史正亮 張華 范志勇 宋永周 李身泰 李秋童 馬維

河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，河北 石家莊 050000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis, OP)是中老年群體常見的疾病。對(duì)于老年性骨質(zhì)疏松癥，主要是由于老年群體隨著年齡的增長(zhǎng)，骨骼中單位體積的骨量減少，質(zhì)量改變，使得骨密度下降[1-2]。脂肪源性干細(xì)胞(ADSCs)是一種間充質(zhì)干細(xì)胞，能夠從脂肪組織中分離得到。近代研究[3-4]發(fā)現(xiàn)，ADSCs與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的形態(tài)、作用均較為相近，且ADSCs的提取較為簡(jiǎn)單。因此，臨床研究人員欲將ADSCs作為治療疾病的細(xì)胞來源，用作分化成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等多種細(xì)胞，從而應(yīng)用于臨床治療。LncRNA可以調(diào)節(jié)染色體結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)，并在人類疾病的發(fā)展過程中占有關(guān)鍵地位，目前它們被定位為多種疾病的潛在生物標(biāo)志物[4]。分化拮抗非蛋白質(zhì)編碼RNA(ANCR)是一種與眾多疾病相關(guān)的lncRNA[5]。研究[6]發(fā)現(xiàn)，ANCR在多種疾病中異常表達(dá)，且發(fā)現(xiàn)ANCR在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中發(fā)揮著核心調(diào)節(jié)作用，但有關(guān)LncRNA ANCR對(duì)ADSCs向成骨分化的影響作用研究較少。Wnt信號(hào)通路在動(dòng)物間存在遺傳學(xué)上的高度保守性，不同的物種間很相似，但又不相同[7]，Wnt通路是Wnt基因調(diào)控的重要信號(hào)之一，Wnt基因在多種疾病及細(xì)胞中均有明顯表達(dá)，但Wnt信號(hào)通路在LncRNA ANCR調(diào)控ADSCs成骨分化的作用效果還未可知[8]。因此，本研究將對(duì)lncRNA ANCR調(diào)節(jié)骨質(zhì)疏松大鼠脂肪源性干細(xì)胞分化成骨細(xì)胞及對(duì)Wnt信號(hào)通路的作用機(jī)制展開探討。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取河北省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的雄性SD大鼠，常規(guī)飼養(yǎng)，每日給予大鼠70 mg/kg維甲酸灌胃處理，連續(xù)灌胃2周，采用X射線骨密度儀檢測(cè)大鼠前股骨骨密度，根據(jù)骨密度值以確定大鼠模型建立成功[9]，剔除造模失敗的大鼠。維甲酸購(gòu)自廣州阿達(dá)拉生物科技公司；蘇木精購(gòu)自寶雞市辰光生物公司；胎牛血清購(gòu)自上海傳秋；兔抗人BMP-2抗體購(gòu)自上海北諾。

1.2 方法

1.2.1脂肪源性干細(xì)胞原代培養(yǎng)：無菌條件下切取OP大鼠雙側(cè)腹股溝的脂肪墊，剪碎至糊狀，常規(guī)培養(yǎng)。接種在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，將原代干細(xì)胞在DMEM培育液中培養(yǎng)，保存于-80 ℃環(huán)境中。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組：將lncRNA ANCR siRNA 慢病毒載體及空載體慢病毒各30 pmol制備成復(fù)合物，按說明書操作與濃度為2×105/mL的細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h，更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h。共分為三組，siRNA組、空載體組和干細(xì)胞組。采用RT-PCR法檢測(cè)LncRNA ANCR是否轉(zhuǎn)染成功。

1.2.3RT-PCR法：把保存在- 80 ℃環(huán)境中脂肪源性干細(xì)胞取出，研磨細(xì)胞，提取總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。所有反應(yīng)嚴(yán)格按照反應(yīng)的條件進(jìn)行擴(kuò)增，內(nèi)參采用GAPDH，95 ℃預(yù)變性3 min ，95 ℃變性5 s，60 ℃退火1 min，共進(jìn)行40次。取得平均值后得到Ct值，計(jì)算方法用2-△△Ct法進(jìn)行分析。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.4堿性磷酸酶染色法：將細(xì)胞平鋪至6孔板中誘導(dǎo)培養(yǎng)至第7天，制備堿性磷酸酶染色液進(jìn)行染色。去除多余培養(yǎng)基，PBS液沖洗3次，每次1 min。加入1 mL堿性磷酸酶染色工作液，搖勻并確保充分覆蓋。常溫下避光孵育60 min。除去染色液，PBS液沖洗2次，最后置于顯微鏡下觀察成骨染色效果，并拍攝記錄。

1.2.5茜素紅染色實(shí)驗(yàn)：將細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)至第21天，制備茜素紅進(jìn)行染色。步驟與1.2.4相同，每孔加入2 mL 4 %多聚甲醛溶液，固定30 min。沖洗后加入2 mL茜素紅染液染5 min。除去染液，PBS沖洗3次，顯微鏡下觀察成骨染色效果，并拍攝記錄。

1.2.6免疫組化法：細(xì)胞常規(guī)脫蠟、水化，加阻斷過氧化物酶，PBS 漂洗。加一抗Wnt(1∶400)、β-catenin(1∶600)，孵育，漂洗，加二抗，重復(fù)以上步驟。甩干后滴加 DBA顯色劑、蘇木精，脫水、透明、封片，5 min內(nèi)測(cè)量OD值；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算陽(yáng)性的表達(dá)量。

1.2.7Western blot法：將脂肪源性干細(xì)胞進(jìn)行裂解并提取核蛋白，并對(duì)核蛋白的濃度進(jìn)行測(cè)量，分裝后，保存在- 20 ℃的環(huán)境中。將提取出的蛋白溶液和緩沖溶液按照4∶1的比例進(jìn)行混均，然后將蛋白溶液全部進(jìn)行煮沸處置，使其變性。蛋白加脫脂奶粉放PVDF膜上，加入1抗(Wnt，1∶400；β-catenin，1∶600；內(nèi)參為GAPDH)，TTBS漂洗3次，加2抗，封閉1 h。TTBS漂洗，DAB顯色，拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 原代培養(yǎng)細(xì)胞

原代培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞24 h即可見細(xì)胞貼壁，多數(shù)貼壁細(xì)胞呈小圓形，其中散在少量的梭形細(xì)胞或多角細(xì)胞。見圖1。

圖1 原代細(xì)胞觀察(三代，400×，20 μm)Fig.1 Observation of primary cells

2.2 RT-PCR法檢測(cè)LncRNA ANCR表達(dá)量

結(jié)果顯示，siRNA組、空載體組、干細(xì)胞組細(xì)胞LncRNA ANCR表達(dá)量分別為0.38±0.07、0.79±0.10、0.80±0.11，siRNA組細(xì)胞內(nèi)的LncRNA ANCR表達(dá)量最低。與空載體組、干細(xì)胞組相比較，siRNA組細(xì)胞LncRNA ANCR表達(dá)量顯著下降(P均<0.05)；空載體組、干細(xì)胞組相比較，兩組細(xì)胞中LncRNA ANCR表達(dá)量相近，無顯著差異(P>0.05)，說明LncRNA ANCR轉(zhuǎn)染成功。見圖2。

注：與siRNA組比較，aP<0.05。圖2 各組細(xì)胞中LncRNA ANCR表達(dá)量Fig.2 LncRNA ANCR expression in each group of cells

2.3 堿性磷酸酶染色觀察ALP 染色效果

由圖3可知，siRNA組細(xì)胞中ALP 染色最深，siRNA組與空載體組、干細(xì)胞組相比較，siRNA組細(xì)胞中ALP 染色顯著加深(P均<0.05)；空載體組、干細(xì)胞組相比較，兩組細(xì)胞中ALP 表達(dá)水平相近(P>0.05)。

圖3 各組細(xì)胞ALP 染色情況(400×，20 μm)Fig.3 ALP staining of cells in each group

2.4 茜素紅染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)成骨染色效果

siRNA組細(xì)胞中深紅色最重，siRNA組與空載體組、干細(xì)胞組相比較，siRNA組細(xì)胞中深紅色顯著加深(P均<0.05)；空載體組、干細(xì)胞組相比較，兩組細(xì)胞中顏色相近(P>0.05)。見圖4。

圖4 各組細(xì)胞骨染色效果(400×，20 μm)Fig.4 Bone staining effect of each group of cells

2.5 Western blot法檢測(cè)Wnt/β-catenin及其磷酸化蛋白水平

檢測(cè)結(jié)果顯示，siRNA組、空載體組、干細(xì)胞組細(xì)胞中Wnt蛋白水平分別為0.88±0.12、0.47±0.09、0.48±0.10，p-β-catenin蛋白水平分別為0.75±0.11、0.35±0.08、0.34±0.09，siRNA組細(xì)胞中Wnt/β-catenin及其磷酸化蛋白表達(dá)最高。與空載體組、干細(xì)胞組相比較，siRNA組細(xì)胞Wnt/β-catenin及其磷酸化蛋白表達(dá)顯著上升(P均<0.05)；空載體組、干細(xì)胞組相比較，細(xì)胞中蛋白水平相近(P>0.05)。見圖5。

注：A：各組細(xì)胞中Wnt/β-catenin蛋白水平；B：各組細(xì)胞中Wnt/β-catenin蛋白表達(dá)比值；C：各組細(xì)胞中phospho-β-catenin蛋白表達(dá)比值；與siRNA組比較，aP<0.05。圖5 各組細(xì)胞中Wnt/β-catenin蛋白水平Fig.5 Wnt/β-catenin protein levels in cells of each group

2.6 免疫組化法檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)陽(yáng)性表達(dá)

siRNA組細(xì)胞中Wnt/β-catenin陽(yáng)性數(shù)最高，與空載體組、干細(xì)胞組相比較，siRNA組細(xì)胞Wnt/β-catenin陽(yáng)性數(shù)顯著升高(P均<0.05)；空載體組、干細(xì)胞組相比較，兩組細(xì)胞中Wnt/β-catenin陽(yáng)性數(shù)相近，無顯著差異(P>0.05)。見圖6、圖7。

圖6 Wnt/β-catenin蛋白陽(yáng)性表達(dá)(400×)Fig.6 Positive expression of Wnt/β-catenin protein (400×)

注：與siRNA組比較，aP<0.05。圖7 Wnt/β-catenin蛋白陽(yáng)性數(shù)量Fig.7 Number of Wnt/β-catenin protein positive

3 討論

ADSCs在細(xì)胞的形態(tài)、表型及其多向分化潛能等方面與BMMSCs功能十分相似，但是ADSCs有其更為顯著的優(yōu)點(diǎn)，具體為取材相對(duì)方便、給患者帶來的創(chuàng)傷小、來源相對(duì)充足等，因此ADSCs成為了現(xiàn)在一個(gè)非常重要的研究熱點(diǎn)[10-11]。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，傳數(shù)代后衰老和死亡的細(xì)胞占有相對(duì)較小的比例。ADSCs可以被用來修復(fù)或者是重建很多種組織細(xì)胞，例如軟骨組織、肺、腦及肝臟[12]。分化拮抗非蛋白質(zhì)編碼RNA(ANCR)在人體多種疾病中異常表達(dá)，但在一些終末分化細(xì)胞中的表達(dá)水平卻顯著降低，例如角質(zhì)、成骨、脂肪等細(xì)胞。這一現(xiàn)象表明，lncRNA ANCR在終末分化細(xì)胞的分化、形成過程中占有重要地位[13]。研究顯示，lncRNA ANCR在BMSCs、hFOBl19等細(xì)胞中的表達(dá)升高也證明了lncRNA ANCR高表達(dá)對(duì)終末分化細(xì)胞具有拮抗作用，但在滑膜組織干細(xì)胞的生成過程中l(wèi)ncRNA ANCR卻產(chǎn)生促進(jìn)作用，說明lncRNA ANCR在干細(xì)胞的分化中發(fā)揮不同的調(diào)控作用[14-15]。但lncRNA ANCR在ADSC向成骨細(xì)胞分化中的作用還未見報(bào)道。因此，本研究采用ANCR干預(yù)骨質(zhì)疏松大鼠的脂肪源性干細(xì)胞向成骨分化，開展進(jìn)一步的探討。

已有研究報(bào)道，lncRNA ANCR在不同組織來源的干細(xì)胞分化過程中發(fā)揮重要的作用。lncRNA ANCR的敲減可以同時(shí)促進(jìn)DPSCs、aSCAPs、PDLSCs等細(xì)胞的定向分化[16]。Xie等[17]發(fā)現(xiàn)，lncRNA ANCR在人hBMSC成骨分化過程中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，siRNA組與空載體組、干細(xì)胞組相比較，siRNA組細(xì)胞中ALP 染色顯著加深、深紅色顯著加深；空載體組、干細(xì)胞組相比較，ALP 表達(dá)水平無顯著差異。表明lncRNA ANCR的表達(dá)水平能夠?qū)DSCs的分化起明顯干預(yù)作用，lncRNA ANCR表達(dá)升高會(huì)顯著抑制ADSCs向成骨分化的速度，其具體作用原理可能與細(xì)胞中Wnt/β-catenin的水平有關(guān)。研究顯示[18]，在lncRNA ANCR參與ADSCs成骨分化過程中，lncRNA ANCR可根據(jù)其細(xì)胞核內(nèi)外不同的定位發(fā)揮不同的功能，主要包括海綿作用(lncRNA ANCR作用于miRNA后，減弱miRNA對(duì)靶基因mRNA表達(dá)的抑制作用)、靶向銜接作用(lncRNA ANCR可使相關(guān)轉(zhuǎn)錄信號(hào)因子的表達(dá)減少)，進(jìn)而發(fā)揮不同或者相反的生物學(xué)作用。張傳志等[19]指出lncRNA ANCR過表達(dá)能夠抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。前期臨床研究表明[20]，ADSCs可以逐步分化為成骨細(xì)胞，預(yù)防卵巢切除誘導(dǎo)的骨流失與骨質(zhì)疏松疾病。ADSCs成骨分化條件及外在影響方面主要影響了成骨細(xì)胞活性和骨形成，并且還與骨吸收有關(guān)。lncRNA ANCR空載體內(nèi)不含有siRNA，當(dāng)空載體轉(zhuǎn)染至其他細(xì)胞中時(shí)，siRNA不進(jìn)行復(fù)制繁殖，因此，lncRNA ANCR空載體對(duì)細(xì)胞分裂及分化無任何影響。研究表明[21]，脂肪源干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的過程共分為三個(gè)階段，其中，基質(zhì)成熟期和礦化形成期是較為重要的階段。在基質(zhì)成熟期細(xì)胞中能夠提升BMP2和ALP的表達(dá)，對(duì)ALP進(jìn)行染色檢測(cè)后表明，ALP表達(dá)水平與成骨細(xì)胞分化的速率存在正相關(guān)關(guān)系，即ALP表達(dá)水平越高，成骨細(xì)胞分化率越高。在成骨誘導(dǎo)過程中，敲減lncRNA ANCR后，ADSCs成骨分化會(huì)發(fā)生明顯的鈣化，其中鈣結(jié)節(jié)的沉積顯著增加，間接促進(jìn)成骨細(xì)胞的生成[22]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與空載體組、干細(xì)胞組相比較，siRNA組細(xì)胞Wnt/β-catenin陽(yáng)性數(shù)及其蛋白表達(dá)顯著升高，空載體組、干細(xì)胞組相比較無顯著差異，說明抑制lncRNA ANCR的表達(dá)可提高Wnt/β-catenin的活性。Wnt信號(hào)最早發(fā)現(xiàn)于乳腺癌小鼠細(xì)胞內(nèi)，是一種起始糖蛋白。作為一條高度保守的信號(hào)通路，其異常激活能夠調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生物活性，對(duì)成骨細(xì)胞的分化有正向促進(jìn)作用。Wnt信號(hào)作用的發(fā)揮主要通過其下游的調(diào)節(jié)蛋白β-catenin累積游離至細(xì)胞核中，與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，對(duì)核內(nèi)mRNA表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)、啟動(dòng)實(shí)現(xiàn)。研究表明[23]，lncRNA影響干細(xì)胞分化的作用方式有很多，可以通過轉(zhuǎn)錄因子激活或抑制靶基因的表達(dá)，例如：lncRNA-MEG3可以通過與Wnt/β-catenin的相互作用來促進(jìn)BMP-2的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)脂肪源性干細(xì)胞的成骨分化。Li等[24]的研究顯示，ADSCs成骨分化后，其細(xì)胞中Wnt/β-catenin的水平出現(xiàn)顯著變化，表明Wnt/β-catenin信號(hào)在ADSCs成骨分化過程中占有關(guān)鍵地位。王維等[25]的試驗(yàn)結(jié)果表明，lncRNA ANCR可以調(diào)控經(jīng)典的Wnt/β-catenin通路，從而調(diào)節(jié)與成骨分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，最終影響脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化[22]。

綜上所述，lncRNA ANCR的表達(dá)水平與骨質(zhì)疏松大鼠體內(nèi)脂肪源性干細(xì)胞的分化存在顯著相關(guān)性，lncRNA ANCR能夠促進(jìn)脂肪源性干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，lncRNA ANCR作用于脂肪源性干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化可能與調(diào)控Wnt/β-catenin的表達(dá)有關(guān)。