（圖2a、圖2b）。DP所有樣本中相對豐度大于1%的優(yōu)勢菌門有10個，而DLT所有樣本中相對豐度大于1%的優(yōu)勢菌門有8個。盡管二處土壤主要菌門相似，但豐度有明顯的不同。此外，DP較DLT多了2個優(yōu)勢菌門，即硝化螺旋菌門（Nitrospira，2.2%）和藍細菌門（Cyanobacteria，1.7%）（圖2a）。為了進一步區(qū)分兩組樣品的差異，對相對豐度排名前15（TOP 15）的屬進行分析，結(jié)果顯示，DP所有樣本中相對豐度大于1%的屬有RB41（2.5%）、Solirubrobacter（1.9%）、Roseiflexus（1.8%）、Gaiella（1.4%）和Lysobacter（1.1%）（圖2c），而DLT所有樣本中相對豐度大于1%的屬有Nocardioides（3.3%）、RB41（2.9%）、Solirubrobacter（2.1%）和Roseiflexus（1.2%）（圖2d）。其他TOP 15菌屬的相對豐度也差異明顯。

2.3 采煤沉陷對土壤微生物分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)的影響

選取24個樣本序列中OTU數(shù)加和大于等于120作為輸入項，構(gòu)建DP和DLT微生物分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)，具體參數(shù)見表2。R2>0.75且主要參數(shù)高于隨機網(wǎng)絡(luò)，表明網(wǎng)絡(luò)具有可靠性[18]。DP網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點、連接線和平均連接度遠高于DLT，反映前者群落更為復(fù)雜。DP平均聚類系數(shù)、最大連接數(shù)、傳遞性指數(shù)遠高于DLT，說明各菌群間聯(lián)系更緊密、關(guān)系更復(fù)雜，傳遞性更強。但DP網(wǎng)絡(luò)測量效率、模塊屬性低于DLT，表明后者對抗外界變化的抗性更高，反應(yīng)更快。

表2 東坪與大柳塔煤礦采煤塌陷區(qū)土壤微生物細菌群落的分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù) Table 2 Topological parameter of molecular ecological networks of bacterial communities in the DP and DLT Coal Mine

不同節(jié)點借助模塊內(nèi)或模塊間連接性在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮作用，為此可從模塊內(nèi)連接度（Zi）和模塊間連接度（Pi）判斷一些類群或功能是否起決定作用。一般將Zi≥2.5或 Pi≥0.62的節(jié)點視為關(guān)鍵物種[14]。從圖3可以看出，大于97.4%的節(jié)點是外圍節(jié)點，DP含6個模塊樞紐節(jié)點，分別是OTU_9950和OTU_105680（綠彎菌門）、OTU_11725和OTU_18161（放線菌門）、OTU_97093（奇古菌門）以及OTU_84960（酸桿菌門）。DLT僅含2個模塊樞紐節(jié)點，分別是OTU_133539（變形菌門）和OTU_81764（放線菌門）。這8個OTU可能是兩處群落的關(guān)鍵物種，但無連接節(jié)點和網(wǎng)絡(luò)樞紐節(jié)點，說明無支配種。

分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)可視化圖顯示各物種之間的相互關(guān)系，DP網(wǎng)絡(luò)含7個模塊，OTU_84960（酸桿菌門）、 OTU_105680（綠彎菌門）、OTU_44932（芽單胞菌門）、OTU_111599（變形菌門）和OTU_122057（奇古菌門）具有最高的連接度，介于50～62，它們均屬于模塊3（圖4a）?？梢酝茢?，模塊3應(yīng)為DP網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵模塊，而OTU_84960和OTU_105680 是關(guān)鍵物種。DLT網(wǎng)絡(luò)含5個模塊，最大的5個節(jié)點是OTU_133539（變形菌門）、OTU_74153（變形菌門）、OTU_16577（綠彎菌門）、OTU_25372和OTU_124598（放線菌門），連接度介于11～22，均屬于模塊1，OTU_133539是關(guān)鍵物種（圖4b）。此外，DP網(wǎng)絡(luò)各節(jié)點間正相關(guān)關(guān)系優(yōu)勢明顯，說明該區(qū)土壤微生物為應(yīng)對沉陷造成的養(yǎng)分貧瘠時趨向相互合作（圖4a）。DLT網(wǎng)絡(luò)中模塊減少，模塊間連接線也少。一些模塊內(nèi)正相關(guān)關(guān)系優(yōu)于負相關(guān)，說明該區(qū)微生物對抗外界干擾的抗性不斷增強，有助于提升土壤的自恢復(fù)潛力（圖4a）。

2.4 土壤微生物群落與環(huán)境因子的互作關(guān)系

將OTUs和土壤理化性質(zhì)進行Mantel Test分析，結(jié)果顯示DP土壤微生物OTUs與SWC、AP、NN、AN及URA呈顯著性相關(guān)（P<0.05），DLT土壤微生物OTUs與pH、ST、SWC、CP、DHG及PRO呈顯著性相關(guān)（P<0.05）（表3）。土壤微生物OTUs 與多環(huán)境因子存在顯著性相關(guān)，且驅(qū)動微生物演替的主控因子組合明顯不同，說明礦山土壤微生物群落變化不是單一因子驅(qū)動的，受多重環(huán)境因子疊加作用驅(qū)動。

表3 東坪和大柳塔煤礦采煤沉陷區(qū)土壤微生物OTUs與環(huán)境因子曼特爾檢驗 Table 3 Mantel Test of soil microbial OTUs with environmental factors in the DP and DLT Coal Mine

為厘清土壤微生物演替的驅(qū)動力，將圖4a、圖4b中大于5個節(jié)點的模塊與環(huán)境因子作熱圖分析（圖5）。結(jié)果表明：DP網(wǎng)絡(luò)中模塊1、2、3與EC呈顯著正相關(guān)，模塊2與SWC呈顯著正相關(guān)，模塊6與AP呈顯著正相關(guān)，模塊1與NN呈顯著正相關(guān)，模塊1和3與AN呈顯著正相關(guān)，模塊6和7與DHG呈顯著正相關(guān)，模塊2和5與URA呈顯著正相關(guān)。pH與模塊2呈顯著負相關(guān)，SOM、AK和PRO與任何模塊均無顯著相關(guān)性（圖5a）。DLT網(wǎng)絡(luò)中模塊1與pH、ST呈顯著正相關(guān)，模塊2與ST呈顯著正相關(guān)，模塊1、2與SWC、CP呈顯著負相關(guān)，模塊5與NN呈顯著正相關(guān)，模塊3與PRO呈顯著正相關(guān)。DHG與模塊3呈顯著負相關(guān)（圖5b）。特征模塊中優(yōu)勢物種通常是網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵物種，不同模塊與環(huán)境因子之間的驅(qū)動關(guān)系解釋了微生物群落對環(huán)境變化的不同響應(yīng)，結(jié)果也反證了前述OTUs與環(huán)境因子之間的相互關(guān)系。

3 討 論

3.1 土壤微生物群落對采煤沉陷環(huán)境的適應(yīng)性

盡管DP和DLT微生物群落多樣性存在著一定的差異，但相對豐度最高的菌門幾乎完全一致，即放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）和綠彎菌門（Chloroflexi）（圖2）。這說明沉陷已干擾土壤微生物區(qū)系發(fā)育，微生物不斷地調(diào)整自身的結(jié)構(gòu)并對沉陷環(huán)境作普適性變化。放線菌門具有特征性絲狀形態(tài)，又有降解和利用有機物的潛在能力[22]，它更適應(yīng)在礦山惡劣環(huán)境中生存。變形菌門具有多樣化的生物地理分布，富含能降解各種污染物的好氧菌以及促生氧化酶的菌群[23]。黃土高原礦區(qū)地表沉陷后上覆土壤普遍干燥，無法形成積水，裂縫、滑坡、拉伸加大了土體孔隙度，更利于好氧菌的發(fā)育，并成為優(yōu)勢菌門。酸桿菌門在礦山土壤酸化生態(tài)過程起重要作用，并廣泛分布于各種惡劣的自然環(huán)境中[24]。部分綠彎菌門的微生物具有固碳生態(tài)功能，這種功能在采煤沉陷區(qū)貧瘠土壤中顯得尤為重要，亦有報道，當(dāng)土壤變得更加缺氧時，綠彎菌門會增加[25]。這好像與變形菌門成為優(yōu)勢菌門存在矛盾，事實上更說明了沉陷土壤的環(huán)境復(fù)雜性，丘陵沉陷的坡底或平原沉陷的谷底通常受擠壓，土體孔隙度減少，甚至形成季節(jié)性或間歇性積水。這有利于綠彎菌門的生存，并發(fā)育為相對豐度高的菌門。從微生物群落菌門組成和網(wǎng)絡(luò)模塊可以推測，土壤微生物群落依據(jù)礦山特定的環(huán)境作適應(yīng)性變化，沉陷區(qū)地形特征和土地利用進一步修飾了土壤微生物區(qū)系的演替。

3.2 采煤沉陷區(qū)土壤微生物的關(guān)鍵類群

分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析可揭示土壤微生物菌屬間相互作用，如模塊化、小區(qū)域或無尺度。DP和DLT網(wǎng)絡(luò)中存在一些蜂窩特征，有效地促進不同物種間的溝通并提升對采礦干擾的響應(yīng)能力。DP網(wǎng)絡(luò)較DLT復(fù)雜且連接更加緊密（表2、圖4），具備更高 的干擾耐受性[26]。DP和DLT網(wǎng)絡(luò)特征顯示微生物組間的相互作用以及所涉及的物種變化，尤其是優(yōu)勢物種的變化（圖3和圖4）。DLT網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性更低，因此更易對生物地球化學(xué)功能產(chǎn)生負面影響，從而導(dǎo)致微生物群落呈不穩(wěn)定或更脆弱的狀態(tài)。盡管DP和DLT均屬黃土高原，但二者的自然參數(shù)仍有差異，如降水、氣溫和土地利用。事實上在微生物群落結(jié)構(gòu)與組成相似的條件下，不同的網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性差異也暗示除礦山環(huán)境要素外，自然參數(shù)也重要的影響因子，如DP微生物群落多樣性低于DLT（表1、圖2）。地理特性、土地利用可能以不同的方式影響著微生物群落多樣性和網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，未來仍需進一步證實。

分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析也為探尋關(guān)鍵類群提供了便利，關(guān)鍵類群在微生物組中發(fā)揮重要作用，缺失或?qū)е挛⑸锝Y(jié)構(gòu)和功能發(fā)生重大變化[15]。盡管先前研究報道了各種環(huán)境中的關(guān)鍵類群[6，22]，但有關(guān)受損礦山土壤關(guān)鍵類群的報道幾乎空白。本研究依據(jù)網(wǎng)絡(luò)參數(shù)識別了DP土壤微生物關(guān)鍵類群，連接線大于50的OTU_84960（酸桿菌門）等5個節(jié)點和OTU_105680（綠彎菌門）等6個模塊樞紐中優(yōu)勢物種作為關(guān)鍵類群。雖然圖2c）顯示OTU_97093（奇古菌門）和OTU_44932（芽單胞菌門）的相對豐度并不高，但并不影響它們的重要作用，這表明相對豐度與關(guān)鍵功能之間缺乏有效的關(guān)聯(lián)[27]。OTU_44932所屬的芽單胞菌門被認為既可在有氧條件又可無氧條件下生長[28]，具備廣泛的適應(yīng)性是它能夠成為采煤沉陷環(huán)境中關(guān)鍵類群的重要原因。OTU_97093屬于的奇古菌門是第一個被確定參與硝化作用的古細菌[29]，可以氧化極低濃度的銨以應(yīng)對采礦沉陷導(dǎo)致的土壤養(yǎng)分貧瘠環(huán)境。連接線大于11的OTU_133539（變形菌門）等5個節(jié)點和OTU_81764（放線菌門）等2個模塊樞紐中優(yōu)勢物種作為DLT網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵類群，DLT的關(guān)鍵類群不同于DP，且較少。Ezeokoli等[30]研究露天煤礦沙化土壤微生物群落時未發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵類群，盡管與本研究的發(fā)現(xiàn)有所不同，但均說明采礦擾動易損害微生物群落，并對土壤養(yǎng)分循環(huán)和生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)性產(chǎn)生負面作用。

3.3 采煤沉陷區(qū)土壤微生物群落與環(huán)境因子的互饋機制

模塊中OTUs的聯(lián)系反映微生物菌群間的相互作用，也表明對共同環(huán)境參數(shù)的響應(yīng)。負載重要功能的OTUs通常隨環(huán)境變化改變在網(wǎng)絡(luò)中的角色，模塊成員、拓撲角色和系統(tǒng)發(fā)育提供有用的信息來識別關(guān)鍵OTU。因此，了解土壤微生物類群間的互作及環(huán)境適應(yīng)性可為礦山生態(tài)恢復(fù)提供洞察力，尤其是對人為干擾的響應(yīng)，具有重要意義[22，27]。土壤pH、水分含量、有機碳等環(huán)境因子對礦區(qū)生態(tài)恢復(fù)中土壤細菌群落結(jié)構(gòu)和組成具有較大影響，Xiao等[31]研究認為土壤環(huán)境因子在不同程度上影響土壤微生物活性，且微生物在養(yǎng)分循環(huán)利用和土壤肥力中起著至關(guān)重要的作用；da Silva等[32]發(fā)現(xiàn)土壤微生物學(xué)特性在一定程度上影響微生物生物量碳和微生物的呼吸作用。微生物是礦山土壤質(zhì)量提升、生物多樣性恢復(fù)的重要手段，因此，理解微生物重要功能群與土壤因子間的關(guān)系對礦山生態(tài)恢復(fù)至關(guān)重要。

本研究發(fā)現(xiàn)模塊、節(jié)點連通性與環(huán)境因子之間存在顯著相關(guān)性，如DP網(wǎng)絡(luò)中，分屬模塊1、2、3的是關(guān)鍵菌群OTU_18161（放線菌門）、OTU_97093（奇古菌門）、OTU_105680（綠彎菌門）和OTU_84960（酸桿菌門）與EC密切相關(guān)（表3、圖4和圖5），這可能與采礦干擾土壤壤中流導(dǎo)致浸出液水溶性鹽含量變化有關(guān)，從而影響微生物群落。Sun等[11]發(fā)現(xiàn)煤礦區(qū)土壤細菌分布主要受SOM、AK和AP的影響。DP網(wǎng)絡(luò)中模塊6與AP顯著相關(guān)（圖5a），這可能與模塊6中關(guān)鍵菌群OTU_11725（放線菌門）有關(guān)，磷是不可缺少的營養(yǎng)元素之一，受干擾微生物溶解一些難溶的磷酸鹽參與自身新陳代謝，從而影響AP含量。不同采礦活動會影響土壤微生物豐度、分類學(xué)多樣性和功能多樣性。pH在代謝和遺傳中非常重要，這與DLT模塊1中關(guān)鍵菌群OTU_133539（變形菌門）與pH的關(guān)系相似，說明外部環(huán)境變量影響不同微生物組之間的相互關(guān)系，且這種變化與土壤特性密切相關(guān)。土壤酶活性對采煤沉陷引起的土壤環(huán)境變化反應(yīng)十分迅速，本研究發(fā)現(xiàn)DP網(wǎng)絡(luò)中模塊2、模塊5與URA顯著相關(guān)，DLT網(wǎng)絡(luò)模塊3則與DHG及PRO顯著相關(guān)（圖5b）。采煤沉陷擾動降低土壤含水量，影響土壤酶活性，長期無法修復(fù)將使土壤養(yǎng)分循環(huán)受阻[8-10]。

就相對豐度前50的OTU與土壤環(huán)境因子的網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系而言，DP網(wǎng)絡(luò)中環(huán)境因子SOM具有最高連接度，AN、DHG、AK次之，而DLT網(wǎng)絡(luò)中，具有較高連接度的環(huán)境因的排序依次為ST、SWC、CP、DHG（圖6）。這些高連接度環(huán)境因子與占支配 地位的放線菌門、變形菌門、酸桿菌門和綠彎菌門之間的連接也多，且不同的環(huán)境因子與OTU連接的相關(guān)關(guān)系不一。就網(wǎng)絡(luò)參數(shù)而言，DP網(wǎng)絡(luò)中屬于酸桿菌門的OTU_84960（Holophagae）的連接度最高，且與土壤SOC、AP、AK、DHG和PRO直接相連呈負相關(guān)，與AN直接相連呈正相關(guān)，關(guān)系密切。DLT網(wǎng)絡(luò)中OTU_44846（Aquabacterium）的連接度最高，且與土壤SWC、CP、DHG、AN和PRO直接相連且呈負相關(guān)，與ST直接相連呈正相關(guān)，關(guān)系密切。就環(huán)境適應(yīng)性而言，Holophagae與Aquabacterium可視為沉陷土壤微生物群落優(yōu)勢菌群，或可助力今后黃土高原礦區(qū)生態(tài)恢復(fù)。

4 結(jié) 論

采煤通常對礦山土地生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生顛覆式破壞，沉陷、裂縫、滑坡和堆壓等高強度擾動勢必干擾土壤物質(zhì)養(yǎng)分循環(huán)，從而影響國土空間生態(tài)修復(fù)。本研究利用高通量測序和分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)方法探索微生物類群間的互作關(guān)系，厘清礦山微生物群落分布的主控因素，尋找適應(yīng)沉陷環(huán)境的關(guān)鍵功能群。沉陷環(huán)境對土壤微生物群落多樣性、結(jié)構(gòu)和分布模式影響顯著，但放線菌門一直最為豐富。東坪煤礦分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系較大柳塔煤礦更復(fù)雜、網(wǎng)絡(luò)節(jié)點和連接數(shù)更多。一些關(guān)鍵類群，如放線菌門、綠彎菌門和奇古菌門與環(huán)境因子直接相連且關(guān)系密切。此外，為適應(yīng)礦山土壤營養(yǎng)貧瘠，微生物種群間更偏向相互合作，其中Holophagae與Aquabacterium為優(yōu)勢關(guān)鍵菌群，或可助力礦山生態(tài)修復(fù)。本研究為脆弱礦山生態(tài)系統(tǒng)生態(tài)修復(fù)提供了一種新思路，未來進一步加強功能網(wǎng)絡(luò)研究，豐富對自恢復(fù)機制的理解，為黃土高原生態(tài)恢復(fù)和綠色礦山建設(shè)服務(wù)。