徐文倩 李金紅 鄭智華

【關(guān)鍵詞】巨噬細(xì)胞遷移抑制因子;巨噬細(xì)胞;急性腎損傷;腎臟炎癥

急性腎損傷（AKI）在臨床中較為常見。在AKI早期階段的腎小管損傷中，炎癥起關(guān)鍵作用，腎臟中可觀察到大量炎性細(xì)胞因子釋放和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。注射脂質(zhì)體氯膦酸鹽系統(tǒng)性耗竭單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞可緩解AKI，體現(xiàn)了巨噬細(xì)胞在AKI中的重要性[1]。其中，M1型巨噬細(xì)胞參與促炎反應(yīng)導(dǎo)致腎臟損傷，而M2型巨噬細(xì)胞參與抗炎反應(yīng)抑制腎臟損傷[2-3]。巨噬細(xì)胞遷移抑制因子（MIF）是免疫和炎癥反應(yīng)的上游細(xì)胞因子，參與AKI的損傷和修復(fù)[4-7]。近年研究結(jié)果闡明了MIF在腎小球腎炎中的致病作用[8-10]。阻斷MIF可以部分逆轉(zhuǎn)快速進(jìn)展新月體腎小球腎炎的腎損傷;MIF基因敲除或藥理學(xué)阻斷對(duì)AKI有保護(hù)作用[11-12]。然而，MIF是否通過(guò)巨噬細(xì)胞促進(jìn)AKI尚無(wú)定論。本研究旨在闡明MIF依賴性巨噬細(xì)胞在AKI中的具體作用和機(jī)制。

材料與方法

一、主要試劑

順鉑（美國(guó)SigmaAldrich）;肌酐檢測(cè)試劑盒（南京建成）;胎牛血清（美國(guó)ThermoFisherScientific）;大鼠抗小鼠Mincle抗體（美國(guó)MBL），兔抗小鼠iNOS抗體（美國(guó)Abcam）;山羊抗小鼠MCP-1抗體（美國(guó)SantaCruz），山羊抗小鼠TNF-α抗體（美國(guó)SantaCruz）;LiberaseTM（美國(guó)Roche）;流式固定液，流式染色液（美國(guó)eBioscience）;APC標(biāo)記的抗小鼠NOS2抗體（美國(guó)eBioscience），AlexaFluor?488標(biāo)記的抗小鼠Mincle抗體（美國(guó)SantaCruz），PECy5標(biāo)記的抗小鼠F4/80抗體（美國(guó)eBioscience）;蘇木素-雪夫試劑（美國(guó)SigmaAldrich）。

二、造模方法和分組

3只6～8周齡野生型C57BL/6J雄性小鼠、27只6～8周齡MIF基因敲除（MIF-/-）雄性小鼠（C57BL/6J背景）由香港中文大學(xué)惠贈(zèng)。其中，3只野生型雄性小鼠和3只MIF-/-雄性小鼠用于培養(yǎng)骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞。24只MIF-/-雄性被隨機(jī)分為正常對(duì)照組（n=6）和實(shí)驗(yàn)組（n=18）。小鼠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境，自由進(jìn)食、飲水，而且保持12h（光照）∶12h（黑暗）的晝夜循環(huán)，小鼠培養(yǎng)完全符合相關(guān)管理要求，所有動(dòng)物操作均按照中山大學(xué)有關(guān)動(dòng)物保護(hù)和管理辦法執(zhí)行，研究過(guò)程符合動(dòng)物倫理要求。

正常對(duì)照組小鼠尾靜脈注射生理鹽水。實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔注射順鉑，劑量為20mg/kg，建立順鉑誘導(dǎo)的AKI模型（Cis-AKI）。建模6h后將18只實(shí)驗(yàn)組小鼠隨機(jī)分為AKI模型組、巨噬細(xì)胞對(duì)照組和MIF-/-巨噬細(xì)胞組（每組n=6）。AKI模型組的小鼠通過(guò)尾靜脈注射生理鹽水，巨噬細(xì)胞對(duì)照組的小鼠通過(guò)尾靜脈注射2×106個(gè)提取自野生型小鼠的骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞（BMDM），MIF-/-巨噬細(xì)胞組的小鼠通過(guò)尾靜脈注射2×106個(gè)提取自MIF-/-小鼠的BMDM。3d后處死小鼠，留取血清和腎臟組織標(biāo)本。

三、BMDM培養(yǎng)和轉(zhuǎn)移

物理分離野生型C57BL/6J和MIF-/-小鼠的骨髓細(xì)胞。將骨髓細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清（FBS）和50ng/ml巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）的DMEM/F12培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7d后得到成熟的巨噬細(xì)胞，期間每3d更換培養(yǎng)基。收取成熟的BMDM，用F4/80抗體鑒定BMDM純度>98%，并用預(yù)冷的鹽水以每毫升5×106個(gè)細(xì)胞的密度重懸。順鉑注射6h后將2×106個(gè)BMDM細(xì)胞通過(guò)尾靜脈注射到各組小鼠體內(nèi)。

四、血清肌酐檢測(cè)

離心管中的血樣在室溫下靜置1h，待血液凝固、血清析出后，4000轉(zhuǎn)/分離心10min取上層血清。采用南京建成肌酐定量分析試劑盒，按照說(shuō)明書中的方法步驟進(jìn)行操作：將肌酐標(biāo)準(zhǔn)品、雙蒸水和血清樣品分別加入96孔板中，每孔6μl，復(fù)孔;每孔加入酶溶液A180μl，輕輕拍板混勻;37℃下孵育5min，酶標(biāo)儀（546nm）測(cè)定吸光度值A(chǔ)1;每孔加入酶溶液B60μl，輕輕拍板混勻;37℃下孵育5min，酶標(biāo)儀（546nm）測(cè)定吸光度值A(chǔ)2;根據(jù)計(jì)算公式算出待測(cè)血清的肌酐水平。每組測(cè)量3個(gè)樣品。

五、過(guò)碘酸雪夫（PAS）染色

將石蠟包埋的腎臟組織切成4μm厚的薄片，脫蠟復(fù)水后用雪夫試劑孵育30min至組織呈淡粉色，流水沖洗5min后，可見組織變?yōu)樯罘奂t色。持續(xù)沖洗玻片15min，然后用蘇木素復(fù)染1min，3%冰醋酸復(fù)染15s，流水沖洗至少30min。在室溫下風(fēng)干玻片并封片。

六、免疫組織化學(xué)（免疫組化）染色

4μm腎臟組織常規(guī)切片后，用3%過(guò)氧化氫溶液封閉，一抗?jié)窈兄?℃孵育過(guò)夜，一抗分別為：兔抗小鼠F4/80單克隆抗體（1∶200），山羊抗小鼠MCP-1單克隆抗體（1∶200），山羊抗小鼠TNF-α單克隆抗體（1∶200）。辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的IgG二抗室溫孵育1h，用DAB顯色，蘇木素染1min，3%冰醋酸復(fù)染15s，在室溫下風(fēng)干玻片并封片，在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)，每組計(jì)數(shù)3個(gè)樣品，每個(gè)樣品計(jì)數(shù)5個(gè)高倍鏡視野并取平均值。

七、流式細(xì)胞儀檢測(cè)

腎臟組織剪碎后用1%LiberaseTM消化成單細(xì)胞懸液，然后用流式固定液固定20min。取106個(gè)細(xì)胞重懸在100μl流式染色液中，抗體4℃孵育過(guò)夜，抗體分別為APC標(biāo)記的抗小鼠NOS2單克隆抗體（1∶100），AlexaFluor?488標(biāo)記的抗小鼠Mincle單克隆抗體（1∶100），PECy5標(biāo)記的抗小鼠F4/80單克隆抗體（1∶100），次日加入1ml磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗細(xì)胞，離心后去除上清，用200～500μl流式染色緩沖液重懸，用BDFACSAriaⅢ流式細(xì)胞儀分析熒光信號(hào)，用FlowJo軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。每組測(cè)量3個(gè)樣品。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPadPrism6.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Bonferroni法，文中所示P值均為校正后P值。α=0.05。

結(jié)果

一、4組小鼠腎臟組織病理和血清肌酐的比較

與AKI模型組相比，巨噬細(xì)胞對(duì)照組小鼠的血清肌酐水平升高（t=8.318，P<0.001），MIF-/-巨噬細(xì)胞組小鼠的血清肌酐水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.195，P>0.999），巨噬細(xì)胞對(duì)照組和MIF-/-巨噬細(xì)胞組小鼠的腎小管壞死加重（t=14.770，P<0.001;t=5.427，P=0.004）。與巨噬細(xì)胞對(duì)照組相比，MIF-/-巨噬細(xì)胞組小鼠的血清肌酐水平降低（t=7.122，P<0.001），腎小管損傷程度減輕（t=9.347，P<0.001），見圖1。給Cis-AKI小鼠注射巨噬細(xì)胞可加重小鼠腎小管結(jié)構(gòu)和腎功能損傷，注射MIF-/-巨噬細(xì)胞則小鼠腎小管結(jié)構(gòu)和腎功能損傷明顯減輕，說(shuō)明巨噬細(xì)胞加重Cis-AKI小鼠的腎小管結(jié)構(gòu)和腎功能損傷是MIF依賴性的。

二、4組小鼠腎臟炎癥因子的比較

免疫組化染色結(jié)果顯示，與AKI模型組相比，巨噬細(xì)胞對(duì)照組小鼠腎臟中MCP-1和TNF-α的蛋白表達(dá)水平升高（t=5.435，P=0.004;t=10.700，P<0.001），MIF-/-巨噬細(xì)胞組小鼠腎臟中TNF-α的蛋白表達(dá)水平升高（t=0.708，P>0.999;t=3.562，P=0.044）。與巨噬細(xì)胞對(duì)照組相比，MIF-/-巨噬細(xì)胞組小鼠腎臟中MCP-1和TNF-α的蛋白表達(dá)水平降低（t=4.727，P=0.009;t=7.141，P<0.001），見圖2。給Cis-AKI小鼠注射巨噬細(xì)胞可加重小鼠腎臟炎癥損傷，注射MIF-/-巨噬細(xì)胞則小鼠腎臟炎癥因子表達(dá)明顯減輕，說(shuō)明巨噬細(xì)胞加重Cis-AKI小鼠的腎臟炎癥損傷是MIF依賴性的。

三、4組小鼠巨噬細(xì)胞比例的比較

流式分析結(jié)果顯示，與AKI模型組相比，巨噬細(xì)胞對(duì)照組和MIF-/-巨噬細(xì)胞組小鼠腎臟中M1型巨噬細(xì)胞的比例升高（t=28.020，P<0.001;t=8.725，P<0.001）。與巨噬細(xì)胞對(duì)照組相比，MIF-/-巨噬細(xì)胞組小鼠腎臟中M1型巨噬細(xì)胞的比例降低（t=19.300，P<0.001），見圖3。而且，與AKI模型組相比，巨噬細(xì)胞對(duì)照組小鼠腎臟中Mincle+M1型巨噬細(xì)胞的比例升高（t=23.650，P<0.001;t=3.252，P=0.070）。與巨噬細(xì)胞對(duì)照組相比，MIF-/-巨噬細(xì)胞組小鼠腎臟中Mincle+M1型巨噬細(xì)胞的比例降低（t=20.400，P<0.001），見圖3。給Cis-AKI小鼠注射巨噬細(xì)胞可促進(jìn)Mincle表達(dá)和M1型巨噬細(xì)胞激活，注射MIF-/-巨噬細(xì)胞則小鼠Mincle表達(dá)和M1型巨噬細(xì)胞比例明顯減少，說(shuō)明巨噬細(xì)胞促進(jìn)Cis-AKI小鼠的腎臟Mincle表達(dá)和M1型巨噬細(xì)胞激活是MIF依賴性的。

討論

AKI是由多種病因?qū)е?、涉及多學(xué)科的臨床常見重癥，是慢性腎臟病的主要原因。目前尚無(wú)AKI的特效治療藥物。缺血-再灌注損傷、腎毒性藥物和感染是AKI的主要原因。炎癥反應(yīng)是AKI的重要表現(xiàn)，同時(shí)也是導(dǎo)致組織損傷的重要原因。受損組織及活性氧等募集炎性細(xì)胞浸入，同時(shí)分泌TNF-α、MCP-1、IL-1β和IL-6等炎性因子，而炎性因子可進(jìn)一步募集白細(xì)胞滲入，導(dǎo)致腎組織損傷加重以及腎功能減退，因此抑制炎性細(xì)胞聚集及細(xì)胞因子釋放對(duì)減輕AKI損傷具有重要意義。其中，巨噬細(xì)胞是AKI的關(guān)鍵參與者。雖然剔除巨噬細(xì)胞可減弱AKI帶來(lái)的腎損傷，但是直接剔除巨噬細(xì)胞導(dǎo)致腎臟修復(fù)過(guò)程延緩，可能不是AKI的最佳治療方案[11，13-17]。因此，研究巨噬細(xì)胞介導(dǎo)AKI的病理生理進(jìn)展的分子機(jī)制是制定AKI新治療策略的必要條件。MIF是由巨噬細(xì)胞分泌的位于炎癥反應(yīng)上游的調(diào)節(jié)因子[18]。我們的前期研究顯示MIF在AKI小鼠腎組織中高表達(dá)，全身性MIF基因敲除或MIF藥理學(xué)阻斷對(duì)小鼠AKI有保護(hù)作用，MIF缺失后AKI小鼠的腎功能改善，巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和炎性細(xì)胞因子釋放大幅減少[11-12]。

為了探究MIF依賴性巨噬細(xì)胞對(duì)順鉑誘導(dǎo)的AKI的影響，我們?cè)贏KI造模6h后將MIF+/+或MIF-/-巨噬細(xì)胞注射到小鼠體內(nèi)，并在注射后第3日分別分析腎臟病理、功能和腎臟中的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)情況等，結(jié)果顯示在順鉑誘導(dǎo)的AKI發(fā)展過(guò)程中MIF通過(guò)增強(qiáng)M1型巨噬細(xì)胞活化加重AKI。促炎因子（如TNF-α、MCP-1、IL-1β和IL-6等）在腎組織中的過(guò)量生成與AKI的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。本研究在Cis-AKI小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，與MIF-/-巨噬細(xì)胞組小鼠相比，巨噬細(xì)胞對(duì)照組小鼠的炎性細(xì)胞因子如MCP-1和TNF-α表達(dá)增高，腎小管損傷和血清肌酐升高更嚴(yán)重，提示巨噬細(xì)胞通過(guò)促進(jìn)腎組織炎性反應(yīng)進(jìn)而加重AKI是MIF依賴性的，證實(shí)了MIF依賴性巨噬細(xì)胞在AKI中的致病作用。Mincle是M1型巨噬細(xì)胞激活的關(guān)鍵因素[3]。壞死腎小管細(xì)胞中的β-葡萄糖神經(jīng)酰胺可以通過(guò)Mincle激活巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)小鼠AKI后的持續(xù)炎癥[19]。MIF-/-巨噬細(xì)胞組小鼠腎臟Mincle+M1型巨噬細(xì)胞的比例較巨噬細(xì)胞對(duì)照組低，提示MIF能通過(guò)增強(qiáng)巨噬細(xì)胞中Mincle的表達(dá)促進(jìn)AKI腎小管損傷階段M1型巨噬細(xì)胞的活化。這些結(jié)果表明，MIF通過(guò)促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化，進(jìn)一步增加了炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，在很大程度上加劇了AKI。

綜上所述，MIF依賴的巨噬細(xì)胞通過(guò)促進(jìn)腎臟M1型巨噬細(xì)胞表面Mincle激活，增加促炎因子表達(dá)，加重AKI介導(dǎo)的腎臟結(jié)構(gòu)和功能損傷。后續(xù)我們將進(jìn)一步在小鼠巨噬細(xì)胞中特異性敲除MIF來(lái)驗(yàn)證MIF對(duì)巨噬細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制，探討可能的AKI治療靶點(diǎn)。