何躍輝 陳狄 高謙 施平華 金輝 馮艷蘋 尤叢蕾 湯莉娜

北京積水潭醫(yī)院，北京 100035

低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5(low-density lipoprotein receptor-related protein 5，LRP5) 是一種定位于11q13.4染色體的細(xì)胞膜表面蛋白[1]，全長(zhǎng)約136 kb，屬低密度脂蛋白受體超家族的一員，共包含23個(gè)外顯子[2-3]。目前LRP5 基因在人體中的作用尚未完全闡明，但多項(xiàng)針對(duì)小鼠的動(dòng)物研究顯示，LRP5基因在小鼠體內(nèi)的作用是維持糖、脂代謝，并參與葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌過程[4]。人與小鼠LRP5基因的同源性研究顯示，其蛋白序列的同源性高達(dá)94 %[5]，由此推測(cè)LRP5 基因?qū)θ梭w的糖脂代謝有調(diào)節(jié)作用。近年來有研究在成骨細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)LRP5基因表達(dá)，而檢測(cè)破骨細(xì)胞則未發(fā)現(xiàn)LRP5基因表達(dá)[6]。因此LRP5基因?qū)θ祟惞橇考俺晒羌?xì)胞的作用成為近年來代謝性骨病研究的熱點(diǎn)。2型糖尿病(type 2 diabetic，T2DM)是代謝性疾病之一[7]。骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP) 是一種全身性骨疾病，特點(diǎn)是骨密度下降，骨折風(fēng)險(xiǎn)增高。絕經(jīng)后女性由于雌激素缺乏，是OP的高發(fā)人群。有研究掃描人類LRP5基因時(shí)發(fā)現(xiàn)，在7個(gè)序列中，A1330V和Q89R為預(yù)測(cè)替換LRP5蛋白上的氨基酸，A1330V、Q89R位點(diǎn)基因型的改變可改變氨基酸，可能會(huì)影響LRP5基因正常作用的發(fā)揮[8]。為此，本研究通過對(duì)T2DM伴OP組、T2DM組、OP組與健康對(duì)照組受試者LRP5基因A1330V、Q89R位點(diǎn)基因型分布特點(diǎn)、糖代謝骨代謝指標(biāo)及T2DM伴OP患者不同基因型糖代謝骨代謝指標(biāo)進(jìn)行分析，旨在進(jìn)一步探討T2DM與OP的發(fā)病機(jī)制，為該病的預(yù)療提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 一般資料

2018年10月至2020年10月我院門診81例絕經(jīng)后T2DM患者，根據(jù)是否伴OP分為T2DM伴OP組39例，年齡52～61歲；T2DM組42例，年齡51～60歲；單純OP患者40例為OP組，年齡53～62歲；同期體檢中心健康體檢的絕經(jīng)后女性40例為對(duì)照組，年齡52～60歲；各組年齡、絕經(jīng)年限、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組基線資料比較Table 1 Comparison of baseline data between each

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

本研究經(jīng)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①絕經(jīng)后女性；②T2DM組患者均符合1999年WHO推薦的T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)，OP組患者均符合1994年WHO推薦的OP診斷標(biāo)準(zhǔn)，T2DM伴OP組患者均符合上述兩項(xiàng)診斷標(biāo)準(zhǔn)；③患者知情同意接受相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)，知情同意研究方法，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并甲亢等影響骨代謝指標(biāo)的疾病患者；②嚴(yán)重的心、肝、腎疾病患者，消化道疾病可能影響鈣、磷吸收患者；③合并惡性腫瘤患者；④服用降鈣素、雌激素、維生素K等對(duì)糖代謝、骨代謝指標(biāo)有影響藥物的患者。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1骨密度(BMD)檢測(cè)方法：雙能X線骨密度測(cè)量?jī)x(美國(guó)GE公司)對(duì)受試者股骨頸、腰椎前后位、大轉(zhuǎn)子Troeh區(qū)和非優(yōu)勢(shì)側(cè)Ward三角區(qū)的BMD值進(jìn)行檢測(cè)。所有受試者的BMD檢測(cè)均由同一人員操作以減少誤差。

1.3.2LRP5基因DNA提取及PCR反應(yīng)方法：DNA試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司)；DralII限制酶(Bio Basic公司)；AvaⅡ限制酶(大連寶生物工程有限公司)；PCR試劑盒(安徽優(yōu)晶生物工程有限公司)；酶反應(yīng)產(chǎn)物純化試劑盒(安徽優(yōu)晶生物工程有限公司)。

所有受試者均抽取5 mL空腹靜脈血置于2 %EDTA抗凝管中搖勻，離心后留取中層白細(xì)胞濃縮層，提取DNA。

設(shè)計(jì)引物序列，并經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索，確保引物序列與非擴(kuò)增區(qū)無同源性。A1330V位點(diǎn)引物序列組成：上游引物：5’-GCTGGGCTGTTGATGTITAGA-3’，下游引物：5’-AGAGGCAAGGTTTTCCCATAA-3’。Q89R位點(diǎn)引物序列組成：上游引物：5’-TCTGGGCATAGTGCTCCATC-3’，下游引物：5’-TTCCGGGATGTGCCATTGAG-3’。PCR反應(yīng)條件如下：預(yù)變性94 ℃，5 min，變性94 ℃，30 s，退火59 ℃，45 s，延伸72 ℃，1 min，循環(huán)35次，72 ℃再延伸10 min。電泳后在紫外分析儀下顯示被內(nèi)切酶切斷的DNA片斷。

A1330V多態(tài)性DraⅢ酶片段：AA基因型(野生型)143 bp；AV基因型(雜合子)143 bp、119 bp、24 bp；VV基因型(突變型)119 bp、24 bp。

Q89R多態(tài)性 AvaⅡ酶片段： QQ基因型(野生型)436bp；QR基因型(雜合子)436bp、274 bp、162 bp；RR基因型(突變型)274 bp、162 bp。

由兩人對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀，判讀結(jié)果一致后得出結(jié)論。

1.3.3骨代謝指標(biāo)檢測(cè)：采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP-5b)、血清骨堿性磷酸酶(BALP)。4 l～8l歲女性TRACP-5b 參考值范圍為2.34～4.04 U/L。BALP參考值范圍為12.5～22.4 μg/L。

1.3.4糖代謝指標(biāo)檢測(cè)：采用高壓液相法在全自動(dòng)糖化血紅蛋白分析儀上檢測(cè)糖化血紅蛋白(HbAIC)，4 l～8l歲女性正常參考值范圍為4.5 %～6.2 %；采用放射免疫分析法檢測(cè)空腹胰島素(FINS)，4 l～8l歲女性正常參考值范圍為1.22～25.5 mol/L。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組骨密度、骨代謝、糖代謝指標(biāo)比較

T2DM伴OP組HbAIC、FINS高于對(duì)照組，腰L2-4BMD、股骨頸BMD低于對(duì)照組；T2DM組HbAIC、FINS高于對(duì)照組；OP組腰L2-4BMD、股骨頸BMD低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組骨密度、骨代謝、糖代謝指標(biāo)比較Table 2 Comparison of bone mineral density, bone metabolism, and glucose metabolism indicators between each

2.2 各組LRP5基因A1330V、Q89R位點(diǎn)基因型分布

T2DM伴OP組、T2DM組和OP組LRP5基因A1330V位點(diǎn)AA型、AV型、VV型分布與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。T2DM伴OP組、T2DM組和OP組LRP5基因Q89R位點(diǎn)基因型分布與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表3。

表3 各組LRP5基因A1330V、Q89R位點(diǎn)基因型分布[n(%)]Table 3 The genotype distribution of LRP5 gene A1330V and Q89R locus in each group[n(%)]

2.3 T2DM伴OP患者LRP5基因多態(tài)與骨代謝和糖代謝的關(guān)系

T2DM伴OP組LRP5基因A1330V位點(diǎn)AA型、AV型、VV型HbAIC、腰L2-4BMD、股骨頸BMD差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。AA型、AV型、VV型TRACP-5b、BALP、FINS比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表4。

表4 T2DM伴OP組LRP5基因A1330V位點(diǎn)AA型與VV型骨代謝與糖代謝指標(biāo)比較Table 4 Comparison of bone metabolism and glucose metabolism indexes between AA and VV type at the A1330V site of LRP5 gene in T2DM with OP

3 討論

T2DM與OP均是臨床發(fā)病率較高的疾病，特別是絕經(jīng)后女性是OP的高危人群。T2DM與OP的病因受環(huán)境和遺傳等多因素影響，多種基因參與其中。本研究共納入了161名絕經(jīng)后女性，并根據(jù)疾病分為T2DM伴OP組、T2DM組、OP組和對(duì)照組，各組年齡、絕經(jīng)年限、BMI差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但T2DM伴OP組、T2DM組HbAIC、FINS高于對(duì)照組；T2DM伴OP組、OP組腰L2-4BMD、股骨頸BMD均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明T2DM伴OP患者較之健康者存在明顯的糖代謝和骨代謝異常。

目前研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子基因、性激素受體基因等調(diào)節(jié)鈣、磷代謝的激素及其受體基因在T2DM與OP的發(fā)生與進(jìn)展中起著重要作用[9]。近年來，LRP5基因引起了臨床的廣泛關(guān)注，Nonhem印跡分析顯示人類LRP5基因在心、肝、肺、骨骼、小腸、腦及骨骼等多個(gè)器官組織中均有表達(dá)[10]。基因多態(tài)性是指在某個(gè)生物群體中，經(jīng)常或同時(shí)存在兩種或兩種以上不連續(xù)的變異型或基因型。王永蘭等[11]研究了LRP5基因多態(tài)性與絕經(jīng)后2型糖尿病骨質(zhì)疏松癥的關(guān)系，認(rèn)為L(zhǎng)RP5基因多態(tài)性與患者BMI、胰島素水平增高有關(guān)，認(rèn)為L(zhǎng)RP5基因多態(tài)性可能是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的易感基因。但王永蘭等未針對(duì)LRP5基因A1330V、Q89R位點(diǎn)多態(tài)性、突變對(duì)骨密度與糖代謝的關(guān)系進(jìn)行研究，所以不明確具體的位點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)本地絕經(jīng)后女性LRP5基因在A1330V、Q89R位點(diǎn)呈多態(tài)性，其中T2DM伴OP組LRP5基因A1330V位點(diǎn)AA型、AV型、VV型構(gòu)成分別為28.21 %、28.21 %、46.15 %；T2DM組為45.24 %、38.10 %、11.90 %；OP組分別為55.00 %、15.00 %、30.00 %；對(duì)照組分別為65.00 %、32.50 %、2.50 %，T2DM伴OP組、T2DM組和OP組AV型、VV型均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示LRP5基因A1330V位點(diǎn)多態(tài)性及突變與糖代謝、骨代謝有關(guān)，可能是T2DM、T2DM伴OP、OP患者LRP5基因多態(tài)性及突變致單核苷酸突變，其受體信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)隨之改變，從而影響到LRP5基因與配體的結(jié)合而導(dǎo)致了T2DM、OP的發(fā)生。LRP5基因Q89R多態(tài)性在白人及其他種族中出現(xiàn)的頻率較低，但在亞洲人群中出現(xiàn)的頻率較多。本研究中T2DM伴OP組、T2DM組、OP組和對(duì)照組均檢出了QQ型、QR型，未檢出RR型，可能與樣本量較少有關(guān)。T2DM伴OP組、T2DM組、OP組LRP5基因Q89R位點(diǎn)基因型分布與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？赡躄RP5基因Q89R位點(diǎn)多態(tài)性與糖代謝、骨代謝無關(guān)。

Johnston[12]認(rèn)為，人體骨量的差別是由環(huán)境和遺傳因素決定的，其中前者占20 %，后者占80 %。同時(shí)有研究通過對(duì)兩卵雙生和一卵雙生雙胞胎骨量的研究發(fā)現(xiàn)，骨量的獲得是通過基因調(diào)節(jié)的[13]。目前已知調(diào)控骨密度和骨代謝的基因包括三類：第一類是骨鈣素BGP基因、鈣感受性受體CASR基因等影響骨量獲得的基因；第二類是降鈣素受體CTR基因、ER基因等影響骨量丟失的基因；第三類是轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子TGF-β1基因、VDR基因等對(duì)骨量獲得和丟失均可能有影響的基因[14]。LRP5基因可作為Wnt共受體參與Wnt信號(hào)傳導(dǎo)，其蛋白觸發(fā)的主要信號(hào)傳導(dǎo)途徑為Wnt-β粘連素途徑，又稱規(guī)范化Wnt信號(hào)途徑。近年來，一項(xiàng)針對(duì)亞洲人群LRP5基因A1330V多態(tài)性的研究顯示，A1330V位點(diǎn)與骨密度相關(guān)[15]。但也有研究發(fā)現(xiàn)LRP5基因A1330V位點(diǎn)多態(tài)性及突變與骨密度無相關(guān)性[16]。本研究結(jié)果顯示，T2DM伴OP組LRP5基因A1330V位點(diǎn)AA型、AV型、VV型HbAIC、腰L2-4BMD、股骨頸BMD差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明本地人群中LRP5基因A1330V位點(diǎn)多態(tài)性及突然對(duì)絕經(jīng)后女性T2DM和OP的發(fā)生有影響。

綜上所述，LRP5基因可能是絕經(jīng)后女性T2DM和OP的易感基因，A1330V位點(diǎn)多態(tài)性及突變可能對(duì)絕經(jīng)后女性T2DM和OP的發(fā)生有影響，Q89R位點(diǎn)多態(tài)性及突變與糖代謝、骨代謝無關(guān)。同時(shí)T2DM與OP兩種疾病均為多因素疾病，一種或兩種基因的調(diào)節(jié)作用有限，與之相關(guān)的候選基因還有很多，應(yīng)通過各項(xiàng)生物分子學(xué)的手段對(duì)候選基因的作用機(jī)制進(jìn)行分析，為T2DM與OP的防治提供指導(dǎo)。