尹恒 王建偉 張亞峰 馬勇 朱庭辰 陳浩 王高祥 笪巍偉 蘇秋菊

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)無錫附屬醫(yī)院，江蘇 無錫 214071 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210038 3.揚州市中醫(yī)院，江蘇 揚州 225009 4.南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫人民醫(yī)院，江蘇 無錫 214023

原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是多種原因引起的一種以骨組織含量減少、骨的微觀結(jié)構(gòu)退化為特征的，致使骨的脆性增加、強度降低而導(dǎo)致易于發(fā)生骨折的一種全身性骨骼疾病，屬于一種骨代謝性疾病[1]。OP具有高發(fā)病率、高致殘率、致死率的特征，已經(jīng)給世界各國老年人群的健康帶來了嚴重影響。早期診治OP非常重要。中醫(yī)藥治療OP療效確切，但缺乏分子機制方面的深入研究。代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分[2]，可直觀、全面地反映生物體內(nèi)的代謝物變化，其綜合、系統(tǒng)、動態(tài)等分析特性與中醫(yī)的整體、辨證、恒動等觀念具有微妙的一致性，能為OP的中醫(yī)診療提供新的思路和方法。本研究嘗試運用UPLC-MS技術(shù)，檢測肝腎陰虛證OP患者的血清代謝物，通過統(tǒng)計學(xué)方法篩查差異代謝物，期望將篩查所得差異代謝物與中醫(yī)證型相關(guān)聯(lián)，并將結(jié)果應(yīng)用于后續(xù)的診斷和治療研究中。

1 材料和方法

1.1 病例來源

篩選2019年4月至2020年8月在南京中醫(yī)藥大學(xué)無錫附屬醫(yī)院骨傷科、無錫市人民醫(yī)院針灸科門診就診的符合“肝腎陰虛證”的原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥患者[3]。納入女性骨質(zhì)疏松癥肝腎陰虛證患者30例作為肝腎陰虛組(I組)，非骨質(zhì)疏松女性30例作為對照組(CK組)。所有受試者均取得知情同意。

1.2 病例診斷標準

1.2.1西醫(yī)診斷標準[4]：滿足其中任何一項均可診斷，①髖部或椎體脆性骨折；②DXA測量的中軸骨骨密度或橈骨遠端1/3骨密度的T值 ≤-2.5；③骨密度測量符合低骨量(-2.5 < T值 <-1.0)+肱骨近端、骨盆或前臂遠端脆性骨折。

1.2.2中醫(yī)辨證分型標準[3]：中醫(yī)辨證分型標準來自《中醫(yī)藥防治原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥專家共識(2015)》[5]，選取肝腎陰虛證患者開展研究。主癥：腰膝酸痛，手足心熱。次癥：下肢抽筋，駝背彎腰，兩目干澀，形體消瘦，眩暈耳鳴，潮熱盜汗，失眠多夢，舌紅少苔，脈搏細數(shù)等。

1.3 納入標準

①符合原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥中西醫(yī)診斷標準者；②辨證為肝腎陰虛證者；③自愿接受試驗，并簽署知情同意書者；④臨床相關(guān)資料相對完整者；⑤絕經(jīng)后女性；⑥年齡55～85歲。

1.4 排除標準

①可能影響體內(nèi)骨代謝的內(nèi)分泌疾病、免疫性疾病、惡性腫瘤；長期服用糖皮質(zhì)激素或其他影響骨代謝的藥物者；②伴有嚴重心、腦、肝、腎等臟器疾病，控制不佳者，或常規(guī)化驗檢查主要指標嚴重異常者(超過上限1.5倍)；具有急慢性的炎癥性疾病或傳染性疾病者；③非第一次做相關(guān)研究者；④有酒精、藥物濫用史者。

1.5 倫理審批

本項目經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)無錫附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準同意實施(編號：SWJZH2019112101)。

1.6 研究方法

1.6.1實驗分組及樣本量：本研究納入女性骨質(zhì)疏松癥肝腎陰虛證患者30例作為肝腎陰虛組(I組)，非骨質(zhì)疏松女性30例作為對照組(CK組)。

1.6.2一般資料：記錄患者門診號、性別、一般生命體征、現(xiàn)病史、既往史等常規(guī)病歷資料。提取資料中患者中醫(yī)癥候、年齡、身高、體重、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)等資料用于后續(xù)統(tǒng)計分析。

血常規(guī)、肝功能、腎功能、電解質(zhì)檢測，用于評估患者基本健康情況。

采用雙能X線骨密度儀(DXA，美國LUNA公司)測定腰椎骨密度。

本研究代謝組學(xué)檢測部分由上海鹿明生物科技有限公司完成。

采集患者空腹靜脈血5 mL，靜置、離心后，-80 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.3主要儀器：使用高效液相色譜-質(zhì)譜(UPLC-MS)技術(shù)進行代謝組學(xué)檢測、分析。主要儀器包括：漩渦振蕩器TYXH-I、超聲波清洗機SB-5200DT、臺式高速冷凍離心機TGL-16 MS、高效液相色譜儀ACQUITY UPLC、高分辨質(zhì)譜儀QE、色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18等。

1.6.4樣本預(yù)處理：將-80 ℃下保存的樣本取出，解凍，移取100 μL血清，加入內(nèi)標各10 μL，震蕩10 s；加入300 μL的蛋白沉淀劑，渦旋震蕩1 min；超聲提取10 min；-20 ℃下靜置30 min；離心10 min ，取300 μL上清液揮干，然后用400 μL甲醇-水復(fù)溶，渦旋30 s，超聲2 min。離心10 min，吸取150 μL的上清液，過濾后，轉(zhuǎn)移到LC進樣小瓶，-80 ℃下保存，準備LC- MS分析。

色譜條件：色譜柱柱溫：40 ℃；流速為：0.35 mL/min；流動相：A-水(含0.1 %甲酸)，B-乙腈(含0.1 %甲酸)。每個樣本的進樣體積均為5 μL。每10個標本中插入一個QC樣本。

質(zhì)譜條件：利用質(zhì)譜儀采集色譜柱洗脫物。離子源：ESI；采用正負離子掃描模式。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

統(tǒng)計采用SPSS 22.0、R、SIMCA-P等統(tǒng)計軟件。采用獨立樣本t檢驗/F檢驗方法；以P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

代謝組學(xué)原始數(shù)據(jù)經(jīng)Progenesis QI v2.3軟件進行基線過濾、峰識別、積分、保留時間校正、峰對齊和歸一化，導(dǎo)入SIMCA-P11.5軟件進行主成分分析(PCA)、有監(jiān)督的偏最小二乘法分析(PLS-DA)及正交偏最小二乘法分析(OPLS-DA)，用于區(qū)分組間代謝物的總體差異；所得得分矢量圖(score plot) 用以獲得樣品分類信息，載荷矢量圖(loading plot)用于篩選差異性代謝分子。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

本研究共收集60例受試者血清資料，I組、CK組各30例，各組受試者年齡分布、BMI、BMD等基線資料情況。兩組受試者的BMD差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；年齡、BMI差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 納入患者的基線資料Table 1 Baseline data of included patients

2.2 血清代謝組學(xué)分析

2.2.1基峰圖：BPC(base peak chromatogram，基峰圖)是將每個時間點質(zhì)譜圖中最強的離子的強度連續(xù)描繪得到的圖譜。正負離子模式的BPC圖見圖1，圖2。

圖1 樣本I1基峰圖-陰離子模式Fig.1 Base peak diagram of sample I1-anion mode

圖2 樣本I1基峰圖-陽離子模式Fig.2 Base peak diagram of sample I1-cationic pattern

2.2.2多元統(tǒng)計分析：共鑒定出15 671個離子。采用PCA來觀察各樣本之間的總體分布以及整個分析過程的穩(wěn)定性，然后用PLS-DA、OPLS-DA及OPLS-DA模型的響應(yīng)排序檢驗、Loading-OPLS-DA來區(qū)分組間代謝輪廓的總體差異，分析組間的差異代謝物，建立數(shù)據(jù)矩陣。示意圖如圖3。

圖3 多元統(tǒng)計分析PCA、OPLS-DA示意圖Fig.3 Diagram of multivariate statistical analysis of PCA and OPLS-DA OPLS-DA(I-CK)

2.2.3單變量統(tǒng)計分析：下一步進行單變量統(tǒng)計分析，計算上述數(shù)據(jù)矩陣的P值和Fold change值。利用火山圖對所得數(shù)據(jù)進行可視化，如圖4所示，其中紅點為在I組中顯著上調(diào)的差異代謝產(chǎn)物，藍點為I組顯著下調(diào)的差異代謝產(chǎn)物，灰點為不顯著的差異代謝產(chǎn)物，P=0.05。

圖4 單變量統(tǒng)計火山圖Fig.4 Univariate statistical volcano map

2.2.4差異代謝物熱圖：采用多維分析和單維分析相結(jié)合的辦法，來篩選組間差異代謝產(chǎn)物。篩選標準為OPLS-DA模型第一主成分的VIP值>1，T檢驗的P值<0.05。I-CK差異代謝物418個。見圖5。

注：左 全部差異代謝物；右 Top50。圖5 I-CK組熱圖Fig.5 Heat map of I-CK group

2.2.5二次篩選：以上步驟篩選出的差異代謝物較多，且部分差異代謝物二級碎片評分為0，部分代謝產(chǎn)物無法歸類，物質(zhì)鑒定較為困難。為便于分析鑒定，我們采取更加嚴格的篩選標準，期望篩選出更有意義的差異代謝物。

篩選標準：①VIP > 1；②P<0.05；③log2(FC) > 1 或者 < -1；④Fragment score0。

2.2.6篩選出的差異性代謝物的鑒定：按照上述篩選標準，結(jié)合HMDB、Lipidmaps(v2.3)、METLIN數(shù)據(jù)庫提供的代謝物的具體定性信息，鑒定潛在的生物標志物。共篩選出15個肝腎陰虛證差異性代謝物(表2)。繪制成熱圖如圖6所示。

圖6 骨質(zhì)疏松癥陰虛證的潛在代謝標志物熱圖Fig.6 Heat map of potential metabolic markers of Yin deficiency syndrome in osteoporosis

表2 篩選出的15個骨質(zhì)疏松癥陰虛證差異性代謝物Table 2 Screening out 15 different metabolites of Yin deficiency syndrome in osteoporosis

2.2.7KEGG代謝通路富集分析：通過對上述差異代謝物進行KEGG信號通路富集分析，得到結(jié)果如圖7所示。

圖7 骨質(zhì)疏松癥陰虛證差異代謝物KEGG信號通路富集分析Fig.7 Enrichment analysis of KEGG signaling pathway of different metabolites in Yin deficiency syndrome of osteoporosis

2.3 差異代謝物與臨床資料的相關(guān)性分析

將篩選出來的15個差異代謝物與年齡、BMD、BMI資料進行線性相關(guān)分析，并繪制相關(guān)矩陣(圖8)。從該圖中可以看出：年齡與BMD、Tetrahydropentoxyline、N-(1-Deoxy-1-fructosyl)valine等多項代謝指標呈負相關(guān)(P<0.05)，BMD與15-O-Demethyl-10,29-dideoxy-11,12-dihydro-striatin C、LysoPE(18∶2(9Z,12Z)/0∶0)等代謝指標呈負相關(guān)(P<0.05)。BMI與各項代謝指標相關(guān)性較弱(P>0.05)。

圖8 骨質(zhì)疏松癥陰虛證差異代謝物與臨床資料相關(guān)性矩陣Fig.8 Correlation matrix between different metabolites and clinical data in Yin deficiency syndrome of osteoporosis

3 討論

原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥是一種最普遍的代謝性骨骼疾病，與中醫(yī)典籍中所描述“骨痿”“骨痹”等疾病范疇接近[6]。《素問·痿論》描述：“……腎氣熱，則腰脊不舉，骨枯而髓減，故足不任身，發(fā)為骨痿”；《素問·長刺節(jié)論》關(guān)于“骨痹”的描述：“……病在骨，骨重不可舉，骨髓酸痛，寒氣至，名曰骨痹?！敝嗅t(yī)認為，多個臟腑的功能失調(diào)都可能導(dǎo)致骨質(zhì)疏松，其病機主要是本虛標實，其中最典型的是腎、脾、肝的虛損以及瘀血阻絡(luò)。在治法上，中醫(yī)主張補腎、固本、填精、養(yǎng)血、助陽、益氣，強調(diào)標本同治，注重整體調(diào)節(jié)[7]?！吨嗅t(yī)藥防治原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥專家共識2015》[4]將原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥辨證分為腎陽虛證、肝腎陰虛證、脾腎陽虛證、腎虛血瘀證、脾胃虛弱證和血瘀氣滯證。其中肝腎陰虛證主癥為：腰膝酸痛，手足心熱。次癥為：下肢抽筋，駝背彎腰，兩目干澀，形體消瘦，眩暈耳鳴，潮熱盜汗，失眠多夢，舌紅少苔，脈搏細數(shù)等。笪巍偉等[8]的臨床流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，肝腎陰虛型骨質(zhì)疏松癥較為常見。因此我們選擇肝腎陰虛證型開展代謝組學(xué)研究。

長期以來，中醫(yī)藥的臨床研究存在如下問題[9]：①難以確立基于證型的客觀標準，使中醫(yī)證型無法被國際廣泛認可；②缺乏量化指標，導(dǎo)致中醫(yī)證型無法進行數(shù)據(jù)探索。這些問題在中醫(yī)藥研究領(lǐng)域廣泛存在，阻礙了中醫(yī)學(xué)研究的現(xiàn)代化、國際化，因此我們需要嘗試將傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論與現(xiàn)代科技相結(jié)合，在全新的領(lǐng)域開展研究，期望有更多有意義的發(fā)現(xiàn)。

中醫(yī)理論中，“證”是疾病發(fā)生過程中，對疾病所處階段、病因、病機的高度概括?！白C”既包括疾病的臨床表現(xiàn)，又涵蓋了疾病的病理機制。我們認為，“證”的表現(xiàn)應(yīng)該存在一定的物質(zhì)基礎(chǔ)。在骨質(zhì)疏松癥研究領(lǐng)域，前期中醫(yī)藥研究者已嘗試從基因組水平開展了中醫(yī)“證”的物質(zhì)基礎(chǔ)研究[10-11]，也進行了基于代謝組學(xué)的動物實驗[12]，但基于臨床證型資料的代謝組學(xué)研究尚未見報道。

代謝組學(xué)目前定義為定量測量生物系統(tǒng)全部代謝物組成以及代謝物在內(nèi)外刺激下動態(tài)改變的科學(xué)。代謝組學(xué)能夠通過代謝產(chǎn)物的變化，實時監(jiān)控內(nèi)外源性擾動帶來的機體代謝物質(zhì)及功能變化，目前已被廣泛應(yīng)用于各類代謝性疾病的研究之中[13-14]。代謝組學(xué)的突出特點為整體性、動態(tài)性、即時性，與中醫(yī)的“整體觀”、“恒動觀”不謀而合，因此將代謝組學(xué)引入中醫(yī)藥研究領(lǐng)域可能會有新的有意義的發(fā)現(xiàn)。

3.1 陰虛證原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的差異代謝物組成

在本研究中，我們選取了兩組受試者進行血清代謝組學(xué)檢測，通過差異性分析，篩選潛在的差異代謝物，用于后期診斷和治療評價。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩組受試者的15個內(nèi)源性代謝產(chǎn)物具有較為顯著的差異。根據(jù)差異性代謝物歸類表，可將本研究所得到的差異代謝物歸類為：氨基酸類：苯丙氨酸、甘氨膽酸、氨基吡唑基丙酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸，共計6個；生物堿類：茶堿，駱駝蓬總堿，2個；膽紅素類：膽紅素，(4E，15Z)-膽紅素，2個；磷脂類：溶血磷脂酰乙醇胺，1個；惡唑類：2-甲基-4-戊氯惡唑，1個；酚酯類：二苯氧苯胺，1個；低聚肽類：乳基谷胱甘肽，1個；二萜類：15-O DC，1個。可見氨基酸類代謝物在陰虛型骨質(zhì)疏松癥差異代謝物中具有較大占比。有意思的是，我們在另一項研究中發(fā)現(xiàn)，陽虛型骨質(zhì)疏松癥的差異代謝物大部分卻是脂類。

3.2 陰虛證原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥與氨基酸代謝

氨基酸是組成生物功能大分子蛋白質(zhì)發(fā)揮生物學(xué)功能的基本單位，主要參與蛋白質(zhì)的合成與代謝。氨基酸主要是以Embden-Meyerhof途徑與檸檬酸循環(huán)的中間物為碳鏈骨架進行生物合成，其分解代謝流程一般是先脫去氨基，形成碳骨架，隨后可以被氧化成CO2和H2O產(chǎn)生ATP，也可以為糖或者脂肪酸的合成提供碳架[11]。氨基酸參與一系列的生理學(xué)過程，如調(diào)節(jié)滲透壓、維持細胞膜穩(wěn)定、調(diào)節(jié)鈣流動、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、抗氧化等。在調(diào)節(jié)骨代謝方面的研究表明，氨基酸可以作為骨骼和鈣的直接調(diào)節(jié)劑[15]。

Bihuniak等[16]的研究表明多種氨基酸對腸道、成骨細胞、破骨細胞和GH/IGF-1軸有著直接或間接影響。在體內(nèi)，Lys、Arg能夠增強腸內(nèi)鈣的吸收，增加ALP、PICP、NO分泌，降低體外成骨細胞IL-6的生成，從而導(dǎo)致骨膠原合成和骨形成增加，骨吸收減少。在體外Lys可促進成骨細胞增殖，減少成骨細胞IL-6的分泌。Arg能夠降低IL-6的生成，刺激GH分泌，導(dǎo)致IGF-1循環(huán)水平的上升，促進的成骨細胞合成代謝。His和Phe能夠共同增加體內(nèi)循環(huán)IGF-1水平。在體外Phe、Tyr和Trp的不同組合能夠降低破骨細胞中Vitronectin受體的表達，從而降低破骨細胞前體的附著。氨基酸能夠誘導(dǎo)增加鈣吸收效率、成骨細胞增殖和骨礦化、I型膠原的合成和IGF-1循環(huán)水平，減少骨吸收、抑制破骨細胞附著和破骨細胞分化，能夠?qū)е鹿橇康膬粼黾?。Necat等[17]的研究表明，Hcy能夠通過影響絕經(jīng)后婦女破骨細胞的抗氧化能力，而改變骨礦密度。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)陰虛證原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥患者血清中，6種氨基酸含量發(fā)生了顯著變化。在基本飲食譜無明顯差異的情況下，我們推測這些氨基酸更可能來自體內(nèi)分解代謝的差異。一種可能是陰虛證異常的代謝狀態(tài)對能量的需求不同，使得氨基酸代謝發(fā)生了改變；另一種可能是在某種代謝通路的變化后，氨基酸代謝發(fā)生了改變，產(chǎn)生了差異性的血清氨基酸水平，影響機體各個系統(tǒng)最終表現(xiàn)出腰膝酸軟、潮熱盜汗、目澀昏花、舌紅少苔、脈搏細數(shù)等肝腎陰虛證的典型臨床表現(xiàn)。再回顧中醫(yī)治療陰虛證的幾個經(jīng)典方劑，如左歸丸[18-19]、大補陰丸[20]、一貫煎等，均含有龜板等血肉有情之品，也就是動物組織蛋白質(zhì)、氨基酸，是否從另一個角度驗證了補充氨基酸治療陰虛證的有效性，這些都值得深入研究。

4 總結(jié)

本研究利用臨床血清樣本篩查了肝腎陰虛證骨質(zhì)疏松癥的差異代謝物，作為潛在的骨質(zhì)疏松癥生物標志物，下一步可將這些差異代謝物與臨床癥狀、骨密度進行關(guān)聯(lián)性分析，建立基于血清代謝物的骨質(zhì)疏松癥模型并驗證，用于指導(dǎo)臨床診斷。也可以監(jiān)測用藥前后機體代謝分子的變化來研究藥物對骨質(zhì)疏松癥的代謝方面擾動作用機制。代謝組學(xué)在中醫(yī)藥治療骨質(zhì)疏松癥研究方面具有廣闊的發(fā)展前景，并能夠進行深入的機制探索，值得推廣開展。同時也應(yīng)該清楚地認識到，在中醫(yī)整體觀念指導(dǎo)下，單純利用代謝組學(xué)方法對“證”研究是不夠全面的，需要將多組學(xué)有機地結(jié)合起來，使中醫(yī)藥研究更加系統(tǒng)和規(guī)范[21]。