王晶晶， 蔣曉飛， 馬逸珉， 王 蓓

（復旦大學附屬華山醫(yī)院檢驗醫(yī)學科，上海 200040）

非結核分枝桿菌（non-tuberculosis Mycobacterium，NTM）是分枝桿菌屬（Mycobacterium）內(nèi)除結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）復合群和麻風分枝桿菌（Mycobacterium leprosy）以外的其他分枝桿菌，大部分為腐物寄生菌，僅少部分可使人體致病[1]。休斯頓分枝桿菌（Mycobacterium houstonense）是屬于偶發(fā)分枝桿菌（Mycobacterium fortuitum）的第3種生物變異復合體，是根據(jù)其表型和基因型數(shù)據(jù)定義的分枝桿菌基因型2分類的一個新的物種，與偶發(fā)分枝桿菌不存在抗藥性差異[2]。45%的偶發(fā)分枝桿菌臨床分離株第3種生物變異復合體和8種參考菌株分離自傷口，可引起皮膚及皮下軟組織病變[3]，其他菌株主要分離自呼吸道或血液樣本[2]。本文對1例休斯頓分枝桿菌感染病例進行報道。

1 病例資料

患者，男，46歲，30年前無明顯誘因突然出現(xiàn)雙眼視物發(fā)紅，當?shù)蒯t(yī)院診斷為雙眼玻璃體出血，具體治療不詳，左眼視力一直較差。10年前，患者突發(fā)左眼疼痛，于當?shù)蒯t(yī)院行左眼青光眼手術。2016年9月因眼壓控制不佳在復旦大學附屬華山醫(yī)院就診，行左眼閥門植入。2個月前左眼紅痛、閥門管自行掉落，在其他診所給予“克林霉素，1.2 g靜滴”，左眼脹痛無明顯好轉。復旦大學附屬華山醫(yī)院門診檢查示：右眼視力1.0，左眼視力無光感；右眼眼壓2.26 kpa（17.0 mmHg），左眼眼壓無法測出；左眼角膜水腫，前房積膿，左眼角膜后沉淀物（+++），丁達爾現(xiàn)象（+++），瞳孔圓，眼內(nèi)結構不見。B超檢查示“左眼玻璃體混濁，炎癥？視神經(jīng)萎縮？左眼軸長23.95 mm”。為進一步診治，擬“左眼眼內(nèi)炎”收入院。2020年4月9日入院血常規(guī)檢查示：白細胞計數(shù)16.77×109/L。B超結果示“雙眼玻璃體混濁，左眼炎癥？視神經(jīng)萎縮？左眼眼軸長約23.95 mm”（圖1）。2020年4月10日行左眼眼內(nèi)容物剜除術，術中取玻璃體液培養(yǎng)，結果示：休斯頓分枝桿菌陽性，體外藥物敏感性試驗提示阿米卡星和左氧氟沙星敏感，予0.9%氯化鈉溶液100 mL+頭孢美唑2.0 g ivgtt q 12 h，5%葡萄糖氯化鈉注射液250 mL+阿米卡星0.6 g ivgtt qd，聯(lián)合左氧氟沙星0.5 g qd。出院囑左氧氟沙星（可樂必妥）0.5 g qd口服。隨訪40 d，眼部無不良異常表現(xiàn)。

圖1 影像學（B超）檢查結果

2 細菌培養(yǎng)鑒定與體外藥物敏感性分析

2.1 細菌培養(yǎng)

沿角膜緣無菌切開角膜，可見大量白色膿性物質(zhì)溢出，抽取膿性物質(zhì)分別注入需氧和分枝桿菌血培養(yǎng)瓶中送檢，1 d后需氧瓶和分枝桿菌培養(yǎng)瓶同時報陽。培養(yǎng)曲線顯示：分枝桿菌培養(yǎng)瓶[圖2（a）]、需氧培養(yǎng)瓶[圖2（b）]呈典型陽性生長曲線。取適量培養(yǎng)物分別轉種哥倫比亞血瓊脂平板、巧克力平板和中國藍平板（上?？片敿挝⑸锛夹g有限公司），置于5% CO2培養(yǎng)箱35 ℃培養(yǎng)，涂片2張，分別進行革蘭染色和抗酸染色（珠海貝索公司）。革蘭染色未見細菌，涂片抗酸染色見少量抗酸染色陽性菌。培養(yǎng)1 d后，血瓊脂平板[圖2（c）]和巧克力平板均有灰白色的細小菌落[圖2（d）]生長。第5天可見單個稍大菌落，血平板上呈黃白色大小不一凸起菌落，較干燥[圖2（e）]。同時將術中脫落組織行一般細菌培養(yǎng)，接種于哥倫比亞血瓊脂平板，培養(yǎng)1 d，無細菌生長，第2天見灰白色的菌落[圖2（f）]，第5天見黃白色干燥菌落[圖2（g）]。挑取哥倫比亞血瓊脂平板上菌落行抗酸染色，可見抗酸染色陽性菌[圖2（h）]。

圖2 眼膿性物質(zhì)血培養(yǎng)和一般細菌培養(yǎng)結果

2.2 質(zhì)譜鑒定結果

用竹簽挑取血平板上純菌落，均勻涂到靶板上，滴加1 μL 70%甲酸，室溫環(huán)境放置，干燥后，再滴加1 μL基質(zhì)液。室溫干燥后，用激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀（德國Bruker公司）進行分析。鑒定結果為鼻疽分枝桿菌，MALDI得分為2.054分（2.000為鑒定到種的閾值），見圖3。

2.3 測序結果

先采用聚合酶鏈反應擴增菌株的16S rRNA，引物為5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'和5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，預期產(chǎn)物長1 500 bp。產(chǎn)物采用正-反向測序，獲得1 384 bp準確的片段序列。序列做NCBI blast，結果為：Mycobacterium farcinogenes（鼻疽分枝桿菌，一致性99.86%）、Mycobacterium houstonense（休斯頓分枝桿菌，一致性99.86%）、Mycobacterium fortuitum（偶發(fā)分枝桿菌，一致性99.86%）等。由于16S rRNA區(qū)分不同種類分枝桿菌的效率不高，我們又采用聚合酶鏈反應擴增16S-23SrRNA間區(qū)，引物為5'-TTGTACACACCGCCCGTCA-3'和5'-TCTCGATGCCAAGGCATCCACC-3'，預期產(chǎn)物長554 bp，擴增產(chǎn)物采用先克隆然后測序的方法，獲554 bp片段準確序列。序列做NCBI blast，結果為：Mycobacterium houstonense（休斯頓分枝桿菌，一致性98.7%）最高，其次為Mycobacterium dioxanotrophicus（二氧化桿菌分枝桿菌，一致性87.79%），Mycobacterium fortuitum（偶發(fā)分枝桿菌，一致性88.09%）、Mycobacterium farcinogenes（鼻疽分枝桿菌，一致性88.60%）。結合16S rRNA和16S-23S rRNA結果，確定為Mycobacterium houstonense（休斯頓分枝桿菌）。

2.4 體外藥物敏感性試驗

參照文獻[5]推薦的可能敏感的抗菌藥物進行體外藥物敏感性試驗。用M-H血瓊脂平板（上?？片敿挝⑸锛夹g有限公司）進行紙片擴散法檢測，35 ℃培養(yǎng)2 d后，各藥物抑菌圈直徑結果分別為：阿米卡星34 mm、慶大霉素20 mm、利奈唑胺6 mm、復方磺胺甲噁唑6 mm、左氧氟沙星35 mm、亞胺培南29 mm、美羅培南19 mm、米諾環(huán)素10 mm、克林霉素6 mm、頭孢唑啉6 mm、頭孢呋辛6 mm、頭孢噻肟6 mm。參照美國臨床實驗室標準化協(xié)會M24-A文件[6]，采用快分枝桿菌微量肉湯藥物敏感性試驗程序及折點判讀結果，肉湯為7H9肉湯[艾禮生物科技（上海）有限公司]。將接種好的板條置于鋪有濕毛巾的白磁盆內(nèi)，35 ℃培養(yǎng)，隔天觀察，保持濕度，培養(yǎng)第4天觀察到菌落顯著生長，讀取結果為：阿米卡星（2 μg/mL，敏感）、頭孢西?。?4 μg/mL，中介）、環(huán)丙沙星（0.25 μg/mL，敏感）、多西環(huán)素（≥32 μg/mL，耐藥）、復方磺胺甲噁唑（≥22 μg/mL/608 μg/mL，耐藥）、妥布霉素（≥32 μg/mL，耐藥）和左氧氟沙星（0.25 μg/mL，敏感）。

3 討論

本例患者于10年前行“左眼小梁切除術”，2016年9月行閥門管植入術，2個月前左眼內(nèi)閥門管自行從眼內(nèi)脫落，入院檢查示白細胞計數(shù)為16.77×109/L ，存在感染可能，4月10日左眼眼內(nèi)容物剜除術中玻璃體液樣本培養(yǎng)出細菌，抗酸染色陽性，菌落形態(tài)似NTM，質(zhì)譜鑒定結果示：前6位為鼻疽分枝桿菌，后2位為豬分枝桿菌。

進一步對該細菌行分子鑒定得到不同的結果：休斯頓分枝桿菌?；仡欃|(zhì)譜鑒定結果，查找MALDI Biotyper3庫，該細菌庫中沒有休斯頓分枝桿菌。豬分枝桿菌與休斯頓分枝桿菌同為偶發(fā)分枝桿菌的第3種生物變異復合體[3]，參照此質(zhì)譜鑒定結果，發(fā)現(xiàn)應用激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜對偶發(fā)分枝桿菌的第3種生物變異復合體這一類細菌的鑒定存在一定的局限性，質(zhì)譜鑒定是對不同的蛋白峰進行分析，然后與庫中已有的已知蛋白峰做比對而得出的重合性的結果，在區(qū)分蛋白峰過于相似的細菌時精確性可能欠佳。測序作為鑒定的標準，采用16S-23S區(qū)間序列對該菌株進行分辨，一致性遠高于其他方法。所以對于此類分枝桿菌的鑒定，建議采用核酸測序的方法。

該病例為我國極少見的休斯頓分枝桿菌引起的眼部感染，最終經(jīng)手術摘除病變的眼球，清潔感染部位，后續(xù)沒有更大范圍的感染。類似病例的早期診斷對患者的治療極其重要，懷疑感染可能的時候，可以考慮在普通培養(yǎng)鑒定的基礎上增加抗酸染色涂片和分枝桿菌培養(yǎng)等項目。實驗室在處理類似臨床樣本時，應盡可能地延長培養(yǎng)時間；在革蘭染色分辨細菌有疑問的情況下，可以考慮做抗酸染色，爭取更早、更準確地給予臨床結果。