吳磊磊 張俊忠

(1.山東中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，山東 濟南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院運動損傷骨科，山東 濟南 250014)

骨關節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)指由多種因素引起關節(jié)軟骨纖維化、皸裂、潰瘍、脫失而導致的關節(jié)疾病，發(fā)病率約為2%～6%，以中老年患者多見，女性多于男性[1-2]。OA在40歲人群的發(fā)病率為10%～17%，60歲以上則達50%，而在75歲以上人群，患病率可達80%，最終致殘率高達53%，隨著醫(yī)療條件改善和人類壽命的延長，OA成為影響老年人生活質(zhì)量和健康狀態(tài)的重要疾病之一[3]。主要病變是關節(jié)軟骨的退行性變和繼發(fā)性骨質(zhì)增生，好發(fā)于負重大、活動多的關節(jié)，如脊柱、膝、髖關節(jié)等。臨床表現(xiàn)為疼痛、活動障礙、僵硬、腫大畸形等。發(fā)病因素目前尚不明確，有學者認為主要與高齡、肥胖、關節(jié)疲勞、機械損傷、寒冷、過度運動和遺傳等相關[4]。

OA在中醫(yī)上屬于“骨痹”“痹證”范疇，最早可見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，《素問·長刺節(jié)論篇》：“病在骨，骨重不可舉，骨髓酸痛，寒氣至，名曰骨痹。”骨關節(jié)炎在國內(nèi)，中醫(yī)藥治療骨關節(jié)炎仍是優(yōu)先選擇手段[5]。中醫(yī)藥治療骨關節(jié)炎具有療效顯著、副作用小、費用低等優(yōu)勢[6]。

桃紅四物湯出自《醫(yī)宗金鑒》，由桃仁、紅花、川芎、當歸、熟地黃、白芍六味藥組成，具有祛瘀、行氣、活血功效，方中以桃仁、紅花為君，主活血化瘀之功；熟地黃、當歸性甘溫，佐以滋陰養(yǎng)肝之效；白芍養(yǎng)血和營，以增強補血之力；川芎活血行氣、調(diào)暢氣血，加強活血。全方配伍得當，藥性和緩，補血而不滯血，和血而不傷血。

網(wǎng)絡藥理學(Network pharmacology)由Hopkins在2007年提出的一門新興學科，通過系統(tǒng)觀察藥物對疾病的干預和影響，預測藥物的致病作用機制，評估藥物的有效性等[7]，為藥物的研發(fā)和應用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1桃紅四物湯相關靶點篩選及藥物-成分-靶點網(wǎng)絡構(gòu)建 通過中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺[8](TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php)分別以“桃仁”、“紅花”、“當歸”、“川芎”、“熟地黃”、“白芍”為關鍵詞檢索桃紅四物湯的成分，根據(jù)口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)≥30和類藥性(Drug likeness，DL)≥0.18為ADME屬性值對活性成分進行篩選，得到6個藥物中所含有的成分，并利用化學成分進行檢索，得到相對應的蛋白質(zhì)靶點。篩選結(jié)束后，運用Uniprot數(shù)據(jù)庫[9](https://www.uniprot.org/)查詢并規(guī)范相對應的官方基因名稱(official gene symbol)，合并并刪除重復值。運用Cytoscape 3.7.2軟件[10]構(gòu)建“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡，利用Cytoscape 3.7.2軟件中的“Network Analyzer”進行拓撲屬性分析。

1.2OA相關靶點預測及韋恩圖制作 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫[11](https://www.genecards.org/Guide/Publications)、TTD數(shù)據(jù)庫[12](http://db.idrblab.net/ttd/)以“Osteoarthritis”為關鍵詞檢索與OA相關的疾病靶點，合并靶點并刪除重復值，建立OA相關疾病基因靶點數(shù)據(jù)集。通過Venny在線制作平臺(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)將藥物基因靶點和疾病基因靶點相映射，繪制韋恩圖并獲得藥物-疾病交集基因靶點。

1.3PPI網(wǎng)絡的構(gòu)建與分析 將得到的藥物-疾病交集基因靶點導入到STRING 11.0數(shù)據(jù)庫[13](https://string-db.org/)中構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡，設置物種種類為“Home sapiens”(人類)，最低互相作用閾值設置為“high confidence”(>0.700),隱藏網(wǎng)絡中未連接的節(jié)點，其余均為默認值，得到PPI網(wǎng)絡圖和TSV文件，將TSV文件導入Cytoscape 3.7.2軟件中，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡，進行拓撲屬性分析，篩選核心靶點信息。

1.4靶點功能與通路的富集分析 為了進一步了解藥物-疾病的潛在治療基因靶點的功能和在信號通路中發(fā)揮的作用，將交集基因靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫[14](https://david.ncifcrf.gov/)，物種種類設置為“Home sapiens”(人類)，設置P<0.05，進行GO富集分析和KEGG信號通路富集分析。GO分析選擇細胞組分(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)和生物過程(biological process，BP)。利用Omicshare在線云平臺繪制GO富集分析分類柱狀圖、氣泡圖和KEGG信號通路富集分析氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1桃紅四物湯活性成分的獲取 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索得到桃紅四物湯中成分共730個，其中白芍85個、川芎189個、當歸125個、紅花189個、熟地黃76個、桃仁66個。以OB≥30，DL≥0.18為ADME屬性值對藥物成分進行篩選，共篩選出69個活性成分，其中13個來自白芍、7個來自川芎、2個來自當歸、22個來自紅花、2個來自熟地黃、23個來自桃仁，見表1。檢索藥物靶點基因得到440個，白芍86個、川芎24個、當歸44個、紅花208個、熟地黃32個、桃仁46個，合并并刪除重復值得到桃紅四物湯藥物靶點基因220個。

表1 桃紅四物湯中部分活性化合物成分

2.2藥物-成分-靶點網(wǎng)絡的構(gòu)建和分析 運用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建桃紅四物湯藥物-成分-靶點網(wǎng)絡圖，見圖1。該網(wǎng)絡包含266個節(jié)點(node)，480條邊(edge)，倒三角形代表藥物，六邊形代表化合物成分，菱形代表靶點基因。利用“Network analyze”功能對網(wǎng)絡進行拓撲屬性分析，根據(jù)度值(Degree)大小設置節(jié)點的大小及顏色，顏色越深、面積越大表示該節(jié)點越重要。在藥物-成分-靶點網(wǎng)絡中，度值排名前5位的化合物分別為：kaempferol(山柰酚)、beta-sitosterol(β-谷甾醇)、baicalein(黃芩素)、stigmasterol(豆甾醇)、beta-carotene(β-胡蘿卜素)。

圖1 桃紅四物湯“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡

2.3桃紅四物湯治療OA的潛在治療靶點 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫和TTD數(shù)據(jù)庫檢索OA疾病靶點，合并及刪除重復值后共得到疾病靶點1353個，通過Venny在線平臺將藥物靶點和疾病靶點相映射，共得到交集靶點112個，見圖2。

圖2 桃紅四物湯治療OA潛在靶點Venny圖

2.4PPI網(wǎng)絡的構(gòu)建和分析 將獲得的112個交集靶點上傳至STRING 11.0平臺，最低互相作用閾值設置為“high confidence”(>0.700),隱藏5個未參與的節(jié)點，將保存的TSV文件導入Cytoscape 3.7.2軟件中進行拓撲屬性分析，共獲得107個節(jié)點(node)、1061條邊(edge),平均度值19.3，按照度值進行排布，度值>20的節(jié)點有43個。度值越大證明該節(jié)點在網(wǎng)絡中的位置越關鍵，作用可能越重要。得到桃紅四物湯治療OA的潛在靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(PPI)，見圖3，度值越大，在網(wǎng)絡圖中越明亮，圖形面積也越大。根據(jù)度值篩選排名前11的靶點(Degree>40)用柱狀圖表示，見圖4(X軸表示靶點名稱，Y軸表示度值)。

圖3 桃紅四物湯治療OA潛在靶點PPI網(wǎng)絡

圖4 PPI網(wǎng)絡中排名前11的關鍵靶點

2.5GO富集分析和KEGG信號通路富集分析 將112個潛在治療靶點導入到DAVID數(shù)據(jù)庫，共得到GO富集條目592條(P<0.05)，包括50種細胞組分(cellular component，CC)、82類分子功能(molecular function，MF)、460個生物過程(biological process，BP)。GO富集分析柱狀圖見圖5(藍色表示BP、黃色表示MF、綠色表示CC)。BP方面主要富集在細胞分化、炎癥反應、代謝過程、信號通路、細胞凋亡、信號調(diào)節(jié)等；MF主要富集在蛋白結(jié)合、離子結(jié)合、催化活性、酶活性調(diào)節(jié)、分子功能調(diào)節(jié)等；CC主要富集在細胞膜、細胞器、核、質(zhì)膜、細胞外區(qū)域等。將富集排名前20條目用氣泡圖表現(xiàn)，見圖6(橫軸表示所占比例，縱軸表示GO分析條目，面積越大表示該條目基因越多)。

圖5 GO富集分析二級分類

圖6 GO富集分析結(jié)果

KEGG信號通路富集分析共得到106條通路(P<0.05)，涉及PI3K/Akt信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、HIF-1信號通路、MAPK信號通路、破骨細胞分化、p53信號通路、Wnt信號通路等。選取富集排名前20的信號通路用氣泡圖表示，見圖7(橫軸表示比例，縱軸為信號通路，面積越大表示該通路基因數(shù)目越多)。根據(jù)文獻檢索[15-18]發(fā)現(xiàn)與骨關節(jié)炎相關的信號通路有：PI3K/Akt信號通路、MAPK信號通路、NF-κB信號通路、JAK/STAT3信號通路、Wnt信號通路、TGF-β信號通路等。選取關鍵通路，利用Cytosape 3.7.2軟件構(gòu)建“靶點-通路”網(wǎng)絡，見圖8(綠色圓形表示通路，藍色菱形表示靶點)。

圖7 KEGG信號通路富集分析結(jié)果

圖8 “靶點-通路”網(wǎng)絡

3 討論

隨著人類壽命的延長及人口老齡化加劇，OA成為影響老年人生活質(zhì)量的主要疾病之一，并且隨著現(xiàn)代人活動頻率和強度的不斷增加，OA的發(fā)病率呈現(xiàn)出不斷年輕化的態(tài)勢[19]。當前OA的治療目的是緩解癥狀、改善功能、延緩進程及矯正畸形。桃紅四物湯具有調(diào)節(jié)免疫、抗感染、鎮(zhèn)痛、擴張血管、抗炎等作用[20-21]。朱蘭妃[22]等運用桃紅四物湯治療氣滯血瘀型膝骨性關節(jié)炎取得了較好的療效。宋敏[23]等報道桃紅四物湯可能通過與MMP-1，TIMP-1上的酶結(jié)合位點相結(jié)合而對軟骨起到保護修復作用。

通過數(shù)據(jù)庫檢索桃紅四物湯成分及藥物-成分-靶點網(wǎng)絡拓撲屬性分析發(fā)現(xiàn)，按照度值(Degree)進行排布，桃紅四物湯中排名前5的成分為：山柰酚、β-谷甾醇、黃芩素、豆甾醇、β-胡蘿卜素。山奈酚是一類廣泛存在于蔬菜、水果及中藥材中的黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗癌等多種功能[24]。山奈酚可以通過抑制炎癥因子的表達而起到抗炎效果[25]。曾意榮等[26]認為山奈酚可以通過調(diào)控雌激素受體活性促進成骨細胞的增殖、分化和礦化達到預防骨質(zhì)疏松的目的。β-谷甾醇和豆甾醇都屬于植物甾醇，具有抗癌、抗氧化、抗炎等作用，研究表明β-谷甾醇抗炎作用類似氫化可的松和羥基保泰松，且無可的松類藥物的副作用，還具有類似阿司匹林(乙酰水楊酸)的退熱作用,而不具有潰瘍性[27-28]。研究表明，黃芩素可以通過干擾花生四烯酸的代謝通路和抑制核因子的活性以及細胞因子的分泌而發(fā)揮解熱鎮(zhèn)痛抗炎的作用[29]。有學者通過大鼠實驗發(fā)現(xiàn)黃芩素可以通過抑制血管通透性的增加而減輕骨關節(jié)炎的繼發(fā)損害[30]。

在桃紅四物湯治療OA的蛋白相互作用網(wǎng)絡(PPI)結(jié)果分析中，共有107個靶點基因，通過拓撲分析發(fā)現(xiàn)桃紅四物湯治療OA的潛在關鍵靶點有：IL6、TNF、JUN、VEGFA、IL1B，度值分別為：56、55、53、52、41。IL6和IL1B屬于白細胞介素類，可以通過激活相應通路促進炎性介質(zhì)的釋放，IL6在外周血中的水平與KOA的嚴重程度呈正相關性，不僅可以通過作用T淋巴細胞和B淋巴細胞的自分泌形式影響軟骨細胞的正常增殖，還可以通過增加滑膜組織的炎癥細胞刺激軟骨細胞的增殖，最終加重軟骨細胞的破壞，影響OA的發(fā)展[31-32]。IL1B(IL-1β)是IL-1中的一種亞型，可以通過NF-κB、MAPK信號通路調(diào)控,提高促炎性因子水平，從而增強炎癥反應釋放炎癥介質(zhì)，引發(fā)關節(jié)軟骨退變、破壞及降解[33]。TNF(腫瘤壞死因子)作用與IL-1類似。VEGFA(血管內(nèi)皮生長因子A)對血管內(nèi)皮細胞的存活、增殖、遷移和血管通透性具有較強的作用。研究表明，VEGFA可以上調(diào)MMP-1和MMP-3使軟骨基質(zhì)降解加速骨關節(jié)炎的進展[34]。

桃紅四物湯治療OA的GO富集分析和KEGG信號通路富集分析可以看出，GO分析中生物過程主要集中在細胞分化、炎癥反應、代謝過程、信號通路、細胞凋亡、信號調(diào)節(jié)等，在治療過程中起到了關鍵作用。KEGG信號通路富集分析中，PI3K/Akt信號通路在細胞的增殖、凋亡分化等方面起著重要作用，通過調(diào)節(jié)成骨細胞的凋亡參與到以骨破壞為主要特征的骨關節(jié)炎、骨質(zhì)疏松等相關疾病中[35]。李曉燕等[36]在骨關節(jié)炎大鼠中發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT信號通路受抑制情況下會導致軟骨細胞的凋亡和自噬，加速骨關節(jié)炎的進展。MAPK信號通路通過3級激酶級聯(lián)的方式進行信號傳導，與軟骨細胞的增殖、分化、凋亡和炎性反應密切相關，是OA發(fā)生發(fā)展中極為重要的通路，其中MAPKs家族通路中p38MAPK、JNK及ERK1/2與OA關系最為密切[37]。Ma[38]等發(fā)現(xiàn)，p38MAPK信號通路在骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC)向成骨、成軟骨分化過程中起到良性促進作用。JAK/STAT3信號通路的激活可導致軟骨細胞的破壞、促進軟骨下骨硬化、滑膜細胞增殖和滑膜炎等加重OA的發(fā)生發(fā)展[39]。Hayashi等[40]發(fā)現(xiàn)在細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑P21(Cyclin dependent kinase inhibitor P21,P21)基因缺失的轉(zhuǎn)基因小鼠中軟骨蛋白多糖丟失加重，p-STAT3和基質(zhì)金屬蛋白酶-13陽性細胞的百分比更高，說明JAK/STAT3信號通路可能參與了生物因子缺乏(如P21缺乏)介導的軟骨損傷的過程。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡藥理學方法分析桃紅四物湯治療OA的藥理學機制，桃紅四物湯中山柰酚、β-谷甾醇、黃芩素等成分通過PI3K/Akt信號通路、MAPK信號通路、JAK/STAT3信號通路等調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡和炎癥反應等發(fā)揮治療作用，為桃紅四物湯治療OA提供了理論支持。網(wǎng)絡藥理學作為研究中醫(yī)中藥的一種新方法，但是目前仍存在缺乏相關實驗驗證和臨床驗證，因此其具體治療機制還有待進一步研究。