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        雷公藤多苷對類風濕關(guān)節(jié)炎大鼠Ras/Raf1原癌基因表達的影響

        2021-09-28 00:19:11劉玉欣孫志娟代榮琴陳正立梁闖范洪
        世界中醫(yī)藥 2021年17期
        關(guān)鍵詞:類風濕關(guān)節(jié)炎

        劉玉欣 孫志娟 代榮琴 陳正立 梁闖 范洪

        摘要 目的:探究雷公藤多苷對類風濕關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)血清及組織Ras/Raf1表達的影響。方法:將60只SD大鼠隨機分為對照組、模型組和干預組,每組20只。模型組與干預組建立大鼠風濕關(guān)節(jié)炎模型,干預組用雷公藤多苷干預,對照組和模型組給予等量生理鹽水。以足趾腫脹度為模型標準和療效判定指標,實驗終點通過酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA)檢測大鼠血清Ras、Raf1以及炎癥介質(zhì)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)水平,實驗終點通過Western Blotting檢測大鼠滑膜組織Ras和Raf1蛋白表達量并對大鼠踝關(guān)節(jié)進行HE染色分析。結(jié)果:ELISA結(jié)果表明,與對照組比較,模型組血清Ras、Raf1、TNF-α、IL-6顯著升高(均P<0.01),與模型組比較,干預組血清Ras、Raf1、TNF-α、IL-6顯著降低(均P<0.01);Western Blotting結(jié)果表明:與對照組大鼠比較,模型組大鼠滑膜組織Ras、Raf1顯著升高(均P<0.01),與模型組比較,干預組大鼠滑膜組織Ras、Raf1顯著降低(均P<0.05)。HE染色表明:與對照組比較,模型組病理總評分升高(P<0.01),與模型組比較,干預組病理總評分下降(P<0.05)。結(jié)論:雷公藤多苷可抑制大鼠血清炎癥介質(zhì)釋放并降低外周血和關(guān)節(jié)組織中Ras、Raf1蛋白的表達,起到骨保護作用。

        關(guān)鍵詞 雷公藤多苷;類風濕關(guān)節(jié)炎;大鼠;滑膜組織;炎癥;病理

        Effects of Tripterygium Glycosides on Ras/Raf1 Expression in Rats with Rheumatoid Arthritis

        LIU Yuxin1,SUN Zhijuan1,DAI Rongqin3,CHEN Zhengli2,LIANG Chuang1,F(xiàn)AN Hong1

        (1 Department of Laboratory,Cangzhou Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine,Cangzhou 061000,China; 2 Department of Laboratory,the First Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang,Hebei 050023,China; 3 Cangzhou Medical College,Cangzhou 061001,China)

        Abstract Objective:To explore the effects of tripterygium glycosides on the expression of Ras/Raf1 in joint serum and tissues of rats with rheumatoid arthritis.Methods:A total of 60 SD rats were randomly divided into a control group(n=20),a model group(n=20) and an intervention group(n=20).Rat rheumatoid arthritis model was established in model group and intervention group.The intervention group was intervened with tripterygium glycosides,and the control group and model group were given the same amount of normal saline.Take toe swelling as model standard and curative effect judgment index,at the end of the experiment,the rat serum levels of Ras,Raf1,TNF-α and IL-6 were detected by ELISA.At the end of the experiment,the protein expression of Ras and Raf1 in rat synovial tissue was detected by Western Blotting,and the rat ankle joint was analyzed by HE staining.Results:The results of ELISA showed that,compared with the control group,the levels of serum Ras,Raf1,TNF-α and IL-6 in the model group were increased significantly(P<0.01).Compared with the model group,the levels of serum Ras,Raf1,TNF-α and IL-6 in the intervention group were significantly decreased(P<0.01).The results of Western Blotting showed that,compared with the control group,Ras and Raf1 in rat synovial tissue in the model group were significantly increased(P<0.01),and compared with the model group,Ras and Raf1 in rat synovial tissue in the intervention group were significantly decreased(P<0.01).He staining showed that,compared with the control group,the total score of pathology in the model group increased(P<0.01),and compared with the model group,the total score of pathology in the intervention group decreased(P<0.05).Conclusion:Tripterygium glycosides can inhibit the release of serum inflammatory factors in rats and reduce the expression of Ras and Raf1 protein in peripheral blood and joint tissue of rats,which plays a role in bone protection.

        Keywords Tripterygium glycosides; Rheumatoid arthritis; Rats; Synovial tissue; Inflammation; Pathology

        中圖分類號:R285.5文獻標識碼:Adoi:10.3969/j.issn.1673-7202.2021.17.011

        風濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是急性或慢性結(jié)締組織炎癥,在臨床上較為常見。臨床以滑膜組織過度增生、關(guān)節(jié)和肌肉游走性酸痛、紅腫、疼痛為主要特征[1]。膜受體酪氨酸蛋白激酶信號傳遞途徑Ras/Raf/MEK/ERK可以將細胞外信號轉(zhuǎn)導至細胞內(nèi),調(diào)控細胞的增殖與分化、凋亡與炎癥反應(yīng)等重要生物學功能[2]。雷公藤多苷具有抗炎及抑制細胞免疫和體液免疫等作用,臨床多用于風濕熱瘀,毒邪阻滯所致的類風濕性關(guān)節(jié)炎[3]。本研究通過建立大鼠類風濕性關(guān)節(jié)炎模型,探究雷公藤多苷對類風濕性關(guān)節(jié)炎大鼠Ras/Raf1表達的影響。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 動物

        8周齡雄性SPF級SD大鼠60只,體質(zhì)量180~200 g,購于斯貝福生物技術(shù)有限公司,許可證號(SCXK 2019-0010)。飼養(yǎng)環(huán)境溫度20~25 ℃,濕度55%,自由飲食、飲水。實驗過程符合我院動物倫理相關(guān)標準。

        1.1.2 藥物

        雷公藤多苷(純度99%;江蘇美通制藥有限公司,批號:140906)。

        1.1.3 試劑與儀器

        蘇木精-伊紅(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,貨號:wb1005),IL-6 ELISA Kit(批號:RAB0311)、Ras ELISA試劑盒(批號:ml931446-2)及Raf1 ELISA試劑盒(批號:ml937044-2)均購于酶聯(lián)生物科技有限公司,Rat TNF-α ELISA Kit(Sigma公司,美國,批號:RAB0479),Anti-Ras抗體(批號:ab52939)、Anti-Raf1抗體(批號:ab181115)、Anti-GAPDH抗體(批號:ab8245)及山羊抗兔二抗(批號:ab150077)購于英國Abcam公司。

        MINI-PROTEANTETRA電泳儀器(美國Bio-Rad,型號:1658001),全自動組織包埋機(中國雅博,型號:YAB0400),漂烘片機(中國雅博,型號:YABO200),倒置生物顯微鏡(北京美華儀科技有限公司,型號:MHY-28651),臺式高速冷凍離心機(德國貝克曼,型號:Allegra X-22R)。

        1.2 方法

        1.2.1 分組與模型制備

        將60只SD大鼠隨機分為對照組(n=20)、模型組(n=20)和干預組(n=20)。以0.1 mol/L的乙酸配制為2 g/L的Ⅱ型膠原,全弗佐劑(CFA)與Ⅱ型膠原乙酸溶液等比例混勻,配制1 g/L的Ⅱ型膠原乳化液。取0.6 mL乳化液注射于模型組和干預組大鼠足底部。7 d后,以相同的方法注射乳化液0.3 mL[4]。正常對照組注射等量的生理鹽水,以大鼠足趾腫脹度為造模成功標準。

        1.2.2 給藥方法

        造模后干預組給予雷公藤多苷9 mg/kg,灌胃,模型組、對照組等體積生理鹽水灌胃,連續(xù)3周。

        1.2.3 檢測指標與方法

        1.2.3.1 大鼠足腫脹度標準

        用游標卡尺測量大鼠右側(cè)后足厚度,腫脹度標準為:足跖厚度(注射后-注射前)/注射前足跖厚度[4]。

        1.2.3.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測外周血炎癥介質(zhì)及Ras、Raf1

        實驗終點大鼠眼眶采血1 mL,采血后立刻分離血清,并按照Ras、Raf1、TNF-α、IL-6 ELISA Kits說明嚴格操作,酶聯(lián)檢測儀測定吸光度值[5]。

        1.2.3.3 Western Blotting實驗檢測滑膜組織Ras/Raf1蛋白表達

        采血后切開膝關(guān)節(jié),縱向分離周圍軟組織,同時完整剝離髕骨下緣滑膜組織,PBS清洗兩遍,勻漿后冰上裂解細胞提取總蛋白,蛋白提取后進行SDS-PAGE電泳70 V 10 min,110 V 2 h,轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉2 h,TBST漂洗4次,每次5 min,加入一抗,4 ℃孵育過夜,二抗常溫孵育2 h,TBST漂洗4次,5 min/次,ECL顯色,發(fā)光儀曝光、拍照[6],以GAPDH為內(nèi)參,Image J軟件分析Ras、Raf1蛋白相對表達水平。

        1.2.3.4 大鼠關(guān)節(jié)取材及HE染色觀察病理變化

        分離大鼠后肢踝關(guān)節(jié),去除皮毛,去除肌腱組織,在10%的PFA中浸泡固定,10%EDTA脫鈣液,重新于10%的多聚甲醛中固定,石蠟包埋、切片,用于HE染色。病理學評分標準:關(guān)節(jié)周圍炎癥評分:無炎癥細胞浸潤評為0分,有0~20個炎癥細胞浸潤評為1分,有20~50個炎癥細胞浸潤評為2分,多于50個炎癥細胞浸潤評為3分;骨破壞評分:正常評為0分,有少量軟骨丟失評為1分,骨破壞存在于獨立的區(qū)域評為2分,骨關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)完全破壞評為3分;病理總評分標準為:關(guān)節(jié)周圍炎癥評分+骨破壞評分[7]。

        1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,實驗獨立重復3次,2組間比較用t檢驗,多組比較用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結(jié)果

        2.1 造模后大鼠足趾腫脹度檢測

        造模后正常組大鼠精神情況好,毛發(fā)光亮。雷公藤多苷組和模型組大鼠出現(xiàn)毛發(fā)不光澤,關(guān)節(jié)出現(xiàn)不同程度紅腫,同時伴有不同程度關(guān)節(jié)變形,足厚度顯著高于正常對照組(P<0.05),提示造模成功。見表1。

        2.2 各組大鼠血清Ras、Raf1、TNF-α、IL-6表達比較

        干預組和模型組與對照組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01,P<0.001),而干預組大鼠的Ras、Raf1及炎癥介質(zhì)水平均顯著低于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01,P<0.001)。見表2。

        2.3 雷公藤多苷對大鼠滑膜組織Ras、Raf1表達的影響

        干預組和模型組Ras、Raf1均高于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01),而干預組大鼠的Ras、Raf1水平均顯著低于模型組,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見圖1。

        2.4 雷公藤多苷對大鼠踝關(guān)節(jié)的影響

        HE染色發(fā)現(xiàn),對照組大鼠踝關(guān)節(jié)沒有明顯炎癥細胞浸潤,關(guān)節(jié)周圍無明顯的炎癥細胞浸潤和骨破壞發(fā)生。模型組大鼠關(guān)節(jié)內(nèi)出現(xiàn)大量炎癥細胞浸潤,關(guān)節(jié)面出現(xiàn)不同程度的骨破壞。同時與空白組比較,模型組病理學評分顯著升高(P<0.001)。干預組可見少量炎癥細胞浸潤,滑膜增生,出現(xiàn)少量骨質(zhì)的破壞,與空白組比較病理學評分下降(P<0.001)。干預組與模型組間病理學評分比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2,表3。

        3 討論

        類風濕性關(guān)節(jié)炎是炎癥性的自身免疫疾病,在臨床上的表現(xiàn)為滑膜組織過度增生及外周關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)增加,出現(xiàn)骨組織的進行性破壞,并伴有關(guān)節(jié)腫痛、畸形,患者部分喪失勞動力,甚至危及生命[8-10]。研究表明,類風濕關(guān)節(jié)炎在青年及老年人群中發(fā)病率較高,并伴有不同的并發(fā)癥和不同的臨床表現(xiàn)[11-13]。雷公藤多苷是一種從雷公藤中提取的物質(zhì),具有很好的通絡(luò)活血、消腫止痛以及解毒祛濕的功效,并且現(xiàn)代藥理學認為該藥物可以對患者的免疫功能進行調(diào)節(jié),有抗菌和抗炎的功效,也在腫瘤的治療中發(fā)揮作用,可以有效地降低患者體內(nèi)的IL-17、IL-22和TNF-α,提高治療效果[14-15]。雷公藤多苷可通過抑制炎癥細胞和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生,從而緩解類風濕性關(guān)節(jié)炎病情[16]。

        Ras可通過激活Raf1維持細胞增殖、成活和遷移,從而導致滑膜組織病理性增厚,血管翳形成,研究表明Ras還在腫瘤細胞的遷移中發(fā)揮重要作用[17]。類風濕關(guān)節(jié)炎過程中伴隨著TNF-α水平的升高,IL-1β、IL-17等大量炎癥介質(zhì)的升高[18-19],IL-6在肥胖、關(guān)節(jié)炎、慢性阻塞性肺疾病合并骨質(zhì)疏松等多種疾病中發(fā)揮重要作用[20-24]。本研究證實雷公藤多苷可以降低類風濕性關(guān)節(jié)炎大鼠外周血炎癥介質(zhì)的表達水平,同時可以抑制Ras/Raf1信號通路,緩解類風濕關(guān)節(jié)炎引起的炎性病變。同時表明雷公藤多苷可以顯著抑制類風濕性關(guān)節(jié)炎大鼠炎癥介質(zhì)的釋放,降低炎癥部位局部的炎癥反應(yīng),從而起到關(guān)節(jié)保護的作用。本研究通過建立大鼠類風濕性關(guān)節(jié)炎模型,并給予雷公藤多苷進行干預,結(jié)果證實雷公藤多苷可以緩解大鼠足腫脹,降低總病理評分,提示雷公藤多苷具有緩解類風濕性關(guān)節(jié)炎臨床癥狀的作用[25]。

        綜上所述,雷公藤多苷可能通過下調(diào)外周血Ras、Raf1表達水平及滑膜組織中Ras、Raf1蛋白的表,降低外周血炎癥介質(zhì)釋放,起到減少滑膜病變及骨保護的作用。本研究為關(guān)節(jié)炎性相關(guān)疾病的研究提供了理論依據(jù)。

        參考文獻

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        (2021-07-06收稿 責任編輯:楊覺雄)

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