黃金月,崔芙巖,鄭時(shí)嘉,姜佳欣,楊佳穎,王志剛,于純淼,楊波*
(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150040;2.天問山農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)股份有限公司,黑龍江 哈爾濱 150300)
中國藥典中記載的黃精藥材(Polygonatirhizoma)為百合科植物黃精(PolygonatumsibiricumRed.)、滇黃精(PolygonatumkingianumColl.et Hemsl.)或多花黃精(PolygonatumcyrtonemaHua)的干燥根莖,根據(jù)形狀有“雞頭黃精”“姜形黃精”“卷葉黃精”別稱[1],富含皂苷、黃酮、多糖等活性成分,具有保肝護(hù)腎、降脂降糖、增強(qiáng)免疫力等藥理作用[2]。黃精多產(chǎn)于東北、河北等北方地區(qū);滇黃精多產(chǎn)于云南、四川、貴州等地;多花黃精多產(chǎn)于湖南、湖北、江蘇、安徽等地[3]。皂苷、黃酮是黃精中較為重要的活性成分,也是衡量各產(chǎn)地黃精的重要指標(biāo),但目前尚無對(duì)中國藥典3種黃精根莖中總皂苷、總黃酮含量進(jìn)行比較的報(bào)道。
在黃精有效成分的各種提取方法中,加熱回流法的時(shí)間長、操作繁瑣[4];閃式提取法的提取容器受限、破碎后過濾難[5];微波消解法的成分易分解、條件不好掌握[6],而超聲輔助提取法的提取率高、時(shí)間短、適用范圍廣[7]。在各種提取條件優(yōu)化方法中,正交試驗(yàn)只能對(duì)一個(gè)孤立點(diǎn)分析,而響應(yīng)面法可以對(duì)各水平連續(xù)分析[8]。本研究以響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助乙醇提取黃精根莖中總皂苷、總黃酮,對(duì)3種黃精中總皂苷、總黃酮的含量進(jìn)行比較,為各產(chǎn)地黃精的質(zhì)量控制和資源開發(fā)提供參考。
GR150B研磨機(jī):合肥榮事達(dá)小家電有限公司;KQ-250B型數(shù)控超聲波清洗器:昆山市超聲儀器有限公司;DK-98-ⅡA電熱恒溫水浴鍋:天津市泰斯特儀器有限公司;島津UVmini-1240紫外分光光度計(jì):島津企業(yè)管理(中國)有限公司。
分析純香草醛、硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、冰乙酸、高氯酸、無水乙醇、95 %乙醇、甲醇購自天津市富宇精細(xì)化工有限公司;對(duì)照品:人參皂苷Rb1(批號(hào):110704-202028,含量≥98 %)、蘆丁(批號(hào):100080-201811,含量≥98 %)均購自中國食品藥品檢定研究院。
黃精生藥材經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院孫慧峰教授鑒定為黃精、滇黃精及多花黃精,詳見表1。
表1 黃精生藥材來源、產(chǎn)地、品種及批號(hào)
2.1.1 對(duì)照品溶液的制備
精密稱定人參皂苷Rb1、蘆丁對(duì)照品各2 mg,置于10 mL棕色容量瓶中,分別用甲醇、60%乙醇定容至刻度線,混勻,配制成0.2 mg/mL的人參皂苷Rb1、蘆丁對(duì)照品溶液,置4 ℃冰箱冷藏備用[9-10]。
2.1.2 供試品溶液的制備
黃精根莖,切片,置60 ℃烘箱干燥至恒重,粉碎,過4號(hào)篩。稱取黃精粉末3 g,置150 mL錐形瓶中,加80%乙醇20 mL,超聲0.5 h,提取3次,合并濾液,離心,取上清液水浴揮去乙醇至無醇味。用等體積正丁醇萃取3次,減壓揮去正丁醇,用甲醇復(fù)溶于10 mL容量瓶中,即總皂苷供試液;用等體積乙酸乙酯萃取3次,減壓揮去乙酸乙酯,用60%乙醇復(fù)溶于10 mL容量瓶中,即總黃酮供試液[9-10]。
2.1.3 對(duì)照品及供試品溶液顯色
2.1.3.1 人參皂苷Rb1對(duì)照品及總皂苷供試品溶液顯色
60 ℃水浴蒸干溶劑,加入新鮮配制的5%香草醛冰醋酸0.2 mL,冰浴下加入高氯酸0.8 mL,混勻,在60 ℃水浴下顯色18 min,轉(zhuǎn)移至10 mL具塞試管中,冰浴冷卻2 min,加入冰醋酸5 mL,混勻,靜置3 min。以甲醇為空白對(duì)照[10-11]。
2.1.3.2 蘆丁對(duì)照品及總黃酮供試品溶液顯色
將對(duì)照品及供試品溶液各濃縮至1 mL,轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中,加入5 %亞硝酸鈉1 mL,混勻,靜置5 min,加入10%硝酸鋁1 mL,混勻,靜置5 min,加入4%氫氧化鈉10 mL,用60%乙醇定容至刻度線處,混勻,靜置13 min。以60%乙醇為空白對(duì)照[10-11]。
2.1.4 檢測波長的確定
將顯色的對(duì)照品及供試品溶液,用紫外分光光度計(jì)在200~700 nm范圍內(nèi)掃描,測得總皂苷最大吸收波長為540 nm、總黃酮最大吸收波長為505 nm,分別定為總皂苷、總黃酮的檢測波長[10]。
2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
精密吸取人參皂苷Rb1對(duì)照品溶液各0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL置10 mL具塞試管中;蘆丁對(duì)照品溶液各0.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL置25 mL容量瓶中,按上述方法顯色分別于540 nm、505 nm波長處測定吸光度值,以吸光度值為縱坐標(biāo),人參皂苷Rb1、蘆丁濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[10],得總皂苷回歸方程:Y=6.433 9X+0.135 6(r=0.999 2),線性范圍:0.016~0.103 mg/mL;總黃酮回歸方程:Y=9.652 7X-0.000 9(r=0.999 8),線性范圍:0~0.083 mg/mL。
2.1.6 樣品含量測定
準(zhǔn)確稱量黃精粉末3 g,按上述方法制備顯色后分別于540 nm、505 nm測定吸光度值,平行測定3 次,代入各自回歸方程,計(jì)算含量后取平均值[10]。
2.2.1 精密度試驗(yàn)
取上述對(duì)照品溶液,連續(xù)測定6次,測得RSD均<1.610%。
2.2.2 回收率試驗(yàn)
取已知總皂苷、總黃酮含量的供試液各1 mL,共6份,分別加入對(duì)照品溶液1 800 μL、300 μL,按上述方法測定,測得RSD均<2.798%。
2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)
按上述方法制備供試液,在0、5、10、15、20、25、30 min時(shí)測定,測得RSD均<0.310%。
2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn)
按上述方法制備供試液,連續(xù)測定5次,測得RSD均<0.200%。
以液料比(A)、提取時(shí)間(B)、提取次數(shù)(C)為單因素試驗(yàn)的3個(gè)考察因素,確定提取的適宜范圍為液料比15~25、提取時(shí)間1~2 h、提取次數(shù)1~3 次,作為響應(yīng)面優(yōu)化的基礎(chǔ)。結(jié)合Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及Design Expert10.0.7軟件,采用以液料比(A)、提取時(shí)間(B)、提取次數(shù)(C)為自變量,總皂苷、總黃酮提取率(Y)為因變量的3因素3水平,進(jìn)行響應(yīng)面分析,因素與水平設(shè)計(jì)見表2[12]。
表2 響應(yīng)面分析因素與水平
響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。
表3 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)與結(jié)果
利用Design Exerpt10.0.7軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合,得總皂苷二次回歸方程:Y=0.720+0.042A+0.029B+0.150C+0.015AB+0.025AC+0.002 5BC-0.032A2-0.015B2+0.020C2;總黃酮二次回歸方程:Y=0.15+0.005 463A+0.015B+0.053C+0.001AB+0.007 075AC-0.007 35BC-0.015A2-0.006 288B2-0.018C2。顯著性試驗(yàn)P<0.01,表明該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,可用于響應(yīng)值的預(yù)測,響應(yīng)面曲面分析見圖1~圖6。
由圖1~圖6可知,對(duì)黃精總皂苷、總黃酮提取率的影響大小順序?yàn)椋阂毫媳?提取次數(shù)>提取時(shí)間。采用Design Exerpt10.0.7軟件得出的最優(yōu)提取條件為液料比25∶1、提取時(shí)間2 h、提取次數(shù)3次,預(yù)測總皂苷含量9.611 mg/g、總黃酮含量1.883 mg/g。
圖1 液料比與提取時(shí)間對(duì)總皂苷提取率的交互影響
圖2 液料比與提取次數(shù)對(duì)總皂苷提取率的交互影響
圖3 提取時(shí)間與提取次數(shù)對(duì)總皂苷提取率的交互影響
圖4 液料比與提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的交互影響
圖5 液料比與提取次數(shù)對(duì)總黃酮提取率的交互影響
圖6 提取時(shí)間與提取次數(shù)對(duì)總黃酮提取率的交互影響
3種黃精的每個(gè)批次均進(jìn)行3次平行測定,結(jié)果見表4。
表4 3種黃精中總皂苷、總黃酮含量
由表4可見,3種黃精中總皂苷、總黃酮含量各有差異,其中黃精中總皂苷含量顯著多于滇黃精及多花黃精,而總黃酮含量差異較小,黃精中總黃酮含量略多于滇黃精及多花黃精。
中國藥典中記載的黃精為傳統(tǒng)藥食同源植物,具有極高的藥用價(jià)值。此前黃精有效成分研究多集中于多糖的提取工藝及含量測定,而總皂苷、總黃酮也是其重要的活性成分。李麗等[6]優(yōu)化了黃精中總黃酮的提取條件,而對(duì)總皂苷未做分析;苑璐等[9]對(duì)嶗山種植的黃精中總皂苷提取條件進(jìn)行了優(yōu)化,而未與其他產(chǎn)地黃精進(jìn)比較分析;張麗等[10]優(yōu)化了黃精莖稈中總多糖、總皂苷及總黃酮的提取條件,但莖稈并非中國藥典所記載的黃精主要藥用部位。本研究以響應(yīng)面法精確地優(yōu)化了黃精最重要的藥用部位—根莖中總皂苷、總黃酮的超聲輔助乙醇提取條件,并對(duì)中國藥典中3種黃精的總皂苷、總黃酮含量進(jìn)行了比較分析。黃精(東北)中總皂苷、總黃酮含量多于滇黃精及多花黃精,體現(xiàn)了黃精(東北)藥用價(jià)值的優(yōu)越性,本研究方法及結(jié)果為各產(chǎn)地黃精的質(zhì)量控制和資源開發(fā)提供參考。