張 輝， 張 馳， 岳道遠

（華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院檢驗科，湖北 武漢 430030）

為分析臨床常見癥狀——貧血的原因，XN-20全自動血液分析儀（簡稱XN-20）增加了網(wǎng)織紅細胞（reticulocyte，RET）和紅細胞（red blood cell，RBC）新參數(shù)，包括網(wǎng)織紅細胞百分比（the percentage of reticulocyte，RET%）、網(wǎng)織紅細胞絕對值（the absolute value of reticulocyte，RET#）、低熒光網(wǎng)織紅細胞百分比（the percentage of low fluorescent reticulocyte，LFR%）、中熒光網(wǎng)織紅細胞百分比（the percentage of medium fluorescent reticulocyte，MFR%）、高熒光網(wǎng)織紅細胞百分比（the percentage of high fluorescent reticulocyte，HFR%）、未成熟網(wǎng)織紅細胞百分比（the percentage of immature reticulocyte，IRF%）、網(wǎng)織紅細胞血紅蛋白含量（reticulocyte hemoglobin，RET-HE）和小紅細胞百分比（the percentage of microcyte，Micro-R%）、大紅細胞百分比（the percentage of macrocyte，Macro-R%）、低色素紅細胞百分比（the percentage of hypochromic erythrocyte，Hypo-HE%）和高色素紅細胞百分比（the percentage of hyperchromic erythrocyte，Hyper-HE%），這些參數(shù)在不同人群貧血分類、RBC活性監(jiān)測等方面有著重要的應用價值[1-4]。XN-20檢測樣本的準確性與全血樣本的穩(wěn)定性有關，而穩(wěn)定性則與存儲條件（時間和溫度）密切相關。楊尚瑜等[5]發(fā)現(xiàn)，在體外，RBC外液會緩慢進入細胞內(nèi)引起滲透性腫脹，隨著樣本放置時間的延長，平均紅細胞體積（mean corpuscular volume，MCV）會增大，平均紅細胞血紅蛋白濃度（mean corpuscular hemoglobin concentration，MCHC）會降低，而低溫（4 ℃）則會延緩這一過程。目前，關于RET、RBC新參數(shù)等方面的研究較少。為了探討抗凝全血樣本放置環(huán)境和時間對其穩(wěn)定性的影響，本研究選取了30例樣本，在2種保存條件下，分別于5個時間點連續(xù)檢測，以觀察這些參數(shù)的變化規(guī)律和穩(wěn)定性。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院臨床樣本30例，患者男15例、女15例，年齡（43±14）歲。30例樣本中，健康體檢者抗凝全血樣本18例（60%）；貧血患者抗凝全血樣本12例（40%），血紅蛋白為89.3（44～138） g/L。

1.2 儀器與試劑

XN-20（日本Sysmex公司）及配套試劑、質(zhì)控物，乙二胺四乙酸二鉀抗凝真空采血管（美國BD公司）。

1.3 方法

使用乙二胺四乙酸二鉀抗凝真空采血管采集所有研究對象2.0 mL靜脈血，充分混勻，以保證樣本中乙二胺四乙酸二鉀含量為1.5～2.2 mg/mL。測定前確保儀器性能良好，檢測結果穩(wěn)定可靠，所有樣本均在采集2 h內(nèi)完成第1次檢測，并以其為基線值。完成第1次測定后，將樣本分別于室溫（20～24 ℃）和冷藏（4～8 ℃）條件下儲存，分別于儲存12、24、48和72 h后進行測定。使用中值和高值質(zhì)控品每天檢測1次，連續(xù)檢測20 d，計算儀器各參數(shù)批間精密度[以變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）表示]。

1.4 評價標準

比較各時間點檢測數(shù)據(jù)組與2 h基線數(shù)據(jù)組儀器RET、RBC新參數(shù)穩(wěn)定性評價標準，將結果作為其均值，以差異不超過基線數(shù)據(jù)標準誤為該參數(shù)穩(wěn)定性可接受，反之則不可接受。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 15.0軟件計算各參數(shù)各時間點數(shù)據(jù)組均值、標準誤、95%可信區(qū)間，采用Excel 2013軟件計算各時間點測定值與基線值的差異。正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用±s表示，采用Shapiro-Wilk檢驗對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性分析。

2 結果

2.1 批間精密度

收集20 d低、中、高值質(zhì)控品室內(nèi)質(zhì)量控制數(shù)據(jù)的CV，具體結果見表1。

表1 RET、RBC新參數(shù)的批間精密度

2.2 分析穩(wěn)定性

2.2.1 室溫條件下的穩(wěn)定性 在室溫條件下，RET%和RET#在樣本采集后能穩(wěn)定72 h，72 h測定值與基線值的差異分別為0.059 0×1012/L和0.002 3×1012/L，均小于基線組標準誤，即0.217 4×1012/L和0.007 9×1012/L；IRF%、LFR%、HFR%、Hypo-HE%、Hyper-HE%能穩(wěn)定48 h，48 h測定值與基線的差異分別為-0.94%、0.73%、-0.27%、-0.43%、-0.05%；MFR%和Micro-R%能穩(wěn)定24 h，24 h測定值與基線值的差異分別為-0.33%和-0.77%；RET-HE只能穩(wěn)定12 h，而Macro-R%穩(wěn)定時間不到12 h。見表2。

表2 乙二胺四乙酸二鉀抗凝全血樣本在室溫條件下RET、RBC新參數(shù)穩(wěn)定性

2.2.2 冷藏條件下的穩(wěn)定性 在冷藏條件下，除IRF%只能穩(wěn)定48 h外（48 h測定值與基線值的差異為-0.73%，稍小于室溫條件），其他參數(shù)均能穩(wěn)定72 h以上。見表3。

表3 乙二胺四乙酸二鉀抗凝全血樣本在冷藏條件下RET、RBC新參數(shù)穩(wěn)定性

3 討論

眾所周知，為保證結果的準確性，實驗室在進行血細胞有形成分檢測時應盡量保證樣本新鮮，但因城市邊際的擴大、各醫(yī)療機構的分散、實驗室的中心化、樣本量的劇增等客觀原因，越來越多的樣本無法保證在短時間內(nèi)完成檢測，這類樣本則不可避免地受到儲存條件的影響。為了解樣本在運輸、儲存過程中發(fā)生的變化，樣本穩(wěn)定性相關研究非常重要。

XN-20利用流體動力聚焦術和鞘流直流電檢測技術，可測定RET和RBC亞群中單個細胞的血紅蛋白含量及體積的特征，生成RET-HE、Micro-R%、Macro-R%、Hypo-HE%和Hyper-HE%等新參數(shù)[6]。RET通道中的RBC被核酸染色并采用熒光流式細胞術進行分析，生成前向散射光（forward scatter，F(xiàn)SC）/熒光強度（fluorescence intensity，F(xiàn)SL）散點圖，由于熒光強度與RNA含量成正比，根據(jù)熒光強弱把RET從成熟RBC中分離，并根據(jù)其在散點圖中的位置，進一步區(qū)分HFR、MFR和LFR，而IRF是后兩者之和[7]。RET、IRF等相關參數(shù)是反映骨髓造血功能的重要指標；FSC/FSL散點圖中FSC的對數(shù)值即為RET-HE，可作為早期鐵缺乏的監(jiān)測指標[2]。Hypo-HE%和Hyper-HE%由高角度FSC和側(cè)向散射光計算得出，分別表示平均血紅蛋白含量（mean corpuscular hemoglobin，MCH）<17 pg和>49 pg的紅細胞所占的百分比；Micro-R%和Macro-R%在RBC/血小板通道進行計數(shù)，分別代表MCV<60 fL和>120 fL的RBC所占的百分比；Hypo-HE%反映RBC生命周期中的鐵含量[8]，Hyper-HE%可作為遺傳性球形紅細胞增多癥、自身免疫性溶血的監(jiān)測指標[9]；在鑒別地中海貧血與缺鐵性貧血時，因Micro-R%在地中海貧血中更高[10]，所以被推薦為鑒別指標。但有學者發(fā)現(xiàn)，Micro-R%和Hypo-HE%的比值在上述2種疾病的鑒別方面更加敏感[11]，這些參數(shù)均為傳統(tǒng)貧血相關實驗室檢測提供了一種簡單、經(jīng)濟的補充方案。

本研究結果顯示，XN-20檢測RET%和RET#的結果較為穩(wěn)定，受儲存溫度和時間影響最小，無論是室溫條件，還是冷藏條件下，均可穩(wěn)定72 h；而陳梅等[12]認為只可穩(wěn)定48 h，可能是檢測儀器型號的差異所致。本研究結果表明，IRF%參數(shù)在冷藏條件下的72 h穩(wěn)定性雖有所增強，但仍未到達可接受范圍，即無論室溫放置還是冷藏，均只能穩(wěn)定48 h；在室溫條件下，LFR%、HFR%、Hypo-HE%、Hyper-HE%只能在48 h內(nèi)保持穩(wěn)定，但在冷藏條件下則可穩(wěn)定72 h，原因可能為IRF%、LFR%和HFR%代表網(wǎng)織紅細胞老化的情況，而網(wǎng)織紅細胞在室溫條件下更易成熟和衰老；MFR%和Micro-R%室溫放置只能穩(wěn)定48 h，在冷藏條件下則可穩(wěn)定72 h；Macro-R%室溫放置12 h后即超出可接受范圍，而在冷藏條件下可穩(wěn)定72 h，原因可能為Hypo-HE%和Hyper-HE%與MCH有關，Micro-R%和Macro-R%則與MCV大小有關，全血樣本在室溫下放置，受樣本中RBC滲透壓的影響，血漿中的水分隨時間的延長緩慢進入紅細胞內(nèi)部引起細胞腫脹，從而導致MCV的增高和MCH的減低；而低溫可讓RBC無氧酵解代謝速度放緩，從而保證RBC膜鈉鉀離子泵正常功能得以維持，所以血漿中的水分滲入紅細胞內(nèi)部的速度大大減緩[13]。與室溫放置相比，在冷藏條件中保存，RET-HE穩(wěn)定性大幅提高，穩(wěn)定時間從原來的12 h提升至72 h。但有研究結果表明，無論室溫放置，還是冷藏保存，RET-HE在48 h內(nèi)均非常穩(wěn)定[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，延長樣本存儲時間至72 h后，RET-HE冷藏保存比室溫放置要穩(wěn)定得多（0.44 g/L和-1.23 g/L）。

綜上所述，乙二胺四乙酸二鉀抗凝全血樣本進行RET和RBC新參數(shù)檢測時，仍會受到儲存溫度和時間的影響，實驗室應盡量保證樣本新鮮，如不能及時檢測，需冷藏保存，以保證結果的準確性。