元哲進，金麗華，白野

(東北林業(yè)大學生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150040)

過量攝入高糖高脂飲食導致的肥胖是多種慢性疾病的誘因之一，典型的如2型糖尿病[1-2](Type 2 diabetes, T2D)。T2D是一種以胰島素抵抗為病理學標志的代謝性疾病，同時有多食、多飲、多尿、身體消瘦的“三多一少”臨床表現(xiàn)[3]。若不及時治療，將會導致糖尿病病足、神經(jīng)病變、糖尿病腎病等嚴重并發(fā)癥甚至危及生命[4]。目前T2D的治療主要依靠口服降糖藥和注射胰島素，但這些藥物的安全性依然具有爭議[5]。盡管傳統(tǒng)意義上的T2D為成年人所患的疾病，但近年來兒童的發(fā)病率也逐漸提高[6]。因此，尋找能夠治療T2D且同時兼具安全和副作用小兩大優(yōu)點的藥物是十分重要的。

金銀花(LoniceraeJaponicaeFlos, LJ)是忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花[7]。其作為我國傳統(tǒng)藥食兩用植物，富含多種有機酸和類黃酮等藥效活性成分，在臨床上被廣泛用作抗菌和抗炎藥物。同時因其具有寒性，在民間常被用來治療中暑和保護視力[8]。

哺乳動物的胰島素信號通路與體內糖穩(wěn)態(tài)、生長發(fā)育、繁殖力和壽命密切相關[9]，此信號通路失調將導致多種代謝性疾病。目前，多種動物模型用于研究其發(fā)病機制，黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster,Drosophila)是其中之一[10]。果蠅生活周期短、子代多、致病基因與人類高達74% 的同源性，使其成為研究胰島素代謝疾病的良好模型。

本實驗通過果蠅喂食含有1 mol/L蔗糖的高糖培養(yǎng)基HSD作為對照組，HSD加入5%或10% LJ作為實驗組，分析了果蠅生命周期、體質量、發(fā)育時間、成蟲生殖能力、后代存活力。同時，分析了LJ對S6k基因缺失突變體的細胞大小和脂肪儲存的影響，探討LJ對高糖誘導的代謝紊亂和胰島素信號通路的影響，為治療T2D提供理論基礎。

1 試劑與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 主要試劑

金銀花：黑龍江省哈爾濱市人民同泰藥店；蔗糖(Sucrose)：Sigma公司；氟硼二吡咯(Boron-dipyrromethe, BODIPY)、鬼筆環(huán)肽(Phalloidin)：Life Technologies公司。

1.1.2 果蠅品系及培養(yǎng)條件

野生型黑腹果蠅(Drosophila)w1118購自于Bloo-mingtonDrosophilastock center (Bloomington, IN, USA)，轉基因型黑腹果蠅S6kl-1/TM6B由Tian Xu教授饋贈。培養(yǎng)溫度(25 ±1) ℃，相對濕度60%～70%。

1.1.3 主要儀器與設備

ALC-210.4型電子分析天平(北京賽多利斯公司)；Elix5型純化水系統(tǒng)(Millipore公司)；SZ51型顯微鏡(日本 Olympus公司)；Axioskop 2 plus型熒光顯微鏡( Zeiss公司)。

1.2 方法

1.2.1 金銀花提取物的制備

參考周洋等人[11]的水萃取法對金銀花進行提?。悍Q20 g金銀花，加200 mL去離子水浸泡過夜，加熱煮沸后中火熬制3 h，過濾后，在濾渣中再加200 mL去離子水以同樣方法再次加熱熬制，收集兩次濾液并濃縮至100 mL即得到質量體積比濃度為 0.2 g/mL(20%)的金銀花水提液備用。

1.2.2 果蠅培養(yǎng)基的配置及分組

參考李文佳等人[12]的玉米粉-酵母培養(yǎng)基配制方法分別配制含有0.15 mol/L蔗糖的低糖(設為LSD組)和含有1 mol/L蔗糖的高糖培養(yǎng)基(設為HSD組)。HSD組中的去離子水換成等體積的金銀花提取物(LJ)，同時按質量體積比保證相應LJ的濃度，配制5%或10%提取物的培養(yǎng)基為HSD+5%LJ組成HSD+10%LJ組。

1.2.3 果蠅成蟲生命周期的測定

取來自不同培養(yǎng)基中已經(jīng)羽化3 d的果蠅轉移至相同的新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，之后將雌性與雄性果蠅分開，每組30只。以2 d為一個周期，將果蠅轉移至新鮮培養(yǎng)基中，并觀察記錄果蠅死亡情況，直至全部死亡。

1.2.4 蛹體積和果蠅成蟲體質量的測定

參考JUN等人[13]的蛹體積測定方法：將蛹放置在顯微鏡下以相同倍數(shù)進行拍攝，圖片使用ImageJ軟件測量出蛹的長度和寬度，以LSD組體積為標準，利用公式V=4/3π×(L/2)×(l/2)2(L：長度；l：寬度)計算得到各組體積。收集果蠅成蟲(羽化不超過8 h)至新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，之后將雌性與雄性果蠅分開，每組30只，用天平稱重并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.5 成蟲羽化率、成蟲產(chǎn)卵率和受精卵孵化率的測定

將一定數(shù)量的雌果蠅6 h內產(chǎn)的受精卵收集起來培養(yǎng)至蛹期，觀察，每24 h記錄蛹和蛹殼的數(shù)量，成蟲羽化率即為蛹殼數(shù)與總蛹數(shù)的比。將羽化5 d左右的雌雄成蟲各100只裝入接卵器中，食物只供酵母，采用蘋果汁瓊脂平板封底，2 h左右進行更換，同時數(shù)出受精卵的個數(shù)并記錄。成蟲產(chǎn)卵率為雌果蠅每小時產(chǎn)下的受精卵個數(shù)。將上述平板放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22 h后，記錄1齡幼蟲(L1)的個數(shù)，受精卵孵化率即為每個平板中L1的數(shù)量與該平板中受精卵總數(shù)的比值。

1.2.6 三齡幼蟲脂肪體細胞和脂肪油滴的染色

參考白野[14]等人的染色方法，在顯微鏡下，預冷PBS中提取三齡幼蟲脂肪體組織，用4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBST清洗幾次后，用Phalloidin和 BODIPY分別染色30 min，中間也采用PBST清洗，DAPI染色 10 min，最后slow fade封片，顯微鏡下觀察并拍攝圖片。以LSD組染色數(shù)據(jù)為標準，結果用ImageJ軟件分析脂肪體細胞和脂肪油滴面積。

1.2.7 成蟲翅膀細胞面積的測定

分離20只雄果蠅成蟲翅膀，在顯微鏡下以相同倍數(shù)進行拍攝，在相同面積內，使用ImageJ軟件統(tǒng)計圖片中翅膀相同位置剛毛的個數(shù)。翅膀細胞面積即為該區(qū)域的面積與剛毛個數(shù)的比值。以LSD組翅膀細胞面積作為標準，計算翅膀細胞面積。

1.2.8 統(tǒng)計學分析

2 結果與分析

2.1 金銀花對HSD果蠅生命周期的影響

ZHANG等人證實高糖飲食會縮短果蠅生命周期[9]。為了探究金銀花對HSD果蠅生命周期的影響，HSD中添加5%或10% LJ后喂食果蠅，分析其平均壽命、半數(shù)死亡時間和最長壽命。為排除激素影響，雌雄果蠅在交配后被分開單獨檢測。結果顯示，與LSD組相比，HSD組雌雄果蠅平均壽命、半數(shù)死亡時間和最長壽命均顯著縮短(圖1，表1)，而補充5%或10% LJ后顯著延長了雌雄果蠅的壽命。當HSD中添加LJ后，果蠅平均壽命最少也延長了3 d，半數(shù)死亡時間至少延長了2 d，雌雄最長壽命分別延長了4 d和7 d以上(表1)。這些結果表明LJ明顯能夠提高HSD果蠅的生命周期，且10% LJ延長效果更好，故后續(xù)實驗均采用此濃度。

表1 LJ提取物對HSD果蠅生命周期的影響

2.2 金銀花對HSD果蠅個體大小的影響

HSD喂養(yǎng)的果蠅由于胰島素抵抗，發(fā)育異常，個體變小[15]。 為了探究金銀花能否改善這一現(xiàn)象，分別測量了蛹體積和成蟲體質量檢測幼蟲和成蟲大小。結果顯示，HSD組相對蛹體積比LSD組下降44.9%(圖2A，C)。 同時，HSD組雌雄成蟲體質量較LSD組也分別下降38.7%、35.9%(圖2B，D)。當添加10% LJ后，大小和體質量得到顯著的改善。HSD+LJ組與HSD組比較，相對蛹體積增加64.1%，雌果蠅體質量增加28.4%，但是雄果蠅體質量沒有明顯的變化。這些結果表明金銀花可以緩解由HSD導致的果蠅蛹變小以及雌性成蟲體質量減輕的情況。

注：A.雌性果蠅；B.雄性果蠅。圖1 LJ提取物對HSD果蠅生命周期的影響

注：*P<0.05,***P<0.001。圖2 LJ提取物對HSD果蠅個體大小的影響

2.3 金銀花對HSD果蠅幼蟲發(fā)育時間、成蟲生殖能力、后代存活能力的影響

HSD喂養(yǎng)的果蠅生長速度顯著減慢[16]。為了探究金銀花能否緩解HSD果蠅發(fā)育遲緩現(xiàn)象，分析了成蟲孵化率。結果顯示，HSD顯著延長了幼蟲發(fā)育時間，當接卵13 d后才有成蟲孵出，而HSD+LJ組第11天就有成蟲孵出(圖3A)。另外，HSD組蛹的最終孵化率為83.4%，而HSD+LJ組為95.4%(圖3A)。通過分析產(chǎn)卵率和受精卵孵化率發(fā)現(xiàn)，HSD組每小時產(chǎn)卵量約53個，LSD組約196個(圖3B)，兩組受精卵孵化率分別為78.7%和98.0%(圖3C)。當HSD中補充10% LJ時，與HSD組相比產(chǎn)卵率提高4倍、受精卵孵化率提高了19.9%。這些結果表明，LJ顯著加快了 HSD果蠅幼蟲的發(fā)育時間，且提升了HSD果蠅生殖能力和后代的存活能力。

注：***P<0.001。圖3 LJ對HSD果蠅幼蟲發(fā)育時間、成蟲生殖能力和后代存活能力的影響

2.4 金銀花對S6k突變體果蠅脂肪儲存的影響

在胰島素/胰島素生長因子樣信號的傳導過程中，核糖體蛋白S6激酶(Ribosomal protein S6 Kinase, S6k)被激活后，會使磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸增加，發(fā)揮促進機體生長發(fā)育的作用[16-17]。果蠅和哺乳動物的S6k功能相似，控制生物體的生長和發(fā)育[16-17]。在上述研究中，發(fā)現(xiàn)金銀花能夠緩解高糖誘導的生長速度、壽命、個體大小和繁殖力，因此，為進一步明確LJ對這一信號通路的影響，利用S6k基因缺失突變體果蠅喂食金銀花，分析其脂肪貯存和脂肪細胞大小。脂肪體是果蠅體內的重要器官，主要作用為儲存脂肪以及遠程控制營養(yǎng)攝入與胰島素之間的穩(wěn)態(tài)[18]。結果顯示，和野生型相比S6k突變體脂肪油滴相對面積顯著減小了，當在培養(yǎng)基中加入LJ后，與喂食LSD的突變體相比，LSD+LJ組的脂肪油滴面積增加了95.8%(圖4)。這些結果說明，LJ可以有效緩解由于S6k的缺失導致的果蠅脂肪體脂肪油滴面積減小。

注：***P<0.001。圖4 LJ對S6k突變體果蠅脂肪儲存的影響

2.5 金銀花對S6k突變體果蠅脂肪體細胞和翅膀細胞大小的影響

和野生型比較S6k突變體果蠅個體和細胞面積減小[19]。 因此，通過分析脂肪體細胞和翅膀細胞的面積來分析LJ對個體大小的影響。結果顯示，與野生型比較S6k突變體果蠅的脂肪體細胞和翅膀細胞大小均顯著縮小(圖5)。當在培養(yǎng)基中添加10% LJ后，與普通飲食的S6k突變體相比兩種細胞大小分別增加了11.9%和24.8%(圖5)。 以上結果表明LJ能夠增加S6k缺失果蠅的細胞大小。

注：***P<0.001。圖5 LJ對S6k突變體果蠅脂肪體細胞和翅膀細胞大小的影響

3 討論

目前T2D的治療主要包括口服降糖藥和注射胰島素兩種方法，但降糖藥普遍具有副作用且無論選擇哪種方法，都只是暫時延緩并發(fā)癥發(fā)生，而不是根治T2D。最近研究顯示，一些高血糖患者普遍存在葡萄糖代謝紊亂，但是不符合T2D的標準診斷，這種情況被稱為“前驅糖尿病”，如果這一階段能夠得到及時治療，可以完全治愈[20]。因此，副作用小且安全有效的降糖藥的開發(fā)對于預防以及治療T2D是十分重要。金銀花是歷史悠久的藥食兩用植物，近年來有少量研究發(fā)現(xiàn)其對降血糖有一定作用，但金銀花與胰島素信號通路相關的研究鮮見報道[21-22]。本研究利用喂食高糖飲食，建立了代謝紊亂的果蠅模型，通過分析生長周期、個體大小、重量、羽化時間、生殖能力等，探究金銀花對高糖誘導的代謝紊亂的緩解作用。結果表明，LJ增加了HSD果蠅蛹的體積和成蟲重量，加速了HSD幼蟲生長發(fā)育速度。同時，LJ提升了HSD果蠅生殖能力和后代生存能力。這些結果均顯示LJ可能通過影響胰島素信號通路來改善HSD果蠅體內的糖代謝。為進一步驗證這個結論，分析了LJ對胰島素信號通路中重要基因—S6k基因低表達果蠅的脂肪儲存和細胞大小的影響。結果表明，LJ可以有效緩解由于S6k的缺失導致的果蠅脂肪油滴面積減小和細胞減小。這些結果進一步證明LJ有可能影響了胰島素信號傳導途徑，但具體的作用機制還需要進一步研究。綜上所述，LJ具有價格低廉、副作用少、易獲得等諸多優(yōu)點，因此被廣泛應用于臨床治療。本研究為金銀花治療T2D提供了理論基礎，為T2D治療藥物的開發(fā)與利用提供了新思路。