曹 慧，楊丹嬌，張 敏，李 平，張朝輝，湯 承,2，張 斌,2*

(1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，成都 610041；2.國(guó)家民族事務(wù)委員會(huì)青藏高原動(dòng)物疫病防控創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，成都 610041；3.四川省甘孜藏族自治州畜牧業(yè)科學(xué)研究所，康定 626000；4.四川省甘孜藏族自治州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，康定 626000)

戊型肝炎(hepatitis E，HE)是由戊型肝炎病毒(hepatitis E Virus，HEV)引起的一種人和多種動(dòng)物患病的人獸共患病，一般經(jīng)糞口途徑傳播。人HE在發(fā)展中國(guó)家和地區(qū)發(fā)病率達(dá)80%以上，致死率為1%左右，懷孕期為6～8月的孕婦死亡率可達(dá)20%[1]。目前在我國(guó)HE仍以散發(fā)形式流行[2]。過(guò)去認(rèn)為HE流行地區(qū)主要分布在發(fā)展中國(guó)家[3-4]，但是近年來(lái)在美國(guó)、法國(guó)、新西蘭、澳大利亞等發(fā)達(dá)國(guó)家亦有散發(fā)病例報(bào)道[5-6]。人們?cè)谪i、羊、老鼠等動(dòng)物中相繼檢測(cè)到戊肝病毒[7-9]。

HEV是一種正鏈單股RNA病毒，屬于肝炎病毒科正嗜肝病毒屬[10]。編碼區(qū)由3個(gè)部分重疊的開放式閱讀框(ORF1、ORF2 和ORF3)組成。由于該病毒能感染多種動(dòng)物宿主，跨物種感染很常見，因此HEV的基因組表現(xiàn)出顯著的多樣性?；谶@種序列多樣性，被分為至少8種基因型(1-8)[11-13]。1型和2型HEV僅感染人類，在發(fā)展中國(guó)家，由于飲用污染的飲用水而呈地方性流行[14-15]，基因型3和4主要感染人和各種動(dòng)物，5型和6型主要感野豬，新發(fā)現(xiàn)的7型流行病學(xué)分布還不明確，而8型是2016年在我國(guó)雙峰駱駝中發(fā)現(xiàn)的另一種新的基因型[11]；這些類型的HEV可通過(guò)人畜共患病傳播，在世界范圍內(nèi)引起感染[16]。在我國(guó)，基因4型HEV(HEV-4)是主要流行基因型，參與人畜共患傳播[17]，目前已在人和動(dòng)物中鑒定出9種HEV-4的亞型(HEV-4a至HEV-4i)[18]。豬戊型肝炎可感染人及豬、黑猩猩等多種動(dòng)物，豬作為僅能感染G3和G4的感染模型，通常表現(xiàn)為隱性，可引起人的高病死率，為一種重要的人獸共患傳染病，因此推測(cè)豬源HEV可能是引起人感染戊型肝炎的重要源頭，所以對(duì)其流行及傳播進(jìn)行監(jiān)測(cè)具有重要意義。

藏豬是我國(guó)唯一生活在青藏高原東南部重要的地方特色豬種，生活在海拔3 000 m以上的高山或河谷地區(qū)[19]，具有適應(yīng)高海拔惡劣氣候環(huán)境和抗病等特點(diǎn)。藏豬養(yǎng)殖以放牧為主，養(yǎng)殖環(huán)境衛(wèi)生條件較差，能與人以及其他動(dòng)物緊密接觸，共用水源或食物，這種養(yǎng)殖模式有利于HEV的流行，也有利于其跨宿主傳播。為了調(diào)查四川地區(qū)藏豬戊型肝炎病毒的流行情況和遺傳演化，本研究對(duì)2018—2020年采集自四川省甘孜藏族自治州和阿壩藏族自治州的22個(gè)藏豬場(chǎng)332份藏豬糞便樣本進(jìn)行HEV檢測(cè)，并對(duì)其進(jìn)行基因分型后，從每年的毒株中挑出1株典型株進(jìn)行全基因組擴(kuò)增以及遺傳進(jìn)化分析。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

KOD OneTMPCR Master Mix Blue和Quick Taq HS DyeMix購(gòu)自東洋紡(上海)生物科技有限公司；Trizol總RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和DL2000 DNA Marker購(gòu)自TaKaRa生物技術(shù)有限公司；凝膠成像儀購(gòu)自上海天能科技有限公司；TGL-16冷凍離心機(jī)購(gòu)自四川蜀科儀器有限公司；PCR儀購(gòu)自杭州博日科技有限公司。

1.2 病料的采集與處理

病料為2018—2020年采集自四川省甘孜藏族自治州和阿壩藏族自治州的22個(gè)藏豬場(chǎng)332份藏豬糞便樣本，其中健康樣本105份，腹瀉樣本227份，樣本于-80 ℃保存。按1∶5加入PBS震蕩混勻，反復(fù)凍融3次后，10 000 r·min-1離心5 min，取上清液凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

參考文獻(xiàn)[20]報(bào)道HEV的通用檢測(cè)引物為套式PCR引物，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為644 bp，參考文獻(xiàn)[21]發(fā)表的HEV全基因擴(kuò)增的引物序列(表1)對(duì)3份陽(yáng)性毒株進(jìn)行全基因組的擴(kuò)增，引物由北京擎科新業(yè)生物有限公司合成。

表1 HEV全基因擴(kuò)增引物信息

1.4 核酸的提取及反轉(zhuǎn)錄

用Trizol法抽提樣本中總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書制備cDNA。反應(yīng)體系：總RNA 4 μL，5×Buffer 2 μL，oligo(dT)0.5 μL，反轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL，RNase-Free Water 3 μL；反轉(zhuǎn)錄程序：37 ℃ 15 min，85 ℃ 15 s，16 ℃保存。將反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA放置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 藏豬腹瀉樣本中HEV陽(yáng)性率的調(diào)查

以步驟1.3中合成的HEV檢測(cè)引物對(duì)cDNA樣本進(jìn)行PCR檢測(cè)，PCR反應(yīng)體系：QuickTaqHS DyeMix 5 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 3 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)35次，72 ℃延伸8 min，16 ℃保存。

1.6 HEV陽(yáng)性樣本基因分型

用DNAStar等分子生物學(xué)軟件，將陽(yáng)性樣本擴(kuò)增出的ORF2片段進(jìn)行拼接，將拼接結(jié)果分別與GenBank不同血清型HEV毒株的ORF2進(jìn)行序列比對(duì)，借助線上工具iTOL(http://itol.embl.de/)繪制圓形進(jìn)化樹，分析其遺傳進(jìn)化關(guān)系，最終確定所有陽(yáng)性樣本的基因型。

1.7 HEV分歧時(shí)間估算

以貝葉斯進(jìn)化分析軟件(BEAST v1.8.0)的BEAUti程序設(shè)置序列的采樣時(shí)間、氨基酸置換模型、分子鐘模型、馬爾科夫鏈長(zhǎng)和先驗(yàn)參數(shù)。以BEAST程序運(yùn)算，通過(guò)MCMC方法進(jìn)行樹的重復(fù)抽樣，獲得具有最大后驗(yàn)概率的進(jìn)化樹。通過(guò)TreeAnnotator程序設(shè)置Burnin值。以FigTree v1.4.4軟件對(duì)進(jìn)化樹進(jìn)行修飾和分歧時(shí)間的標(biāo)定，分析病毒序列的演化過(guò)程。

1.8 HEV全基因組序列的擴(kuò)增

用RT-PCR法對(duì)3株典型HEV毒株陽(yáng)性樣本全基因進(jìn)行分段擴(kuò)增，KOD OneTMPCR Master Mix Blue 12.5 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)條件：98 ℃ 10 s、62.4 ℃/63.1 ℃/59.4 ℃/61.7 ℃/65 ℃/53.7 ℃ 5 s、68 ℃ 10 s，循環(huán)35次。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。根據(jù)凝膠回收試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行回收純化，按照pMDT19-T Vector Cloning Kit說(shuō)明書進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆送北京擎科新業(yè)生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.9 HEV重組分析

為了分析不同來(lái)源的HEV毒株之間的遺傳關(guān)系和重組關(guān)系，以RDP4軟件的Chimaera、MaxChi、RDP、GENECONV、SiScan和3Seq方法對(duì)3株擴(kuò)增全基因組毒株進(jìn)行重組分析，利用SimPlot程序?qū)γ總€(gè)簇分別進(jìn)行相似性分析，對(duì)重組區(qū)和非重組區(qū)構(gòu)建獨(dú)立的進(jìn)化樹以驗(yàn)證重組。

2 結(jié) 果

2.1 藏豬HEV的檢出率

利用HEV檢測(cè)引物[20]，以RT-PCR方法對(duì)22個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)的332份糞便樣本進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示：在糞便樣本中，HEV核酸陽(yáng)性率為20.48%(68/332，95%CI=16.3%～25.2%)；22個(gè)規(guī)模藏豬場(chǎng)中，HEV豬場(chǎng)陽(yáng)性率為77.27%(17/22,95%CI=54.6%～92.2%)，健康樣本陽(yáng)性率為2.86%(3/105，95%CI=0.6%～8.1%))，腹瀉樣本陽(yáng)性率為28.63%(65/227，95%CI=22.8%～35.0%)，結(jié)果表明,HEV在四川藏豬中存在且流行。68個(gè)陽(yáng)性樣本中，65份陽(yáng)性來(lái)自腹瀉樣本，3份來(lái)自健康樣本，表明HEV可能與腹瀉有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

2.2 藏豬HEV陽(yáng)性樣本ORF2片段分析及分歧時(shí)間計(jì)算

通過(guò)MEGA對(duì)本研究中的68條測(cè)序藏豬源HEV序列與23條分型參考序列進(jìn)行ORF2片段比對(duì)，并通過(guò)線上工具iTOL(http://itol.embl.de/)繪制圓形進(jìn)化樹(圖1)。結(jié)果顯示，68個(gè)序列彼此之間核苷酸序列相似性為69.6%～100.0%，與之前報(bào)道的1～4型HEV分離株核苷酸序列相似性為75.1%～90.2%，與4型HEV的相似性最高(82.5%～90.2%)。根據(jù)目前的亞型分型標(biāo)準(zhǔn)，系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示,68株陽(yáng)性樣本均為G4型，其中4a型HEV毒株在四川地區(qū)藏豬HEV傳播中占有明顯優(yōu)勢(shì)。

.4a型；.4b型；●.4 d型；★.4j型；◆.G4型

為進(jìn)一步研究HEV的進(jìn)化過(guò)程，通過(guò)BEAST v1.8.0軟件對(duì)87條(其中包括本研究中分別從22個(gè) 豬場(chǎng)各挑選1株典型毒株的ORF2部分片段)確定采樣時(shí)間的HEV ORF2部分片段進(jìn)行分歧時(shí)間的估算。采用貝葉斯馬爾可夫鏈-蒙特卡羅(MCMC)算法進(jìn)行分析，通過(guò)BEAUti輸出模型的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、分支長(zhǎng)度和核苷酸替換模型等參數(shù)進(jìn)行重復(fù)抽樣，得到貝葉斯進(jìn)化樹(圖2)。結(jié)果表明,D7-2018分歧時(shí)間最早為1999年，K10-2018分歧時(shí)間為2008年，其余20支毒株均晚于2010年之后產(chǎn)生分歧，可以觀察到17株病毒的分歧時(shí)間除D7-2018外，均晚于世界各地HEV毒株的分歧時(shí)間，說(shuō)明四川藏豬HEV可能是由其他地區(qū)豬群傳染的。

橫坐標(biāo)為時(shí)間刻度，結(jié)點(diǎn)處示病毒分化的時(shí)間點(diǎn)。●為本研究毒株

2.3 3株HEV全基因擴(kuò)增和序列分析

為獲得藏豬HEV分離株進(jìn)化關(guān)系更精確的信息，從3年采集的所有樣本中，每年挑選1株典型毒株共3株進(jìn)行全基因的擴(kuò)增，并成功獲得了3株毒株的全基因序列。將全基因序列命名并上傳至GenBank，分別命名為SWU/31-12/2018、SWU/301/2019和SWU/A/2020。SWU/31-12/2018序列長(zhǎng)度為7 208 bp，GC含量為55.15%，登錄號(hào)為MK410046；SWU/30/2019序列長(zhǎng)度為7 244 bp，GC含量為54.13%，登錄號(hào)為MW365405；SWU/A/2020序列長(zhǎng)度為7 215 bp，GC含量為54.12%，登錄號(hào)為MW365406，3株全基因的相似性為89.5%～93.1%。68株陽(yáng)性樣本均將ORF2序列測(cè)序結(jié)果提交至GenBank，登錄號(hào)為MK410054～MK410091、MW365407～MW365436。將本研究中3條全基因與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中其他26條HEV全基因序列構(gòu)建全基因進(jìn)化樹(圖3)，結(jié)果表明，3株HEV均屬于G4型，且與人的HEV毒株親緣關(guān)系最近。

●.本研究擴(kuò)增的3條HEV全基因序列

2.4 HEV重組分析

通過(guò)RDP4和SimPlot軟件對(duì)3條HEV序列全基因組進(jìn)行重組分析，結(jié)果顯示,SWU/301/2019的多聚蛋白ORF1片段(圖4A)存在重組，選取重組序列SWU/301/2019、親本序列SWU/B6/2018和次要親本SWU/31-12/2018，利用SimPlot軟件進(jìn)行相似性分析(圖4B)。以斷點(diǎn)位置為界，將SWU/301/2019序列劃分為重組區(qū)域(3 746—4 655 bp)和兩個(gè)非重組區(qū)域(1—3 745 bp，4 656—3′末端)。通過(guò)MEGA 7.0軟件的Neighbor-Joining法對(duì)SWU/301/2019三個(gè)區(qū)域的核苷酸序列(圖4C1、C2、C3)分別構(gòu)建進(jìn)化樹，基于重組區(qū)域構(gòu)建的進(jìn)化樹與非重組區(qū)域顯示出不一致的遺傳系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，進(jìn)一步支持了SWU/301/2019的重組事件。

A.RDP4重組分析結(jié)果；B.SimPlot相似性分析結(jié)果；C1、C3.SWU/301/2019非重組區(qū)域構(gòu)建進(jìn)化樹；C2.SWU/301/2019重組區(qū)域構(gòu)建進(jìn)化樹

3 討 論

HEV引起的戊型肝炎是一種自限性疾病，作為人獸共患疾病之一，已在世界范圍內(nèi)造成了嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題[17-18]。在高原地區(qū)，所有動(dòng)物均以散養(yǎng)為主，且與人類生活區(qū)域無(wú)嚴(yán)格的界限，共用水源與食物，使HEV的流行和傳播加劇，同時(shí)也更有利于其跨種間傳播[22-23]。盡管已有研究表明HEV是高原一種重要的地方性疾病，但對(duì)于其流行率的分析有限，分子水平的遺傳進(jìn)化分析較少[24]。

本研究藏豬糞便中HEV陽(yáng)性率為20.48%(68/332，95%CI=16.3%～25.2%)，意大利一項(xiàng)研究表明，豬腹瀉樣本中HEV陽(yáng)性率顯著高于健康樣本陽(yáng)性率[26]，與本研究68份陽(yáng)性糞便中腹瀉樣本HEV陽(yáng)性率顯著高于健康樣本相契合，表明HEV的流行可能與腹瀉有關(guān)。本研究藏豬HEV陽(yáng)性率為20.48%，顯著高于2018年對(duì)四川豬HEV陽(yáng)性率進(jìn)行的報(bào)道[27]，同時(shí)也顯著高于藏豬血清[24]以及膽汁[25]中HEV感染率的調(diào)查，說(shuō)明在高原地區(qū)藏豬感染HEV的情況相當(dāng)普遍，且以糞便傳播為主，提示人們要重視高原藏豬HEV的防控及流行情況。

HEV最早被認(rèn)為只感染人類，引起自限性肝炎，免疫功能低下個(gè)體可能發(fā)生慢性HEV感染[29],隨后被證實(shí)為人畜共患疾病[10]，HEV-4型為主要的人畜共患基因型，近年來(lái)，也有研究證明HEV-4型為我國(guó)主要流行基因型，但4型亞型的流行在不同地方也有明顯差異，如我國(guó)南部人和豬以HEV-4b亞型為主，而我國(guó)東部以HEV-4a亞型為主[30]，本研究中來(lái)自四川藏豬的68株HEV均為4型，且主要為4a型，與該研究結(jié)果不一致，可能是由于地域差異。已有研究表明人HEV-4毒株的基因組序列與從同一地理區(qū)域獲得的豬HEV-4毒株的基因組序列密切相關(guān)[15,31]，而從22個(gè)豬場(chǎng)采集的樣本結(jié)果顯示主要為4a型，說(shuō)明該基因型主要由其他地區(qū)傳給藏豬，該病原已在當(dāng)?shù)夭刎i群中形成流行。為進(jìn)一步分析其遺傳演化，本研究通過(guò)BEAST v1.8.0軟件對(duì)87條(其中包括本研究中分別從22個(gè)豬場(chǎng)各挑選1株典型毒株的ORF2部分片段)確定采樣時(shí)間的HEV ORF2部分片段進(jìn)行分歧時(shí)間的估算結(jié)果分析顯示，四川藏豬的HEV4型毒株進(jìn)化晚于世界各地毒株，說(shuō)明藏豬HEV可能是由其他地區(qū)豬傳染的，這種現(xiàn)象的形成可能是由于藏豬之間的交配導(dǎo)致豬群之間發(fā)生交叉感染。

HEV的重組事件鮮有報(bào)道，但HEV-4a的重組事件卻經(jīng)常出現(xiàn)，并且在病毒進(jìn)化中發(fā)揮了重要作用，已有研究證明人和豬HEV毒株之間可能發(fā)生重組，存在雙重組事件，在HEV的ORF2區(qū)域內(nèi)可能發(fā)生重組事件[32],另一項(xiàng)研究也表明，病毒在編碼非結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)蛋白的基因組連接處重組，創(chuàng)建新的病毒家族，導(dǎo)致人畜共患新型病原的產(chǎn)生(HEV、星狀病毒)[33]。本研究共獲得了3株HEV全基因組，在四川藏豬中鑒定出1株重組HEV-4a毒株：SWU/301/2019。SWU/301/2019重組發(fā)生在ORF1區(qū)域內(nèi)，說(shuō)明HEV ORF1區(qū)域也有可能發(fā)生重組，產(chǎn)生新的毒株。該重組事件發(fā)生在藏豬和人HEV毒株之間，表明藏豬和人之間傳播HEV的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

本研究不僅表明了四川藏豬源HEV是由其他地區(qū)豬傳染給四川地區(qū)藏豬，同時(shí)還表明了藏豬源的HEV毒株在不斷進(jìn)化，毒力有逐漸增強(qiáng)傾向。感染人和動(dòng)物的HEV 4型毒株為當(dāng)?shù)刂饕餍卸局昃哂袧撛诘谋┌l(fā)風(fēng)險(xiǎn)，因此應(yīng)重視HEV的流行，加強(qiáng)對(duì)四川藏豬HEV的監(jiān)測(cè)。

4 結(jié) 論

本研究對(duì)采自四川甘孜藏族自治州和阿壩藏族自治州的22個(gè)豬場(chǎng)332份藏豬糞便樣本進(jìn)行HEV檢測(cè)；并對(duì)全部樣本進(jìn)行了ORF2分型以及3份典型陽(yáng)性樣本進(jìn)行了全基因組序列擴(kuò)增分析；通過(guò)重組分析發(fā)現(xiàn)SWU/301/2019和SWU/31-12/2018有重組現(xiàn)象；遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)藏豬HEV可能是由其他地區(qū)感染豬群傳染的。