包大偉， 黃 建

（淮安市第一人民醫(yī)院病理科，江蘇 淮安 223300 ）

目前，腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cell，CSC）已在多種實(shí)體瘤，如乳腺癌、膀胱癌、肺癌和結(jié)腸癌中被鑒定出[1]。CSC可能是惡性腫瘤中所有腫瘤細(xì)胞的來(lái)源，與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移及腫瘤細(xì)胞的耐藥性密切相關(guān)[2]。CD133是CSC的標(biāo)志物[3]，已被用于鑒定多種腫瘤中的CSC。有研究結(jié)果顯示，CD133的表達(dá)與結(jié)腸癌[4]和肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）[5]的不良預(yù)后有關(guān)。另外，乙醛脫氫酶1（aldehyde dehydrogenase 1，ALDH1）也是CSC的標(biāo)志物[3]。覃宇奇等[6]的研究結(jié)果顯示，ALDH1和CD133與鼻咽癌的病情進(jìn)展及轉(zhuǎn)移相關(guān)。為此，本研究擬探究CD133和ALDH1在HCC中的臨床價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2016年1月—2020年1月淮安市第一人民醫(yī)院經(jīng)病理檢查確診的HCC患者70例（HCC組），其中男29例、女41例，年齡（44.82±6.36）歲，體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）為（23.50±3.50）kg/m2。另選取同期淮安市第一人民醫(yī)院肝硬化患者70例（肝硬化組），其中男32例、女38例，年齡（47.28±8.22）歲，BMI為（22.01±5.20）kg/m2。以同期淮安市第一人民醫(yī)院體檢健康者70名為正常對(duì)照組，其中男31名、女39名，年齡（45.25±8.37）歲，BMI為（22.28±5.52）kg/m2。3組之間性別、年齡及BMI差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。本研究經(jīng)淮安市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過(guò)，所有對(duì)象均知情同意。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) （1）HCC患者均經(jīng)影像學(xué)檢查、肝穿刺活檢及術(shù)后病理檢查確診，肝硬化患者經(jīng)影像學(xué)檢查和肝穿刺活檢確診。所有患者均為初診患者，未合并其他重大疾病，病例資料完整。HCC患者接受手術(shù)治療前未接受過(guò)其他治療，均有乙型肝炎病毒感染史；（2）體檢者生化指標(biāo)均無(wú)異常，既往無(wú)肝病史，無(wú)肝病家族史，無(wú)其他重大疾??；（3）所有對(duì)象研究期間無(wú)失聯(lián)情況。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）非初診患者；（2）合并其他重大疾病者；（3）研究期間失聯(lián)者。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集及處理 收集HCC患者經(jīng)手術(shù)切除的腫瘤組織樣本，同時(shí)收集對(duì)應(yīng)的無(wú)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)的癌旁組織樣本作為對(duì)照。采集所有患者入院24 h內(nèi)、體檢健康者體檢當(dāng)日的空腹靜脈血10 mL，其中5 mL離心分離血清，用于檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、前白蛋白（prealbumin，PA）、甲胎蛋白（alphafetoprotein，AFP）和ALDH1水平；剩余5 mL用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

1.3.2 免疫組化 所有組織樣本經(jīng)石蠟包埋，常規(guī)切片（厚度4 μm）。CD133免疫組化試劑盒購(gòu)自德國(guó)美天旎公司，嚴(yán)格按說(shuō)明書進(jìn)行操作。結(jié)果判定：細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒即判定為CD133陽(yáng)性細(xì)胞，隨機(jī)選取5個(gè)視野（×400），計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占視野細(xì)胞總數(shù)的百分比，以<30%為弱陽(yáng)性、30%～60%為陽(yáng)性、>60%為強(qiáng)陽(yáng)性、無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為陰性。免疫組化結(jié)果均由2位病理科主治醫(yī)師獨(dú)立進(jìn)行觀察判斷，以二者均值進(jìn)行結(jié)果判定。

1.3.3 ALT、AST、PA、AFP和ALDH1檢測(cè) ALT、AST、PA、AFP和ALDH1試劑均購(gòu)自北京九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司，AFP參考區(qū)間為0～20.0 μg/L，高于參考區(qū)間上限即為AFP陽(yáng)性，反之為陰性。檢測(cè)儀器為7180型全自動(dòng)生化分析儀（日本日立公司）。嚴(yán)格按儀器和試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 取全血樣本2.4 mL，裂解紅細(xì)胞后離心棄去上清，重懸于100 μL 磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）中，采用FACSCanto流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）進(jìn)行白細(xì)胞（white blood cell，WBC）計(jì)數(shù)，檢測(cè)淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)（the absolute value of lymphocyte，LYMPH#）。另取全血樣本2.4 mL，裂解紅細(xì)胞后離心棄去上清，重懸于100 μL PBS中，加入藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）標(biāo)記的CD133單克隆抗體（德國(guó)美天旎公司），室溫孵育45 min，PBS洗滌3次，用500 μL PBS重懸，采用FACSCanto流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD133百分比（CD133%）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，2個(gè)組之間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。計(jì)數(shù)資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評(píng)價(jià)各項(xiàng)指標(biāo)診斷HCC的效能。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常對(duì)照組、肝硬化組及HCC組一般資料比較

正常對(duì)照組、肝硬化組及HCC組之間LYMPH#、ALT、AST、PA、AFP差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），WBC計(jì)數(shù)3組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

表1 正常對(duì)照組、肝硬化組及HCC組一般資料比較 ±s

表1 正常對(duì)照組、肝硬化組及HCC組一般資料比較 ±s

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與肝硬化組比較，#P<0.05；空白表示無(wú)此項(xiàng)。

組別 例數(shù) WBC計(jì)數(shù)/（×109/L）LYMPH#/（×109/L） ALT/（U/L） AST/（U/L） PA/（g/L） AFP/（ng/mL）正常對(duì)照組 70 5.39±1.02 1.63±0.51 28.40±5.60 29.23±4.94 248.29±19.84 5.78±1.42肝硬化組 70 5.19±0.92 1.43±0.21* 48.23±15.94* 58.33±17.94* 88.29±11.64* 23.20±11.51*HCC組 70 5.09±0.82 1.18±0.31*# 52.13±15.34* 62.53±15.70* 118.09±16.64*# 68.43±20.45*#統(tǒng)計(jì)值 1.915 25.729 65.298 116.522 1 886.345 397.320 P值 0.150 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

2.2 正常對(duì)照組、肝硬化組及HCC組外周血CD133%及血清ALDH1水平的比較

HCC組外周血CD133%及血清ALDH1水平顯著高于肝硬化組和正常對(duì)照組（P<0.001），而肝硬化組與正常對(duì)照組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表2。

表2 正常對(duì)照組、肝硬化組、HCC組外周血CD133%及血清ALDH1水平的比較 ±s

表2 正常對(duì)照組、肝硬化組、HCC組外周血CD133%及血清ALDH1水平的比較 ±s

注：與HCC組比較，*P<0.001；空白表示無(wú)此項(xiàng)。

組別 例數(shù) CD133%/% ALDH1/（ng/mL）HCC組 70 0.79±0.02 31.55±5.42肝硬化組 70 0.03±0.01* 4.92±1.31*正常對(duì)照組 70 0.02±0.01* 4.11±0.76*F值 68 285.00 1 616.57 P值 <0.001 <0.001

2.3 CD133蛋白在HCC組織和癌旁組織中的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，HCC組織CD133的陽(yáng)性表達(dá)率為60.00%（42/70），高于癌旁組織[14.29%（10/70）]（χ2=31.33，P<0.001）。

2.4 外周血CD133%、血清ALDH1水平與HCC患者臨床病理特征的關(guān)系

外周血CD133%與腫瘤細(xì)胞分化程度、腫瘤大小和TNM分期有關(guān)（P<0.001），與年齡、性別無(wú)關(guān)（P>0.05）。血清ALDH1水平與腫瘤分化程度和TNM分期有關(guān)（P<0.001），與年齡、性別和腫瘤大小無(wú)關(guān)（P>0.05）。見(jiàn)表3。

表3 外周血CD133%和血清ALDH1水平與HCC患者臨床病理特征的關(guān)系

2.5 各項(xiàng)指標(biāo)診斷HCC的效能

ROC曲線分析結(jié)果顯示，外周血CD133%及血清ALDH1、AFP水平診斷HCC的曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.588、0.635、0.877，最佳臨界值分別為0.61%、5.35 ng/mL、3.33 ng/mL，敏感性分別為84%、79%、78%，特異性分別為65%、63%、62%。見(jiàn)圖1。

圖1 外周血CD133%和血清ALDH1、AFP水平診斷HCC的ROC曲線

2.6 外周血CD133%、血清ALDH1水平診斷AFP陰性HCC的效能

70例HCC患者中有19例AFP為陰性。ROC曲線分析結(jié)果顯示，外周血CD133%及血清ALDH1水平診斷AFP陰性HCC的AUC分別為0.835、0.853，最佳臨界值分別為0.71%、5.67 ng/mL，敏感性分別為84%、78%，特異性分別為70%、63%。見(jiàn)圖2。

圖2 外周血CD133%和血清ALDH1水平診斷AFP陰性HCC的ROC曲線

3 討論

CD133是一種位于細(xì)胞膜上的糖多肽，是傳統(tǒng)造血干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和血液腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志物，位于細(xì)胞膜的微突出處，這一部位是維持細(xì)胞干性的關(guān)鍵區(qū)域，主導(dǎo)細(xì)胞的分化。有研究結(jié)果顯示，在肝外膽管癌組織中，CD133表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于癌旁膽管組織和正常膽管組織（P<0.05）；CD133的表達(dá)與肝外膽管癌的TNM分期、腫瘤細(xì)胞分化程度和轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05），且與另一干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4（octamer-binding transcription factor 4，Oct4）的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.33，P<0.05）[7]。Oct4和CD133均可作為評(píng)估肝外膽管癌生物學(xué)行為和預(yù)后的參考指標(biāo)[7]。張澤峰等[8]的研究結(jié)果顯示，雖然CD133陽(yáng)性肺癌患者（75.00%）和CD133陰性肺癌患者（83.30%）1年生存率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.149），但CD133陽(yáng)性肺癌患者2年生存率（45.83%）和3年生存率（25.00%）明顯低于CD133陰性肺癌患者（61.11%、50.00%）（P值分別為0.031、0.000），表明CD133高水平表達(dá)提示患者預(yù)后不良。本研究結(jié)果顯示，HCC組外周血CD133%顯著高于肝硬化組和正常對(duì)照組（P<0.001），且HCC組織中CD133的陽(yáng)性率（60.00%）顯著高于癌旁組織（14.29%）（P<0.001），與文獻(xiàn)報(bào)道[9]一致。提示CD133具有作為HCC診斷標(biāo)志物的潛力。

ALDH1也被認(rèn)為是CSC的標(biāo)志物，在多種惡性腫瘤，如乳腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌中表達(dá)升高[10]。楊麗青等[11]的研究結(jié)果顯示，高水平的ALDH1預(yù)示著乳腺癌預(yù)后不良。本研究結(jié)果顯示，HCC組血漿ALDH1水平顯著高于肝硬化組和正常對(duì)照組（P<0.001）。這提示ALDH1在HCC的輔助診斷中有一定的價(jià)值。

本研究結(jié)果顯示，外周血CD133%與HCC的分化程度、腫瘤大小和TNM分期有關(guān)（P<0.001），與年齡、性別無(wú)關(guān)（P>0.05）。血清ALDH1水平與HCC的分化程度和TNM分期有關(guān)（P<0.001），與年齡、性別和腫瘤大小無(wú)關(guān)（P>0.05）。這提示ALDH1和CD133與HCC病情的嚴(yán)重程度有關(guān)。

本研究ROC曲線分析結(jié)果顯示，外周血CD133%及血清ALDH1、AFP診斷HCC的AUC分別為0.588、0.635、0.877，外周血CD133%及血清ALDH1診斷AFP陰性HCC的AUC分別為0.821、0.850，提示外周血CD133%及血清ALDH1對(duì)AFP陰性HCC有較高的輔助診斷價(jià)值。

綜上所述，CD133和ALDH1在HCC的輔助診斷和病情判斷中有一定的臨床價(jià)值，對(duì)于AFP陰性HCC的輔助診斷效能更高，因此可作為HCC輔助診斷的補(bǔ)充指標(biāo)。