賈艷艷，趙瑩瑩，余祖華，何 雷，廖成水，李 靜，郁 川，張春杰*，李銀聚

(1.河南科技大學(xué)動(dòng)物疫病與公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，洛陽(yáng) 471000；2.洛陽(yáng)市活載體生物材料與動(dòng)物疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，洛陽(yáng) 471000)

自噬(autophagy)是一種高度保守性的細(xì)胞內(nèi)在機(jī)制[1]。當(dāng)細(xì)胞處于低氧、低營(yíng)養(yǎng)、低能量等惡劣條件時(shí)，細(xì)胞自動(dòng)激活自噬機(jī)制，通過(guò)調(diào)控多種自噬相關(guān)蛋白ATG和溶酶體產(chǎn)生消化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，消化自身內(nèi)部衰老、病變的細(xì)胞器，以此維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[2-3]。研究表明，在正常細(xì)胞中，自噬能夠通過(guò)對(duì)線粒體的穩(wěn)態(tài)性轉(zhuǎn)變和蛋白聚合物的清除來(lái)實(shí)現(xiàn)其抗腫瘤功能，而自噬基因的缺失會(huì)導(dǎo)致線粒體功能障礙，增加細(xì)胞的氧化性應(yīng)激，最終破壞染色體的穩(wěn)定性而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[4-5]。因此在腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，自噬具有促進(jìn)和抑制腫瘤的雙重作用，已成為生物醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)[6]。

自噬蛋白Beclin-1是酵母ATG6的同源基因，主要包含BH3(Bcl-2-homology-3)、卷曲螺旋域(CCD)和保守進(jìn)化域(ECD)等結(jié)構(gòu)域，其與Ⅲ型磷脂酰肌醇-3-磷酸酯酶(PIK3C3)形成催化核心區(qū)，調(diào)節(jié)其他蛋白在自噬前體結(jié)構(gòu)中的定位，從而調(diào)控自噬活性[7-8]。Beclin-1除了作為自噬核心復(fù)合物關(guān)鍵蛋白，且在多種腫瘤組織低表達(dá)，被認(rèn)為可能是潛在的抑癌基因[9]。但也有報(bào)道Beclin-1基因敲除可抑制骨肉瘤細(xì)胞的自噬活性，并降低骨肉瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，可作為一個(gè)提高抗癌藥物療效的潛在靶點(diǎn)[10]，提示Beclin-1基因在腫瘤生物學(xué)中有著復(fù)雜且重要的作用。目前，國(guó)內(nèi)沒(méi)有關(guān)于敲除Beclin-1基因的小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16F10株的報(bào)道，因此，本研究以小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16F10為研究對(duì)象，利用RNAi技術(shù)構(gòu)建沉默Beclin-1基因的腫瘤細(xì)胞系，為分析Beclin-1基因、自噬與腫瘤三者關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 生物材料及試劑 pMD2G、pSPAX2和穿梭質(zhì)粒[攜帶目的基因或者shRNA(short hairpin RNA, shRNA)]購(gòu)自漢恒生物；大腸桿菌DH5α、293T細(xì)胞由河南科技大學(xué)動(dòng)物疫病與公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室保存；B16F10細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫(kù)。

DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、LipofiterTM購(gòu)自Gibco公司，限制性內(nèi)切酶、T4連接酶購(gòu)自Fermentas公司，puromycin購(gòu)自Sigma公司，SYBR Green Master Mix購(gòu)自TaKaRa公司，LC3多抗、RFP標(biāo)記Beclin-1兔單克隆抗體和HRP標(biāo)記羊抗兔IgG購(gòu)自Proteintech公司。

1.1.2 主要儀器 PCR儀、蛋白質(zhì)電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，臺(tái)式冷凍小離心機(jī)FRESCO 21購(gòu)自Thermo公司，超聲波裂解儀購(gòu)自Sonics & Materials公司，轉(zhuǎn)印儀購(gòu)自Amer Sham公司。熒光定量PCR儀購(gòu)自Roche公司，倒置熒光顯微鏡購(gòu)自德國(guó)徠卡公司。

1.2 shRNA的設(shè)計(jì)與合成

針對(duì)m-Beclin-1參考序列，根據(jù)RNAi序列的設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)并合成m-Beclin-1基因特異性siRNA靶點(diǎn)，序列如表1所示，以上shRNA由北京六合華大基因科技有限公司合成。

表1 shRNA序列

1.3 m-Beclin-1-shRNA慢病毒載體的構(gòu)建、包裝和滴度測(cè)定

經(jīng)預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)shRNA1的干擾效果最好，將合成的shRNA1 DNA單鏈退火形成雙鏈，連接到慢病毒表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α，挑取陽(yáng)性克隆測(cè)序。提取測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，與pSPAX2和pMD2G共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，利用超速離心機(jī)純化濃縮病毒，并進(jìn)行滴度測(cè)定。

1.4 Beclin-1干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建與篩選

將慢病毒以MOI值為1、3、10感染B16F10細(xì)胞，感染48 h后觀察細(xì)胞熒光情況，摸索慢病毒的最佳MOI值。

將B16F10細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板，待細(xì)胞匯合率約為60%，更換含puromycin的培養(yǎng)基，設(shè)定puromycin濃度梯度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μg·mL-1，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。2～3 d更換培養(yǎng)基，并保持puromycin濃度不變，觀察細(xì)胞的死亡情況，選取能夠殺死全部細(xì)胞的最低濃度為最佳細(xì)胞篩選濃度。

將過(guò)夜培養(yǎng)的B16F10細(xì)胞棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，添加5 μg·mL-1的助感染試劑polybrene(hexadimethrine bromide，聚凝胺)后，將慢病毒以最佳MOI值感染B16F10細(xì)胞，用最佳細(xì)胞篩選濃度的 puromycin進(jìn)行篩選培養(yǎng)，每48 h更換含puromycin培養(yǎng)基，待長(zhǎng)出單克隆細(xì)胞，挑出細(xì)胞團(tuán)，采用有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性孔細(xì)胞進(jìn)行亞克隆，重復(fù)篩選3～5次，直至獲得穩(wěn)定沉默Beclin-1基因的小鼠黑色素瘤細(xì)胞株B16F10-Beclin-1-shRNA1。

1.5 qPCR檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的干擾效果

抽提穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的總RNA，進(jìn)行cDNA的合成及純化，最后進(jìn)行Real-time PCR分析，具體的反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 s，95 ℃變性5 s，58 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，39個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后分析Beclin-1 mRNA水平的變化。m-Beclin-1基因的PCR引物序列見(jiàn)表2。

表2 引物序列

1.6 熒光顯微鏡觀察穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系Beclin-1蛋白的表達(dá)情況

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，消化后制備成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液滴加至12孔板內(nèi)爬片，待細(xì)胞貼壁后，固定爬片、RFP標(biāo)記Beclin-1兔單抗和HRP標(biāo)記羊抗兔IgG孵育，DAPI避光孵育，封片后在熒光顯微鏡下采集圖像。

1.7 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系自噬標(biāo)志物L(fēng)C3蛋白表達(dá)情況的測(cè)定

提取穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后用脫脂牛奶進(jìn)行封閉過(guò)夜，次日與GAPDH一抗(1∶1 000稀釋)、LC3一抗(1∶1 000稀釋)37 ℃ 孵育2～3 h，HRP標(biāo)記二抗(1∶3 000稀釋)孵育1 h，化學(xué)發(fā)光顯色。

1.8 透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)自噬小體的形成

將狀態(tài)良好的B16F10細(xì)胞棄掉培養(yǎng)基，更換含40 nmol·L-1的自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(RAPA)的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3 h，消化收集細(xì)胞，加入戊二醛溶液固定過(guò)夜。次日，漂洗4次，1%鋨酸溶液固定1.5 h。漂洗4次，丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂浸透過(guò)夜。浸透后的樣本放入包埋膠囊的純環(huán)氧樹脂中，烤箱聚合。超薄切片，醋酸鈾和枸櫞酸鉛各染色15 min，透射電鏡觀察并拍照。

1.9 細(xì)胞活力的測(cè)定

將細(xì)胞分別以1.0×104cells·孔-1接種至96孔板，每組細(xì)胞重復(fù)3次，待長(zhǎng)成單層細(xì)胞后開(kāi)始計(jì)時(shí)，于0、6、12、18、24、36、48、60、72、84、96和120 h后，每組孔內(nèi)加入10 μL CCK-8溶液，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育，2 h后終止顯色，利用紫外分光光度記測(cè)定450 nm波長(zhǎng)下各孔吸光度數(shù)值，分析細(xì)胞活力狀態(tài)。

1.10 統(tǒng)計(jì)與分析

使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，根據(jù)數(shù)據(jù)類型選擇單因素方差分析或t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較(*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001)，應(yīng)用GradPrism5.0軟件作圖。

2 結(jié) 果

2.1 m-Beclin-1-shRNA慢病毒載體的測(cè)序鑒定

在含有抗性的LB平板上挑取轉(zhuǎn)化后的重組質(zhì)粒菌，于37 ℃，250 r·min-1條件下?lián)u菌14 h后，將菌液送公司測(cè)序。如圖1所示，測(cè)序結(jié)果(命名為NoName，見(jiàn)圖1)與目標(biāo)序列(Q1897-2)比對(duì)后，與預(yù)期相符，表明成功構(gòu)建了慢病毒載體m-Beclin-1-shRNA。

圖1 序列比對(duì)

2.2 慢病毒包裝及病毒滴度的檢測(cè)

利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法，將構(gòu)建好的包裝載體瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞系而產(chǎn)生重組慢病毒。隨后將病毒稀釋感染細(xì)胞，通過(guò)稀釋計(jì)數(shù)法計(jì)算出病毒滴度為1×108TU·mL-1。

2.3 Beclin-1干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的篩選

經(jīng)過(guò)puromycin濃度梯度摸索，能夠殺死B16F10空白細(xì)胞的最低puromycin濃度為1.5 μg·mL-1。將慢病毒以不同MOI值感染B16F10細(xì)胞，選擇感染效率高且細(xì)胞狀態(tài)較好的孔，對(duì)應(yīng)為最佳MOI值，48 h后觀察發(fā)現(xiàn)MOI值為1、3、10熒光比例分別為20%、40%、70%左右，本次試驗(yàn)中慢病毒最佳MOI值為10。

將慢病毒以MOI為10感染B16F10細(xì)胞，在puromycin加壓篩選下，利用有限稀釋法最終獲得干擾Beclin-1表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系B16F10-m-Beclin-1-shRNA1，熒光顯微鏡下觀察大多數(shù)細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，見(jiàn)圖2。

A.B16F10細(xì)胞；B.B16F10-m-Beclin-1-shRNA1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系

2.4 m-Beclin-1基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平的測(cè)定

經(jīng)TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，利用qPCR檢測(cè)mRNA相對(duì)表達(dá)水平。如圖3所示，m-Beclin-1-shRNA1在B16F10細(xì)胞中有干擾下調(diào)作用，與對(duì)照細(xì)胞株相比，m-Beclin-1-shRNA1抑制率為75%(P<0.01)。

圖3 Real-time PCR檢測(cè) Beclin-1基因mRNA的表達(dá)

2.5 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系Beclin-1蛋白的表達(dá)量分析

利用Beclin-1熒光抗體檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系Beclin-1蛋白的表達(dá)情況，熒光顯微鏡觀察兩組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。如圖4所示，在同一激發(fā)光強(qiáng)度下，B16F10-con-sh細(xì)胞內(nèi)Beclin-1蛋白熒光強(qiáng)度明顯高于m-Beclin-1-shRNA1細(xì)胞，結(jié)果表明穩(wěn)定沉默Beclin-1 B16F10細(xì)胞系的Beclin-1蛋白表達(dá)水平明顯降低。

圖4 免疫熒光分析Beclin-1蛋白的表達(dá)(40×)

2.6 Beclin-1沉默對(duì)自噬標(biāo)志物蛋白LC3表達(dá)情況的影響

提取B16F10-m-Beclin-1-shRNA1和B16F10-con-sh細(xì)胞總蛋白，利用Western blot方法分析B16F10細(xì)胞內(nèi)自噬蛋白LC3的表達(dá)情況。如圖5所示，與對(duì)照組細(xì)胞相比，B16F10-m-Beclin-1-shRNA1細(xì)胞系中LC3-Ⅱ的蛋白表達(dá)水平顯著降低，降低了61.34%(P<0.01)，LC3-Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著降低，降低比例為117.93%(P<0.01)，結(jié)果表明沉默Beclin-1基因后B16F10細(xì)胞自噬被顯著抑制。

A.蛋白電泳圖(1.正常對(duì)照細(xì)胞 B16F10-con-sh；2.穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系B16F10-m-Beclin-1-shRNA1)；B.LC3蛋白相對(duì)表達(dá)量

2.7 透射電鏡觀察B16F10細(xì)胞內(nèi)的自噬現(xiàn)象

收集細(xì)胞、固定、制樣后在透射電鏡下觀察，RAPA刺激后的B16F10-con-sh對(duì)照細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)中可見(jiàn)多個(gè)散在的雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體及內(nèi)含細(xì)胞器的空泡狀自噬溶酶體，細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞膜清晰可見(jiàn)，然而RAPA刺激后的B16F10-m-Beclin-1-shRNA1細(xì)胞中自噬小體較少。

A.正常對(duì)照細(xì)胞B16F10-con-sh；B.穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系B16F10-m-Beclin-1-shRNA1；N.細(xì)胞核；M.線粒體；Ass.自噬溶酶體

2.8 Beclin-1沉默對(duì)細(xì)胞活力的影響

利用CCK-8方法測(cè)定B16F10-m-Beclin-1-shRNA1和B16F10-con-sh細(xì)胞在不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)的OD值，通過(guò)公式計(jì)算出細(xì)胞活力。如圖7所示，B16F10-m-Beclin-1-shRNA1組細(xì)胞活力顯著低于對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖7 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活力

3 討 論

自噬是一種進(jìn)化上保守的溶酶體降解途徑，不僅負(fù)責(zé)細(xì)胞質(zhì)成分的更新，還能夠?qū)垢鞣N病原微生物的感染[11]。Beclin-1是自噬相關(guān)基因，其表達(dá)水平與自噬水平息息相關(guān)，且研究證實(shí)其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色[12-13]。本研究通過(guò)RNAi技術(shù)成功構(gòu)建了穩(wěn)定沉默Beclin-l的B16F10細(xì)胞系，結(jié)果顯示該細(xì)胞系Beclin-l基因的 mRNA和蛋白表達(dá)得到有效抑制，并且干預(yù)Beclin-1基因表達(dá)能夠抑制B16F10細(xì)胞自噬的發(fā)生，加速B16F10細(xì)胞死亡，提示自噬活性與B16F10腫瘤細(xì)胞增殖有關(guān)。

RNAi能夠特異性沉默靶基因，主要是通過(guò)短雙鏈結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)靶基因mRNA特異性降解[14-15]。shRNA(short hairpin RNA, shRNA)是一段具有緊密發(fā)卡環(huán)(tight hairpin turn)的RNA序列，常被用于RNAi沉默靶基因的表達(dá)[16]。本研究根據(jù)shRNA設(shè)計(jì)原則，同時(shí)設(shè)計(jì)了針對(duì)小鼠Beclin-1基因的3個(gè)慢病毒shRNA，根據(jù)敲低效果，選取沉默效率最高的一組用于后續(xù)試驗(yàn)，提高了試驗(yàn)效率。利用RNAi技術(shù)，選擇慢病毒作為載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，慢病毒比腺病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒有較多優(yōu)勢(shì)，它能夠?qū)⒆陨砘蛘系剿拗骰蚪M中，且整合位點(diǎn)處于轉(zhuǎn)錄相對(duì)活躍的區(qū)域，從而獲得更加高效表達(dá)或抑制外源基因的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系[17]。且本研究所用的穿梭質(zhì)粒攜帶有GFP報(bào)告基因，便于觀察轉(zhuǎn)染效率。本研究將Beclin-1干擾載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察到大量的綠色熒光，顯示慢病毒包裝成功，病毒滴度為1×108TU·mL-1。本試驗(yàn)為促進(jìn)病毒的感染效率，在感染過(guò)程中降低培養(yǎng)基中血清的濃度，同時(shí)添加5 μg·mL-1的助感染試劑polybrene，polybrene相當(dāng)于破膜劑，只有細(xì)胞膜破了，病毒才有機(jī)會(huì)進(jìn)入細(xì)胞，研究報(bào)道polybrene顯著提高重組腺病毒感染細(xì)胞的效率，且在一定濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性[18]。以上研究為下一步篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系奠定基礎(chǔ)。

構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系時(shí)常采用一些抗生素進(jìn)行篩選，如G418、潮霉素B或puromycin，在篩選前需要先通過(guò)抗生素濃度梯度試驗(yàn)，選擇殺死全部細(xì)胞的最低濃度為適合該類細(xì)胞的最佳篩選濃度。用G418或潮霉素B，選用在5 d左右出現(xiàn)細(xì)胞大批死亡，2周全部死亡的濃度作為篩選濃度。對(duì)于puromycin，通常采用在3～4 d殺死全部細(xì)胞的濃度。本試驗(yàn)中慢病毒載體上帶有puromycin抗性基因，細(xì)胞感染病毒后則會(huì)成功獲得puromycin抗性，因此，本研究在穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系篩選前，將puromycin濃度梯度設(shè)置為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μg·mL-1處理B16F10細(xì)胞，72 h后觀察細(xì)胞的死亡情況，最后確定能夠殺死B16F10空白細(xì)胞的最低puromycin濃度為1.5 μg·mL-1。經(jīng)過(guò)puromycin加壓篩選成功獲得干擾Beclin-1表達(dá)的B16F10穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。

Beclin-1是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物自噬相關(guān)基因，主要通過(guò)與PI3K中的亞基VPS34及其調(diào)控成分VPS15型組成Ⅲ型磷脂酰肌醇三磷酸激酶復(fù)合物，誘導(dǎo)吞噬泡形成，在自噬體的形成與成熟兩個(gè)階段發(fā)揮作用[19-20]。Western blot結(jié)果表明，與對(duì)照組細(xì)胞相比，B16F10-m-Beclin-1-shRNA1細(xì)胞組中LC3-Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著降低；電鏡結(jié)果顯示，即使在自噬誘導(dǎo)劑RAPA刺激下B16F10-m-Beclin-1-shRNA1細(xì)胞內(nèi)自噬小體形成較少，以上結(jié)果充分說(shuō)明沉默Beclin-1表達(dá)能夠有效抑制B16F10細(xì)胞自噬的發(fā)生。這與張松[21]報(bào)道沉默Beclin-1基因可以降低前列腺增生上皮細(xì)胞BPH-1的自噬活性相一致。以上結(jié)果為研究Beclin-l基因功能與自噬關(guān)系提供重要試驗(yàn)材料。

越來(lái)越多研究表明，除調(diào)控自噬外，Beclin-1還可通過(guò)非自噬依賴性通路影響腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展[22]。本研究中CCK-8試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，干預(yù)Beclin-1表達(dá)后的B16F10細(xì)胞活力與對(duì)照細(xì)胞相比顯著下降，說(shuō)明Beclin-1表達(dá)下降能夠促進(jìn)B16F10細(xì)胞死亡。Ye等[23]發(fā)現(xiàn)，Beclin-1基因敲除能通過(guò)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶家族MMP-9蛋白抑制尤文肉瘤細(xì)胞SK-ES-1的增殖、侵襲和遷移。然而一些學(xué)者研究表明Beclin-1在肝癌等大多數(shù)腫瘤組織中表達(dá)量降低，且Beclin-1表達(dá)下降直接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖活性[24]，以上結(jié)果的不一致推測(cè)可能與Beclin-1在調(diào)控腫瘤作用中存在階段性有關(guān)。

本研究利用慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)構(gòu)建了穩(wěn)定沉默Beclin-1基因B16F10細(xì)胞系，不僅可以有效沉默自噬基因Beclin-1的表達(dá)，而且能夠降低B16F10細(xì)胞自噬活性，加速B16F10腫瘤細(xì)胞死亡。由于自噬的復(fù)雜性和階段性，至于沉默Beclin-1基因激活哪些信號(hào)通路，從而促進(jìn)B16F10腫瘤細(xì)胞死亡，這需要在后續(xù)試驗(yàn)中進(jìn)行探索。以上研究為探討B(tài)eclin-1基因在抗小鼠黑色素瘤中的作用機(jī)制奠定重要物質(zhì)基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

利用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定沉默Beclin-l基因的B16F10小鼠黑色素瘤細(xì)胞系，結(jié)果顯示，該細(xì)胞系Beclin-l基因的 mRNA和蛋白表達(dá)得到有效抑制，并且干預(yù)Beclin-1基因表達(dá)能夠抑制B16F10細(xì)胞自噬的發(fā)生，加速B16F10細(xì)胞死亡，提示自噬活性與B16F10腫瘤細(xì)胞增殖密切相關(guān)，這為探討B(tài)eclin-1基因功能及自噬在抗腫瘤中的作用奠定重要基礎(chǔ)。