何躍輝 陳狄 高謙 施平華 金輝 馮艷蘋 尤叢蕾 湯莉娜

北京積水潭醫(yī)院，北京 100035

低密度脂蛋白受體相關蛋白5(low-density lipoprotein receptor-related protein 5，LRP5) 是一種定位于11q13.4染色體的細胞膜表面蛋白[1]，全長約136 kb，屬低密度脂蛋白受體超家族的一員，共包含23個外顯子[2-3]。目前LRP5 基因在人體中的作用尚未完全闡明，但多項針對小鼠的動物研究顯示，LRP5基因在小鼠體內(nèi)的作用是維持糖、脂代謝，并參與葡萄糖誘導的胰島素分泌過程[4]。人與小鼠LRP5基因的同源性研究顯示，其蛋白序列的同源性高達94 %[5]，由此推測LRP5 基因?qū)θ梭w的糖脂代謝有調(diào)節(jié)作用。近年來有研究在成骨細胞上發(fā)現(xiàn)LRP5基因表達，而檢測破骨細胞則未發(fā)現(xiàn)LRP5基因表達[6]。因此LRP5基因?qū)θ祟惞橇考俺晒羌毎淖饔贸蔀榻陙泶x性骨病研究的熱點。2型糖尿病(type 2 diabetic，T2DM)是代謝性疾病之一[7]。骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP) 是一種全身性骨疾病，特點是骨密度下降，骨折風險增高。絕經(jīng)后女性由于雌激素缺乏，是OP的高發(fā)人群。有研究掃描人類LRP5基因時發(fā)現(xiàn)，在7個序列中，A1330V和Q89R為預測替換LRP5蛋白上的氨基酸，A1330V、Q89R位點基因型的改變可改變氨基酸，可能會影響LRP5基因正常作用的發(fā)揮[8]。為此，本研究通過對T2DM伴OP組、T2DM組、OP組與健康對照組受試者LRP5基因A1330V、Q89R位點基因型分布特點、糖代謝骨代謝指標及T2DM伴OP患者不同基因型糖代謝骨代謝指標進行分析，旨在進一步探討T2DM與OP的發(fā)病機制，為該病的預療提供理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 一般資料

2018年10月至2020年10月我院門診81例絕經(jīng)后T2DM患者，根據(jù)是否伴OP分為T2DM伴OP組39例，年齡52～61歲；T2DM組42例，年齡51～60歲；單純OP患者40例為OP組，年齡53～62歲；同期體檢中心健康體檢的絕經(jīng)后女性40例為對照組，年齡52～60歲；各組年齡、絕經(jīng)年限、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組基線資料比較Table 1 Comparison of baseline data between each

1.2 納入及排除標準

本研究經(jīng)院醫(yī)學倫理委員會批準。納入標準：①絕經(jīng)后女性；②T2DM組患者均符合1999年WHO推薦的T2DM診斷標準，OP組患者均符合1994年WHO推薦的OP診斷標準，T2DM伴OP組患者均符合上述兩項診斷標準；③患者知情同意接受相關指標檢測，知情同意研究方法，并簽署知情同意書。排除標準：①合并甲亢等影響骨代謝指標的疾病患者；②嚴重的心、肝、腎疾病患者，消化道疾病可能影響鈣、磷吸收患者；③合并惡性腫瘤患者；④服用降鈣素、雌激素、維生素K等對糖代謝、骨代謝指標有影響藥物的患者。

1.3 檢測方法

1.3.1骨密度(BMD)檢測方法：雙能X線骨密度測量儀(美國GE公司)對受試者股骨頸、腰椎前后位、大轉(zhuǎn)子Troeh區(qū)和非優(yōu)勢側(cè)Ward三角區(qū)的BMD值進行檢測。所有受試者的BMD檢測均由同一人員操作以減少誤差。

1.3.2LRP5基因DNA提取及PCR反應方法：DNA試劑盒(德國QIAGEN公司)；DralII限制酶(Bio Basic公司)；AvaⅡ限制酶(大連寶生物工程有限公司)；PCR試劑盒(安徽優(yōu)晶生物工程有限公司)；酶反應產(chǎn)物純化試劑盒(安徽優(yōu)晶生物工程有限公司)。

所有受試者均抽取5 mL空腹靜脈血置于2 %EDTA抗凝管中搖勻，離心后留取中層白細胞濃縮層，提取DNA。

設計引物序列，并經(jīng)計算機檢索，確保引物序列與非擴增區(qū)無同源性。A1330V位點引物序列組成：上游引物：5’-GCTGGGCTGTTGATGTITAGA-3’，下游引物：5’-AGAGGCAAGGTTTTCCCATAA-3’。Q89R位點引物序列組成：上游引物：5’-TCTGGGCATAGTGCTCCATC-3’，下游引物：5’-TTCCGGGATGTGCCATTGAG-3’。PCR反應條件如下：預變性94 ℃，5 min，變性94 ℃，30 s，退火59 ℃，45 s，延伸72 ℃，1 min，循環(huán)35次，72 ℃再延伸10 min。電泳后在紫外分析儀下顯示被內(nèi)切酶切斷的DNA片斷。

A1330V多態(tài)性DraⅢ酶片段：AA基因型(野生型)143 bp；AV基因型(雜合子)143 bp、119 bp、24 bp；VV基因型(突變型)119 bp、24 bp。

Q89R多態(tài)性 AvaⅡ酶片段： QQ基因型(野生型)436bp；QR基因型(雜合子)436bp、274 bp、162 bp；RR基因型(突變型)274 bp、162 bp。

由兩人對結(jié)果進行判讀，判讀結(jié)果一致后得出結(jié)論。

1.3.3骨代謝指標檢測：采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP-5b)、血清骨堿性磷酸酶(BALP)。4 l～8l歲女性TRACP-5b 參考值范圍為2.34～4.04 U/L。BALP參考值范圍為12.5～22.4 μg/L。

1.3.4糖代謝指標檢測：采用高壓液相法在全自動糖化血紅蛋白分析儀上檢測糖化血紅蛋白(HbAIC)，4 l～8l歲女性正常參考值范圍為4.5 %～6.2 %；采用放射免疫分析法檢測空腹胰島素(FINS)，4 l～8l歲女性正常參考值范圍為1.22～25.5 mol/L。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 各組骨密度、骨代謝、糖代謝指標比較

T2DM伴OP組HbAIC、FINS高于對照組，腰L2-4BMD、股骨頸BMD低于對照組；T2DM組HbAIC、FINS高于對照組；OP組腰L2-4BMD、股骨頸BMD低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組骨密度、骨代謝、糖代謝指標比較Table 2 Comparison of bone mineral density, bone metabolism, and glucose metabolism indicators between each

2.2 各組LRP5基因A1330V、Q89R位點基因型分布

T2DM伴OP組、T2DM組和OP組LRP5基因A1330V位點AA型、AV型、VV型分布與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。T2DM伴OP組、T2DM組和OP組LRP5基因Q89R位點基因型分布與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表3。

表3 各組LRP5基因A1330V、Q89R位點基因型分布[n(%)]Table 3 The genotype distribution of LRP5 gene A1330V and Q89R locus in each group[n(%)]

2.3 T2DM伴OP患者LRP5基因多態(tài)與骨代謝和糖代謝的關系

T2DM伴OP組LRP5基因A1330V位點AA型、AV型、VV型HbAIC、腰L2-4BMD、股骨頸BMD差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。AA型、AV型、VV型TRACP-5b、BALP、FINS比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表4。

表4 T2DM伴OP組LRP5基因A1330V位點AA型與VV型骨代謝與糖代謝指標比較Table 4 Comparison of bone metabolism and glucose metabolism indexes between AA and VV type at the A1330V site of LRP5 gene in T2DM with OP

3 討論

T2DM與OP均是臨床發(fā)病率較高的疾病，特別是絕經(jīng)后女性是OP的高危人群。T2DM與OP的病因受環(huán)境和遺傳等多因素影響，多種基因參與其中。本研究共納入了161名絕經(jīng)后女性，并根據(jù)疾病分為T2DM伴OP組、T2DM組、OP組和對照組，各組年齡、絕經(jīng)年限、BMI差異均無統(tǒng)計學意義。但T2DM伴OP組、T2DM組HbAIC、FINS高于對照組；T2DM伴OP組、OP組腰L2-4BMD、股骨頸BMD均低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義。說明T2DM伴OP患者較之健康者存在明顯的糖代謝和骨代謝異常。

目前研究發(fā)現(xiàn)，細胞因子基因、性激素受體基因等調(diào)節(jié)鈣、磷代謝的激素及其受體基因在T2DM與OP的發(fā)生與進展中起著重要作用[9]。近年來，LRP5基因引起了臨床的廣泛關注，Nonhem印跡分析顯示人類LRP5基因在心、肝、肺、骨骼、小腸、腦及骨骼等多個器官組織中均有表達[10]?；蚨鄳B(tài)性是指在某個生物群體中，經(jīng)?；蛲瑫r存在兩種或兩種以上不連續(xù)的變異型或基因型。王永蘭等[11]研究了LRP5基因多態(tài)性與絕經(jīng)后2型糖尿病骨質(zhì)疏松癥的關系，認為LRP5基因多態(tài)性與患者BMI、胰島素水平增高有關，認為LRP5基因多態(tài)性可能是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的易感基因。但王永蘭等未針對LRP5基因A1330V、Q89R位點多態(tài)性、突變對骨密度與糖代謝的關系進行研究，所以不明確具體的位點。本研究發(fā)現(xiàn)本地絕經(jīng)后女性LRP5基因在A1330V、Q89R位點呈多態(tài)性，其中T2DM伴OP組LRP5基因A1330V位點AA型、AV型、VV型構成分別為28.21 %、28.21 %、46.15 %；T2DM組為45.24 %、38.10 %、11.90 %；OP組分別為55.00 %、15.00 %、30.00 %；對照組分別為65.00 %、32.50 %、2.50 %，T2DM伴OP組、T2DM組和OP組AV型、VV型均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義。提示LRP5基因A1330V位點多態(tài)性及突變與糖代謝、骨代謝有關，可能是T2DM、T2DM伴OP、OP患者LRP5基因多態(tài)性及突變致單核苷酸突變，其受體信號傳導系統(tǒng)隨之改變，從而影響到LRP5基因與配體的結(jié)合而導致了T2DM、OP的發(fā)生。LRP5基因Q89R多態(tài)性在白人及其他種族中出現(xiàn)的頻率較低，但在亞洲人群中出現(xiàn)的頻率較多。本研究中T2DM伴OP組、T2DM組、OP組和對照組均檢出了QQ型、QR型，未檢出RR型，可能與樣本量較少有關。T2DM伴OP組、T2DM組、OP組LRP5基因Q89R位點基因型分布與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義?？赡躄RP5基因Q89R位點多態(tài)性與糖代謝、骨代謝無關。

Johnston[12]認為，人體骨量的差別是由環(huán)境和遺傳因素決定的，其中前者占20 %，后者占80 %。同時有研究通過對兩卵雙生和一卵雙生雙胞胎骨量的研究發(fā)現(xiàn)，骨量的獲得是通過基因調(diào)節(jié)的[13]。目前已知調(diào)控骨密度和骨代謝的基因包括三類：第一類是骨鈣素BGP基因、鈣感受性受體CASR基因等影響骨量獲得的基因；第二類是降鈣素受體CTR基因、ER基因等影響骨量丟失的基因；第三類是轉(zhuǎn)錄生長因子TGF-β1基因、VDR基因等對骨量獲得和丟失均可能有影響的基因[14]。LRP5基因可作為Wnt共受體參與Wnt信號傳導，其蛋白觸發(fā)的主要信號傳導途徑為Wnt-β粘連素途徑，又稱規(guī)范化Wnt信號途徑。近年來，一項針對亞洲人群LRP5基因A1330V多態(tài)性的研究顯示，A1330V位點與骨密度相關[15]。但也有研究發(fā)現(xiàn)LRP5基因A1330V位點多態(tài)性及突變與骨密度無相關性[16]。本研究結(jié)果顯示，T2DM伴OP組LRP5基因A1330V位點AA型、AV型、VV型HbAIC、腰L2-4BMD、股骨頸BMD差異均有統(tǒng)計學意義。說明本地人群中LRP5基因A1330V位點多態(tài)性及突然對絕經(jīng)后女性T2DM和OP的發(fā)生有影響。

綜上所述，LRP5基因可能是絕經(jīng)后女性T2DM和OP的易感基因，A1330V位點多態(tài)性及突變可能對絕經(jīng)后女性T2DM和OP的發(fā)生有影響，Q89R位點多態(tài)性及突變與糖代謝、骨代謝無關。同時T2DM與OP兩種疾病均為多因素疾病，一種或兩種基因的調(diào)節(jié)作用有限，與之相關的候選基因還有很多，應通過各項生物分子學的手段對候選基因的作用機制進行分析，為T2DM與OP的防治提供指導。