孫 歡，孫克佳，姜曉龍，劉愛菊，馬曉菲，韓紅葉，姚大為，馬 毅*，田樹軍，3*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，保定071001；2.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津300381；3.河北省牛羊胚胎技術(shù)創(chuàng)新中心，保定071001)

脫氧雪腐烯醇(deoxynivalenol，DON)是一種常見的霉菌毒素，普遍存在于玉米、小麥和大麥等谷物的秸稈與籽實(shí)中。因 DON 的理化性質(zhì)十分穩(wěn)定，在飼料加工過程中很難將其破壞，且分子量較小，可快速穿越腸壁進(jìn)入血液循環(huán)并穿越血腦屏障，所以當(dāng)按每公斤體重給小鼠灌服25 mg的DON時(shí)，在5 min后便可在大腦內(nèi)檢測到(0.8±0.1)μg·g-1DON[1]。當(dāng)畜禽采食被DON污染的飼料后，其肉、奶、蛋中亦可檢測到DON，雌性動物則出現(xiàn)卵泡退化、發(fā)情異常、流產(chǎn)、不孕等癥狀，嚴(yán)重威脅人類和動物健康[2]。

有研究發(fā)現(xiàn)，DON可在牛卵泡液中發(fā)生富集，牛卵泡液中的DON濃度與血漿中的DON濃度呈正相關(guān)(y=-0.71+1.50x，y為卵泡液中 DON 濃度，x為血漿中 DON 濃度)，引起卵泡中孕酮和雌二醇等生殖激素分泌紊亂[3]。眾所周知，卵泡是卵母細(xì)胞發(fā)育成熟的重要場所，并受卵泡液中生殖激素的調(diào)控。然而，DON究竟如何影響牛卵母細(xì)胞的發(fā)育成熟及其作用機(jī)制，目前尚不清楚。

卵母細(xì)胞成熟發(fā)育與包裹其外周的顆粒細(xì)胞存在復(fù)雜的聯(lián)系，顆粒細(xì)胞對卵母細(xì)胞起著營養(yǎng)支持及信號傳導(dǎo)等作用，對卵母細(xì)胞正常代謝及后續(xù)受精和胚胎發(fā)育能力都有著關(guān)鍵性的影響。顆粒細(xì)胞擴(kuò)展程度越高越有利于卵母細(xì)胞與外界進(jìn)行營養(yǎng)及信息交換，因此，卵丘顆粒細(xì)胞擴(kuò)展程度可作為評判卵母細(xì)胞體外成熟效果的一個(gè)重要指標(biāo)[4]。同時(shí)，在卵母細(xì)胞逐漸成熟的過程中，其胞質(zhì)內(nèi)部的諸多細(xì)胞器也會發(fā)生明顯的變化，例如排出第一極體可作為卵母細(xì)胞的細(xì)胞核成熟的標(biāo)志，細(xì)胞質(zhì)成熟則可通過線粒體分布狀態(tài)等指標(biāo)進(jìn)行評價(jià)。另外，活性氧(ROS)作為卵泡中重要的信號分子，在機(jī)體抗氧化系統(tǒng)參與下保持平衡，對保障卵母細(xì)胞成熟及其正常發(fā)育至關(guān)重要。一旦細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)不足以對抗應(yīng)激所產(chǎn)生的ROS，細(xì)胞核中染色體就會受到不可逆損傷，使卵母細(xì)胞減數(shù)分裂無法正常進(jìn)行。而機(jī)體抗氧化系統(tǒng)對抗ROS的分子機(jī)制則是通過上調(diào)過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等相關(guān)基因表達(dá)，并通過轉(zhuǎn)錄和翻譯合成CAT、GPx等相應(yīng)的抗氧化酶來實(shí)現(xiàn)[5]。

因此，為探究DON對牛卵母細(xì)胞體外成熟發(fā)育的影響及其作用機(jī)制，本試驗(yàn)首先通過在牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液中添加不同濃度的 DON，并檢測卵丘細(xì)胞擴(kuò)展程度及第一極體排出率，構(gòu)建DON毒性模型；然后，借助此模型研究DON對卵母細(xì)胞的線粒體分布及后續(xù)受精卵裂率、囊胚發(fā)育率的影響，探究DON對牛卵母細(xì)胞體外成熟及后續(xù)發(fā)育能力的影響；通過檢測體外成熟卵母細(xì)胞內(nèi)的ROS、GSH水平和抗氧化基因CAT、GPx4的mRNA表達(dá)量，揭示DON影響牛卵母細(xì)胞體外發(fā)育能力的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

卵巢取自屠宰場，置于盛有含80 IU·dL-1雙抗的37 ℃生理鹽水(經(jīng)下簡稱“生理鹽水”)的保溫杯中，于4 h內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。用新鮮生理鹽水清洗卵巢1遍，用滅菌剪刀去掉卵巢系膜，隨后用75%酒精快速清洗卵巢1遍，再用新鮮生理鹽水清洗卵巢2遍。

1.2 主要儀器與試劑

主要儀器：CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)、體視顯微鏡(日本Olympus公司)、熒光顯微鏡(日本Nikon公司)。主要試劑：TCM199(美國Gibco公司)、胎牛血清(美國Gibco公司)、2’,7’-二氯熒光素二乙酸酯(美國 Invitrogen 公司)、ThiolTrackerTMViolet(美國Invitrogen公司)，丙酮酸鈉、Hepes-sodium、M199、L-谷氨酰胺、碳酸氫鈉、葡萄糖、肝素、青霉素、鏈霉素、DON、FBS、FSH、E2、LH、HP、EGF、IGF、PS、EAA、NEAA、BSA、礦物質(zhì)油、PBS、PVA 等其他化學(xué)藥品均購自 Sigma 公司。

1.3 主要藥品配制

卵母細(xì)胞成熟液(IVM液)為含10% FBS、0.01 IU·mL-1FSH、0.01 IU·mL-1LH、1 μg·mL-1E2、10 μg·mL-1肝素、50 ng·mL-1EGF、100 ng·mL-1IGF的TCM199(1×)。體外受精液(IVF液)為含6.55 mg·mL-1NaCl、0.23 mg·mL-1KCl、0.33 mg·mL-1CaCl2·2H2O、1.06 mg·mL-1MgCl2·6H2O、2.6 mg·mL-1NaHCO3、0.137 5 mg·mL-1丙酮酸鈉、0.01 mg·mL-1肝素、2 μL·mL-1酚紅的水溶液。體外胚胎發(fā)育培養(yǎng)液(IVC液)為含0.23 mg·mL-1KCl、2.2 mg·mL-1NaCO3、0.162 6 mg·mL-1MgCl2·6H2O、0.161 9 mg·mL-1KH2PO4、0.044 mg·mL-1丙酮酸鈉、0.27 mg·mL-1葡萄糖、2 μL·mL-1酚紅的水溶液。終止液：含10% FBS的TCM199液。

1.4 卵母細(xì)胞的采集、體外成熟培養(yǎng)及成熟效果評價(jià)

用一次性注射器吸取卵巢上3～5 mm卵泡中的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，將撿出的COCs在洗卵液中清洗2遍，選擇外周包裹3層以上卵丘細(xì)胞且胞質(zhì)均勻的COCs，在IVM液中清洗3遍，隨后將其轉(zhuǎn)入到含 DON 濃度分別為0、50、250、500、1 000 ng·mL-1的 IVM液的四孔板中，每孔40～50枚細(xì)胞，置于38.5 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中成熟培養(yǎng)22 h，在顯微鏡下對 COCs 卵丘擴(kuò)展情況進(jìn)行評級，并計(jì)算卵丘擴(kuò)展指數(shù)。待COCs卵丘擴(kuò)展效果評價(jià)結(jié)束后，用濃度為0.1%的透明質(zhì)酸酶除去卵母細(xì)胞外的所有顆粒細(xì)胞，用撿卵針輕輕撥動卵母細(xì)胞，觀察卵母細(xì)胞第一極體是否排出，并計(jì)算各組的第一極體排出率。

將卵丘擴(kuò)展分為 0～4 五個(gè)等級；0 級代表卵丘無擴(kuò)展，計(jì)為0分；1 級代表只有卵丘最外周 1～2 層卵丘擴(kuò)展，計(jì)為1分；2 級代表有2層以上卵丘細(xì)胞已擴(kuò)展且呈放射狀，計(jì)為2分；3 級代表除緊挨卵母細(xì)胞最內(nèi)層放射冠外其他卵丘均完成擴(kuò)展，計(jì)為3分；4 級代表所有卵丘細(xì)胞均擴(kuò)展，計(jì)為4分。卵丘擴(kuò)展指數(shù)=組內(nèi)COCs卵丘擴(kuò)展情況分值總和/組內(nèi)COCs總數(shù)，卵丘擴(kuò)展指數(shù)值越大表示卵丘擴(kuò)展效果越好。

1.5 體外受精及早期胚胎體外發(fā)育培養(yǎng)

將從液氮罐中取出的凍精迅速投入到37 ℃溫水中進(jìn)行解凍，隨后用洗精液充分洗滌精子并調(diào)整精子密度為1×106個(gè)·mL-1。用移液槍將50 μL的精子加入到去除外周卵丘的卵母細(xì)胞的50 μL受精滴中，每個(gè)微滴中含15～20枚卵母細(xì)胞。精卵共孵育16 h后用撿卵針輔助去除受精卵外所有的顆粒細(xì)胞，并將其轉(zhuǎn)入到前期胚胎培養(yǎng)液中放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于受精后48 h統(tǒng)計(jì)其卵裂率，隨后將受精卵由前期培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至后期培養(yǎng)液中，每隔48 h進(jìn)行半量換液，于受精第7天觀察囊胚數(shù)并計(jì)算囊胚率。

1.6 卵母細(xì)胞內(nèi)線粒體分布檢測

用濃度為0.1%透明質(zhì)酸酶消化除掉成熟培養(yǎng)22 h后胞質(zhì)均勻的卵母細(xì)胞外所有顆粒細(xì)胞，隨后將卵母細(xì)胞置于100 nmol·L-1的Mito Tracker Red CMXRos 中避光孵育 20 min，接著將各組卵母細(xì)胞移入到DPBS中洗滌3次，隨后把卵母細(xì)胞在已預(yù)熱的4%多聚甲醛溶液中固定15 min，在DPBS溶液中漂洗10 min后進(jìn)行壓片處理,將樣品置于熒光顯微鏡下觀察各組卵母細(xì)胞內(nèi)線粒體的分布情況，整個(gè)試驗(yàn)過程避光操作。其中，將卵母細(xì)胞內(nèi)線粒體分布分為兩種類型，即卵母細(xì)胞內(nèi)線粒體均勻分布和不均勻分布。均勻分布是指線粒體均勻分布于整個(gè)卵母細(xì)胞胞質(zhì)中，不均勻分布是指卵母細(xì)胞胞質(zhì)中存在沒有線粒體分布的區(qū)域。

1.7 ROS及GSH含量檢測

用濃度為0.1%透明質(zhì)酸酶消化掉成熟培養(yǎng)22 h 的卵母細(xì)胞外的顆粒細(xì)胞，隨后將卵母細(xì)胞分別置于2’,7’-二氯熒光素二乙酸酯(2’,7’-dichloro-fluorescin diacetate, DCHFDA)及ThiolTrackerTMViolet(Glutathione Detection Reagent)染料中進(jìn)行避光孵育30 min，隨后各組卵母細(xì)胞移入到0.1% PVA-DPBA中洗滌3次。在載玻片上點(diǎn)一滴DPBS，每次將10～15枚已染色處理的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到載玻片上的微滴中，調(diào)整好曝光時(shí)間與參數(shù)，在熒光顯微鏡下用NIS Elements f軟件對已進(jìn)行染色的卵母細(xì)胞進(jìn)行拍照，分別用470 nm與380 nm激發(fā)波長進(jìn)行熒光激發(fā)，整個(gè)操作均在避光條件下進(jìn)行。隨后用Image J軟件對細(xì)胞內(nèi)ROS與GSH水平進(jìn)行量化統(tǒng)計(jì)。

1.8 CAT與GPx4基因檢測

1.8.1 樣品收集 用濃度為0.1%透明質(zhì)酸酶除去體外成熟培養(yǎng)22 h卵母細(xì)胞外的顆粒細(xì)胞，隨后將裸卵置于終止液中終止消化，隨后在DPBS中漂洗5 min，用撿卵管將處理好的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至200 μL離心管中進(jìn)行凍存處理，每次每組收集卵母細(xì)胞40～50個(gè)。

1.8.2 引物設(shè)計(jì) 試驗(yàn)共選取3個(gè)基因，包括1個(gè) 內(nèi)參基因GAPDH和2個(gè)卵母細(xì)胞抗氧化應(yīng)急相關(guān)基因CAT與GPx4，基因引物參照NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的NM_001034034.2、NM_001035386.2和NM_001034034.2，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列和擴(kuò)增目標(biāo)片段的大小如表1所示。

表1 引物序列及擴(kuò)增目標(biāo)片段的大小

1.8.3 cDNA制備 卵母細(xì)胞 cDNA 的制備采用 Cells-to-cDNA(Invitrogen，美國)試劑盒進(jìn)行，具體操作步驟為：①裂解卵母細(xì)胞，即將適量 Cell Lysis II Buffer 加入收集卵母細(xì)胞樣品的離心管中，然后置于 PCR 儀中 75 ℃ 加熱 l0 min；②去除基因組 DNA，即加入1/50 Cell Lysis II Buffer 體積的 DNase I，PCR 儀中 37 ℃ 加熱 15 min，然后75 ℃加熱 5 min 滅活 DNase I；③RNA 合成，即取10 μL細(xì)胞裂解產(chǎn)物，加入4 μL dNTP Mix 和 2 μL Oligo(dT)18 primers 后混勻，PCR儀中 70 ℃加熱3 min，結(jié)束后取出立即置于冰上靜置 1 min；④cDNA 合成，即向第三步的產(chǎn)物中加入2 μL 10×RT buffer、1 μL M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶和1 μL RNase 抑制劑，PCR 儀中 42 ℃ 孵育 30 min，95 ℃ 加熱10 min，即可得到cDNA，于-20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8.4 熒光定量PCR檢測 以合成的cDNA為模板，根據(jù)SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ說明書，在EasyCycler 96熒光定量PCR儀上進(jìn)行分析，反應(yīng)體系為15 μL：2×TB Green premix 7.5 μL，正反引物各0.3 μL，cDNA 1 μL,ddH2O 5.9 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s、60 ℃退火延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)。采用 2-△△Ct法計(jì)算出各目的基因 mRNA 的相對表達(dá)量。

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用生物統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 21.0，運(yùn)用單因素方差分析或卡方檢驗(yàn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度DON對卵丘細(xì)胞擴(kuò)展的影響

結(jié)果如表2所示，250 ng·mL-1組卵丘擴(kuò)展指數(shù)為2.32±0.09，較對照組3.22±0.06顯著下降(P<0.05)；500和1 000 ng·mL-1組分別為1.57± 0.07和0.71±0.06，較對照組極顯著下降(P<0.01)。

表2 不同濃度DON對牛卵丘卵母細(xì)胞卵丘擴(kuò)展指數(shù)的影響

2.2 不同濃度DON對第一極體排出率的影響

如表3所示，不同濃度的DON(50、250、500、1 000 ng·mL-1)均會降低卵母細(xì)胞成熟過程中第一極體的排出率。相較于對照組，250、500 ng·mL-1的DON可顯著降低第一極體排出率(P<0.05)，1 000 ng·mL-1組則極顯著降低第一極體排出率(P<0.01)。

表3 DON對牛卵母細(xì)胞第一極體排出的影響

2.3 DON對卵母細(xì)胞體外發(fā)育潛能的影響

根據(jù)“2.1”和“2.2”的試驗(yàn)結(jié)果，本試驗(yàn)及后續(xù)試驗(yàn)選擇500 ng·mL-1DON 作為毒性模型即DON組，與對照組(0 ng·mL-1DON)相比較，探究DON 對卵母細(xì)胞體外發(fā)育潛能的影響。結(jié)果如表4所示，相較對照組，DON處理組的卵裂率與囊胚率均顯著降低(P<0.05)。

表4 DON對卵母細(xì)胞體外發(fā)育潛能的影響

2.4 DON對卵母細(xì)胞內(nèi)線粒體分布的影響

牛卵母細(xì)胞體外成熟22 h，線粒體呈均勻分布和不均勻分布的顯微鏡下明場和熒光典型圖如圖1A所示，DON對牛卵母細(xì)胞內(nèi)線粒體分布的影響結(jié)果如圖1B所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DON組線粒體均勻分布的比例較對照組顯著降低(P<0.05)。

A.卵母細(xì)胞線粒體染色圖：a、b分別代表線粒體分布均勻與不均勻的卵母細(xì)胞的顯微鏡明場圖；c、d分別代表線粒體分布均勻與不均勻的卵母細(xì)胞的顯微鏡熒光圖。B.對照組與DON組間線粒體分布均勻卵母細(xì)胞的比例圖，*表示組間差異顯著(P<0.05)，下同

2.5 DON對卵母細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

由圖2A可知，DON組的熒光強(qiáng)度高于對照組；圖2B為卵母細(xì)胞內(nèi)ROS的相對熒光強(qiáng)度量化分析結(jié)果，DON組中卵母細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著高于對照組(P<0.05)。

A.卵母細(xì)胞活性氧染色圖片：a、b分別為對照組卵母細(xì)胞的明場和熒光圖，c、d分別為 DON組的明場與熒光圖。B.對照組與DON組的卵母細(xì)胞內(nèi)ROS水平比較圖

2.6 DON對卵母細(xì)胞內(nèi)GSH水平的影響

由圖3A可知，DON 組熒光亮度低于對照組；圖3B卵母細(xì)胞內(nèi)GSH的相對熒光強(qiáng)度量化分析結(jié)果表明，DON組卵母細(xì)胞內(nèi)GSH水平顯著低于對照組(P<0.05)。

A.卵母細(xì)胞谷胱甘肽染色圖片：a、b分別為對照組的明場和熒光圖；c、d分別為DON組的明場與熒光圖。B.卵母細(xì)胞內(nèi)GSH相對熒光強(qiáng)度圖

2.7 DON 對卵母細(xì)胞內(nèi)抗氧化基因CAT、GPx4表達(dá)的影響

抗氧化基因CAT、GPx4在各組卵母細(xì)胞中的表達(dá)水平如圖4，DON組CAT、GPx4轉(zhuǎn)錄水平相較于對照組均顯著降低(P<0.05)。

圖4 DON 對卵母細(xì)胞抗氧化基因CAT與GPx4表達(dá)的影響

3 討 論

卵母細(xì)胞成熟與包裹其外周的顆粒細(xì)胞存在復(fù)雜的聯(lián)系，顆粒細(xì)胞對卵母細(xì)胞成熟起著營養(yǎng)支持及信號傳導(dǎo)等作用，對卵母細(xì)胞的正常代謝及后期的受精能力都有著關(guān)鍵性的影響。本研究結(jié)果表明，在牛卵母細(xì)胞體外成熟液中，50 ng·mL-1的DON可顯著抑制卵丘顆粒細(xì)胞的擴(kuò)展，當(dāng)DON濃度達(dá)到500 ng·mL-1時(shí)，則可極顯著抑制卵丘顆粒細(xì)胞擴(kuò)展，這與Schoevers等[6]發(fā)現(xiàn)DON抑制卵丘細(xì)胞擴(kuò)展的結(jié)論相一致。

評價(jià)卵母細(xì)胞達(dá)到細(xì)胞核成熟的依據(jù)是排出第一極體，線粒體在細(xì)胞質(zhì)中均勻分布則是判斷卵母細(xì)胞達(dá)到細(xì)胞質(zhì)成熟的重要標(biāo)志[7]。本研究證實(shí)，牛卵母細(xì)胞體外成熟液中DON濃度為250 ng·mL-1和500 ng·mL-1時(shí)會顯著降低卵母細(xì)胞體外成熟的第一極體排出率，當(dāng)DON濃度達(dá)到1 000 ng·mL-1時(shí)則極顯著降低第一極體排出率，表明當(dāng)牛卵母細(xì)胞體外成熟液中DON濃度高于250 ng·mL-1時(shí)就會抑制卵母細(xì)胞的細(xì)胞核成熟進(jìn)程；另外，本研究表明，DON濃度達(dá)到500 ng·mL-1時(shí)會顯著抑制牛卵母細(xì)胞的線粒體正常分布。綜上，以牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液中含有500 ng·mL-1的DON為毒性模型，進(jìn)一步開展DON對牛卵母細(xì)胞體外發(fā)育能力的影響及作用機(jī)制研究是可行的。

卵母細(xì)胞體外成熟將為其完成正常受精及后續(xù)胚胎發(fā)育奠定重要基礎(chǔ)。Lan等[1]的體外試驗(yàn)結(jié)果表明，1 μmol·L-1的DON可顯著降低小鼠卵母細(xì)胞的成熟率(78.69%vs.68.64%)，在其開展的體內(nèi)試驗(yàn)中，對雌性小鼠連續(xù)7 d按每公斤體重注射0.6 mg的DON后，與雄鼠進(jìn)行交配，隨后收集受精卵在體外條件下進(jìn)行成熟培養(yǎng)，結(jié)果表明，飼喂DON后的小鼠卵母細(xì)胞的卵裂率及囊胚率均顯著降低。Alm等[8]的研究同樣顯示，DON可造成GV期豬卵母細(xì)胞的退化及體外培養(yǎng)過程中成熟率的降低，本研究DON毒性處理會顯著降低牛卵母細(xì)胞的體外受精卵裂率及囊胚率，與上述試驗(yàn)結(jié)果一致。Schoevers等[6]用不同濃度的DON對豬卵母細(xì)胞進(jìn)行成熟培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中濃度0.02 μmol·L-1的DON不僅顯著降低豬卵母細(xì)胞成熟率及囊胚率，同時(shí)DON還可造成體外受精過程中多精入卵的比例，此異常受精現(xiàn)象的發(fā)生可能是囊胚率降低的因素之一。

已有研究證實(shí)，細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)處于失衡狀態(tài)會造成細(xì)胞的氧化損傷，DON毒性作用與誘導(dǎo)氧化應(yīng)激具有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性[9-11]。Yu等[12]報(bào)道了小鼠妊娠期采食含DON的飼料后，其胚胎毒性由胎盤內(nèi)ROS積累造成。Wang等[13]用含DON的飼料對雞進(jìn)行飼喂，在36 d后的血樣中發(fā)現(xiàn)，CAT等酶類抗氧化劑的活性顯著降低。Gao等[14]發(fā)現(xiàn)，DON對雄性動物的生殖系統(tǒng)具有顯著的毒性作用，雄性小鼠采食含DON的飼料后會導(dǎo)致精子畸形率增加和精子活力的降低，同時(shí)睪丸組織中ROS等水平升高，GSH等酶類抗氧化劑的活性降低。本研究發(fā)現(xiàn)，DON可造成牛卵母細(xì)胞內(nèi)ROS水平的顯著增加、GSH水平的顯著降低，進(jìn)一步證實(shí)DON毒性是通過破壞牛卵母細(xì)胞細(xì)的抗氧化系統(tǒng)平衡途徑來發(fā)揮作用的。為探究DON對牛卵母細(xì)胞的可能作用機(jī)制，本研究進(jìn)一步檢測DON處理組牛卵母細(xì)胞內(nèi)的抗氧化基因CAT、GPx4的mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其基因表達(dá)量均顯著降低。在介導(dǎo)細(xì)胞抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的keap1-Nrf2通路中，其下游調(diào)控基因CAT與GPx可轉(zhuǎn)錄翻譯生成相應(yīng)的酶，將自由基轉(zhuǎn)化生成的過氧化氫(H2O2)進(jìn)行分解，其可直接催化H2O2的氧化分解為H2O和O2，而GPx則需要在GSH的參與下將H2O2分解為對集體無害的H2O，同時(shí)GPx還能將有機(jī)過氧化物分解H2O和相應(yīng)的醇類[15]。Huang等[16]用DON濃度分別為0、300、600、900、1 200、1 500 μg·kg-1的飼料對草魚進(jìn)行了為期60 d的飼養(yǎng)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)采集的魚鰓樣品中600 μg·kg-1的DON處理組中CAT與GPx4等抗氧化基因表達(dá)量相較于對照組顯著降低，300 μg·kg-1的DON可造成組織的氧化損傷與抗氧化能力的降低。Ren等[17]向豬淋巴細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系中添加不同濃度的DON，發(fā)現(xiàn)DON可顯著或極顯著降低CAT、GPx與GSH的蛋白表達(dá)水平，證實(shí)DON可誘導(dǎo)豬淋巴細(xì)胞的氧化損傷。Hou等[18]同樣發(fā)現(xiàn)，DON可造成小鼠血清與肝內(nèi)CAT等的表達(dá)量顯著下降。上述研究結(jié)果與本研究結(jié)果一致，均顯示DON毒性作用的分子機(jī)制可能是通過降低CAT和GPx4基因表達(dá)。已有研究者發(fā)現(xiàn)，DON的羥基官能團(tuán)在代謝過程中會生成脂類，此代謝產(chǎn)物可與核糖體相結(jié)合，破壞核糖體正常功能的發(fā)揮，抑制蛋白質(zhì)合成反應(yīng)。此應(yīng)激反應(yīng)會影響細(xì)胞內(nèi)一系列炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，造成細(xì)胞超負(fù)荷氧化應(yīng)激效應(yīng)[19]。這與本研究發(fā)現(xiàn)DON破壞牛卵母細(xì)胞內(nèi)氧化系統(tǒng)平衡結(jié)果相一致。因此，在牛卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)液中適當(dāng)添加抗氧化或許有助于緩解細(xì)胞內(nèi)的超負(fù)荷氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而降低DON對牛卵母細(xì)胞成熟及發(fā)育能力的損傷。

4 結(jié) 論

DON對牛卵母細(xì)胞體外成熟具有毒性作用，具體表現(xiàn)為抑制卵丘顆粒細(xì)胞擴(kuò)展、影響線粒體在細(xì)胞質(zhì)中正常分布、降低第一極體排出率及卵母細(xì)胞體外受精卵裂率及囊胚率，其作用機(jī)制與破壞牛卵母細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的平衡相關(guān)。