謝希，何清湖，陳平安，黃家望，朱夢晨，李玲

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410208)

慢性腎臟病(Chronic Kidney Disease，CKD)已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生問題。據(jù)估計(jì)，全球CKD的患病率為8%～16%[1]。腎纖維化是各種進(jìn)行性發(fā)展的腎臟疾病的共同歸宿，以成纖維細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的過度增生為主要特征[2]。TGFβ-Smads信號通路的激活和炎癥反應(yīng)在腎纖維化的過程中發(fā)揮著重要作用[1,3]。水通道蛋白(Aquaporins，AQPs)是一類參與水分子運(yùn)輸?shù)牡鞍准易澹軌蚪閷?dǎo)自由水的跨生物膜轉(zhuǎn)運(yùn)。目前在哺乳動物體內(nèi)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了13種AQPs，其中包括AQP1、AQP2和AQP3在內(nèi)的8種水通道蛋白在腎臟的不同部位表達(dá)[4]。腎纖維化動物模型腎組織中AQP1、AQP2和AQP3的表達(dá)顯著降低，提示上調(diào)水通道蛋白的表達(dá)可能是延緩和改善腎纖維化的有效途徑[5-7]。右歸丸出自《景岳全書》，由熟地黃、枸杞、山茱萸、肉桂等藥物組成，具有溫補(bǔ)腎陽、填精止遺的作用，主要適用于腎陽不足，命門火衰，腰膝酸軟等腎陽虛癥狀，臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)研究均表明右歸丸對慢性腎臟病具有良好療效[8-10]。但目前對于右歸丸是否通過上調(diào)水通道蛋白的表達(dá)來改善腎纖維化損傷的研究較少。本研究通過腺嘌呤建立CKD大鼠模型，以右歸丸為干預(yù)因素，探討其對CKD大鼠腎組織中水通道蛋白表達(dá)的影響，以期為右歸丸的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級雄性大鼠40只，體質(zhì)量220～240 g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物公司，動物質(zhì)量合格證號：SCXK(湘)2016-0002。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

腺嘌呤(Sigma-Aldrich貿(mào)易有限公司，A8626)，右歸丸(北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，Z11021040)，RIPA蛋白裂解液(CWBIO，CW2334S)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(CWBIO，CW0014S)，SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(CWBIO，CW0022)，彩色預(yù)染蛋白marker(Fermentas)，ECL發(fā)光檢測試劑盒(Thermo Fisher，35055)，TGF-β1抗體(Abcam，ab27969)，Smad-2抗體(Abcam，ab33875)，AQP1抗體(Bioss,bs-1506R)、AQP2(Bioss,bs-0261R)、AQP3 (Bioss,bs-1253R)，β-actin抗體(Bioss，bsm-33036M)，HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗(Proteintech，SA00001-1)，HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(Proteintech，SA00001-2)，大鼠TNFα Elisa試劑盒(Abcam，ab46070)，大鼠IL-10 Elisa試劑盒(Abcam，ab100764)。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器

微量移液器(德國Eppendorf)，水平搖床(北京六一儀器廠)，臺式高速冷凍離心機(jī)(美國Thermo)，多功能酶標(biāo)儀(美國Bio-tek，Synergy2)，電泳儀(美國Bio-rad)，垂直電泳槽(美國Bio-rad)，電轉(zhuǎn)槽(美國Bio-rad)，石蠟切片機(jī)(美國A0820)，化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(美國Bio-rad，ChemiDoc XRS+)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 CKD大鼠模型建立及實(shí)驗(yàn)分組

將40只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、左卡尼汀組和右歸丸組，參考YOKOZAWA T[11]的方法建立CKD大鼠模型，取腺嘌呤加純水配制成30 mg·mL-1的混懸液，每只大鼠每日攝入劑量為150 mg·kg-1，正常組給予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)4周。模型建立后，按照動物體表面積換算法，大鼠臨床給藥劑量分別為左卡尼汀0.323 g·kg-1和右歸丸2.913 g·kg-1，灌胃4周，水合氯醛麻醉后處理動物。

2.2 檢測指標(biāo)

2.2.1 HE染色觀察大鼠腎組織病理學(xué)變化

取大鼠腎組織用4%多聚甲醛固定，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟切片，HE染色，脫水，透明，封片，于顯微鏡下觀察腎組織病理變化。

2.2.2 透射電鏡觀察大鼠腎組織超微病理學(xué)變化

取大鼠腎組織用2.5%戊二醛固定，經(jīng)過常規(guī)電鏡處理方法進(jìn)行脫水、浸泡、包埋、固化、切片和染色等步驟，最后在透射電鏡下觀察。

2.2.3 免疫組織化學(xué)法檢測腎組織中AQP1、AQP2和AQP3的蛋白定位與半定量表達(dá)情況

取大鼠腎組織用4%多聚甲醛固定，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟切片，脫蠟，抗原修復(fù)，一抗孵育，PBS洗滌3次，滴加第二抗體，30 min后洗滌，滴加鏈霉素-親和素-生物素復(fù)合物，30 min后洗滌，加DAB溶液進(jìn)行顯色，30 min后洗凈，蘇木素復(fù)染，隨后脫水，透明，封片，于顯微鏡下觀察腎組織染色情況，染色呈棕黃色為陽性，利用圖像分析軟件Image Pro Plus 6.0對圖像進(jìn)行信號分析，計(jì)算各視野的平均光密度值(IOD/Area)。

2.2.4 Western blot法檢測腎組織中TGF-β1、Smad-2、AQP1、AQP2和AQP3蛋白的表達(dá)水平

取大鼠腎組織，RIPA裂解液提取腎組織總蛋白，BCA法測蛋白濃度，定量取50 μg蛋白變性，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗β-actin、TGF-β1、Smad-2、AQP1、AQP2和AQP3多克隆抗體按照1∶1 000的比例稀釋，4 ℃過夜，TBST洗3次，二抗1∶3 000比例稀釋，37 ℃孵育1 h，洗滌后，加ECL顯影，用化學(xué)發(fā)光成像儀進(jìn)行顯影，用圖像分析軟件Image J對圖像進(jìn)行信號分析，計(jì)算靶蛋白/β-actin的值。

2.2.5 酶聯(lián)免疫吸附法檢測大鼠血清中TNFα和IL-10表達(dá)水平

根據(jù)Elisa試劑盒說明書，檢測各組大鼠血清中TNFα和IL-10的含量。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 右歸丸對大鼠腎組織病理變化的影響

如圖1所示,正常組大鼠腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)完整，大小均勻，腎組織未見壞死、未見炎性細(xì)胞浸潤及水腫滲出；模型組大鼠腎組織大面積壞死，腎小球硬化，健存腎小球數(shù)量減少，腎小球上皮細(xì)胞脫落減少，腎小管管腔狹窄，管壁增厚，健存的管腔呈囊性擴(kuò)張，其中有滲出和炎性細(xì)胞浸潤，大量腺嘌呤晶體沉積。右歸丸組和左卡尼汀組大鼠腎組織炎癥反應(yīng)程度顯著好轉(zhuǎn)，腎小球硬化和纖維化情況轉(zhuǎn)輕。

3.2 右歸丸對大鼠腎組織超微病理變化的影響

如圖2所示,正常組大鼠腎臟腎小球?yàn)V過膜(三層：內(nèi)層為內(nèi)皮細(xì)胞、中間層為基底膜、外層為上皮細(xì)胞和足細(xì)胞)見高電子密度致密物沉積于腎小球基底膜內(nèi)側(cè)，內(nèi)皮細(xì)胞下，大小不等的團(tuán)塊狀，上皮細(xì)胞下偶見少量沉積物，基底膜局部輕微增厚。模型組大鼠腎臟腎小球?yàn)V過膜見上皮細(xì)胞腫脹，胞漿呈低電子密度，線粒體腫脹，脊斷裂、消失呈低電子密度空泡狀，細(xì)胞核核膜擴(kuò)張；基底膜彌漫性高度增厚，基底膜中層粗大帶狀高電子致密物沉積，內(nèi)皮細(xì)胞下、基底膜內(nèi)側(cè)見高電子致密物沉積，上皮細(xì)胞下、基底膜外側(cè)和上皮細(xì)胞下見駝峰樣高電子致密物沉積。右歸丸組和左卡尼汀組的大鼠腎組織上述超微病理改變程度減輕。

圖2 各組大鼠腎組織超微病理改變觀察結(jié)果

3.3 右歸丸對大鼠腎組織AQP1、AQP2和AQP3蛋白表達(dá)的影響

如圖3和表1所示：AQP1主要表達(dá)于腎近曲小管，AQP2和AQP3主要表達(dá)于腎集合管。模型組大鼠腎組織中AQP1、AQP2、AQP3蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。藥物干預(yù)后,右歸丸組和左卡尼汀組大鼠腎組織中AQP1、AQP2、AQP3的表達(dá)水平均顯著提高(P<0.05)。

圖3 各組大鼠腎組織AQP1、AQP2和AQP3蛋白定位與表達(dá)水平

表1 各組大鼠腎組織AQP1、AQP2和AQP3蛋白平均光密度

3.4 右歸丸對大鼠腎組織TGF-β1、 Smad-2、AQP1、AQP2和AQP3蛋白表達(dá)的影響

如圖4和表2所示：模型組大鼠腎組織中TGF-β1、Smad-2蛋白的表達(dá)水平顯著提高(P<0.05)，AQP1、AQP2和AQP3蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。藥物干預(yù)后，右歸丸組和左卡尼汀組大鼠腎組織中TGF-β1和Smad-2的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，AQP1、AQP2、AQP3的表達(dá)水平顯著提高(P<0.05)。

圖4 各組大鼠腎組織TGF-β1、Smad-2、AQP1、AQP2和AQP3表達(dá)水平

表2 各組大鼠腎組織TGF-β1、Smad-2、AQP1、AQP2和AQP3表達(dá)水平

3.5 右歸丸對大鼠血清IL-10和TNF-α水平的影響

如表3所示：與正常組比較，模型組大鼠血清中TNFα水平顯著提高，IL-10水平顯著降低。與模型組比較，右歸丸組的大鼠血清中TNFα水平顯著降低，IL-10水平顯著提高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 各組大鼠血清TNFα和IL-10水平

4 討論

慢性腎臟病是一種由腎臟損傷導(dǎo)致的隱匿性疾病，最終可能導(dǎo)致終末腎疾病，預(yù)后較差。腎小球?yàn)V過率(Glomerular Filtration Rate，GFR)是診斷CKD的最佳指標(biāo)，當(dāng)GFR小于60 mL/(min·1.73 m2)，并持續(xù)3個月以上，即可診斷為CKD。許多慢性腎臟疾病的最終常見病理表現(xiàn)是腎纖維化。腎纖維化是由于慢性、持續(xù)性腎損傷后腎組織愈合不成功導(dǎo)致的，其特征是腎小球硬化，腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化。這些病理改變是導(dǎo)致腎小球?yàn)V過率下降的直接原因。

AQP1是最先發(fā)現(xiàn)的水通道蛋白，其主要分布于近端小管的頂端膜和基底側(cè)膜，參與水的重吸收。AQP2主要位于集合管主細(xì)胞的頂端膜上，其重吸收功能主要受精氨酸加壓素的調(diào)節(jié)。AQP3則位于集合管主細(xì)胞的基底側(cè)膜[4]。研究表明[5,12]，AQP1在腎纖維化中表達(dá)是降低的，它與腎纖維化中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)密切相關(guān)，敲除促EMT相關(guān)基因后，AQP1表達(dá)顯著升高，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)則表明，用轉(zhuǎn)化生長因子1(TGF-β1)刺激腎近曲小管上皮細(xì)胞后，AQP1蛋白表達(dá)水平顯著下降，提示AQP1的表達(dá)與TGF-β1信號通路相關(guān)。AQP2是目前腎臟中研究最多的水通道蛋白，上調(diào)AQP2蛋白表達(dá)可減少腎纖維化大鼠尿量，改善腎臟功能[13]。AQP3可以通過激活MAPK信號通路，對腎臟和MDCK細(xì)胞凋亡起保護(hù)作用[14]。敲除AQP3基因后，AQP2蛋白表達(dá)也明顯下調(diào)，小鼠表現(xiàn)出明顯的尿液濃縮功能障礙[15]，說明AQP2與AQP3表達(dá)是相互影響的。本研究通過Western blot、免疫組織化學(xué)技術(shù)，對大鼠腎組織中的AQP1、AQP2和AQP3蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組的大鼠腎組織中AQP1、AQP2和AQP3蛋白表達(dá)水平均顯著下降(P<0.05)；與模型組比較，右歸丸組和左卡尼汀組的大鼠腎組織中AQP1、AQP2和AQP3蛋白的表達(dá)水平均顯著提高(P<0.05)。

TGFβ/Smads信號通路的激活是導(dǎo)致腎纖維化最重要的機(jī)制之一[3]。TGF-β主要通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)、減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解和誘導(dǎo)不同類型的細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞從而誘導(dǎo)腎纖維化的產(chǎn)生[3,16]。本研究表明：與正常組比較，模型組的大鼠腎組織中TGF-β1和Smad-2的表達(dá)顯著提高(P<0.05)。與模型組的大鼠比較，右歸丸組和左卡尼汀組的大鼠腎組織中TGF-β1和Smad-2蛋白表達(dá)含量顯著降低(P<0.05)。

大量證據(jù)表明炎癥反應(yīng)在腎纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用[1]。腫瘤壞死因子α(TNFα)對于機(jī)體內(nèi)環(huán)境的平衡極為重要，在細(xì)胞生存，凋亡，壞死以及細(xì)胞間通訊中發(fā)揮著重要作用，這些細(xì)胞生理功能的紊亂會造成機(jī)體的炎癥[17]。TNFα可以刺激IL-1β、CCL2、TGFβ1的釋放[18]。各種腎臟疾病患者體內(nèi)的TNFα水平均增加[19-20]。通過降低TNFα的水平可以延緩CKD在各種動物模型中的進(jìn)展[21]。白介素10(IL-10)作為一種免疫抑制細(xì)胞因子主要起限制炎癥反應(yīng)、上調(diào)免疫力和促進(jìn)組織修復(fù)的作用，在感染和炎癥過程中維持組織穩(wěn)態(tài)[22]。有研究表明[23-24]，IL-10可以抑制腎小球腎炎和腎小球硬化的發(fā)生，敲除IL-10基因后加重了腎損傷模型中的腎纖維化。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組的大鼠比較，模型組的大鼠血清中TNFα的水平顯著升高，IL-10的水平顯著降低；與模型組比較，右歸丸組和左卡尼汀組的大鼠血清中TNFα的水平顯著降低，IL-10的水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

綜上所述，右歸丸可能是通過抑制TGFβ/Smads信號通路的激活、提高AQP1、AQP2和AQP3蛋白的表達(dá)水平、抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)、提高機(jī)體抗炎能力，改善腎纖維化，從而實(shí)現(xiàn)對慢性腎臟病大鼠的保護(hù)作用。但本研究尚有諸多不足之處，如右歸丸對慢性腎臟病干預(yù)作用的量效關(guān)系，以及右歸丸提高腎組織AQPs表達(dá)的具體機(jī)制及其發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎(chǔ)等均有待進(jìn)一步研究。