游思亮 王裔娜 田瑞平 王青

摘要：通過(guò)單因素試驗(yàn)，分析了均質(zhì)壓力、均質(zhì)次數(shù)和菌液濃度3個(gè)因素對(duì)大腸桿菌蛋白破碎率的影響。然后利用響應(yīng)面試驗(yàn)擬合出大腸桿菌蛋白破碎率的回歸方程，優(yōu)化了高壓均質(zhì)法破碎大腸桿菌的試驗(yàn)條件。結(jié)果表明，各因素對(duì)大腸桿菌蛋白破碎率影響順序?yàn)榫|(zhì)次數(shù)（B）>均質(zhì)壓力（A）>菌液濃度（C）。在均質(zhì)壓力140 MPa、均質(zhì)次數(shù)4次、菌液濃度60 g/L時(shí)，大腸桿菌蛋白破碎率達(dá)到最高，為13.98%。

關(guān)鍵詞：響應(yīng)面;高壓均質(zhì);蛋白破碎率;大腸桿菌

中圖分類(lèi)號(hào)： S182? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）17-0071-04

收稿日期：2021-01-10

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31801350）。

作者簡(jiǎn)介：游思亮（1984―），男，湖北武漢人，碩士，實(shí)驗(yàn)師，主要從事大型儀器設(shè)備管理和功能開(kāi)發(fā)。E-mail：yousl@njau.edu.cn。

在生物學(xué)領(lǐng)域，經(jīng)過(guò)改造過(guò)的細(xì)菌系統(tǒng)經(jīng)常用來(lái)表達(dá)各種外源重組產(chǎn)物，如蛋白質(zhì)、酶和抗體，大腸桿菌（Escherichia coli，簡(jiǎn)稱(chēng)E. coli）是其中最常見(jiàn)的寄主材料。這主要是由其特點(diǎn)決定的，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有遺傳背景清楚、繁殖快、培養(yǎng)成本低、表達(dá)量高、表達(dá)產(chǎn)物容易純化、穩(wěn)定性好、抗污染能力強(qiáng)以及適用范圍廣等優(yōu)勢(shì)[1]。

但是重組蛋白通常在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)部表達(dá)，不能被大腸桿菌分泌到細(xì)胞外部，要提取純化蛋白還需要將大腸桿菌細(xì)胞破碎[2]。目前，用于提取大腸桿菌外源蛋白的常用細(xì)胞破碎方法主要有高壓均質(zhì)法、珠磨法、超聲波破碎法、滲透壓法、反復(fù)凍融法、酶解法和化學(xué)降解法[3-8]。高壓均質(zhì)法破碎細(xì)胞的原理是在高壓條件下使溶液通過(guò)均質(zhì)閥，溶液內(nèi)細(xì)胞經(jīng)過(guò)閥門(mén)的撞擊力、通道內(nèi)高速流體剪切力和瞬時(shí)壓力差3個(gè)不同的作用力后被破碎，釋放胞內(nèi)物質(zhì)達(dá)到細(xì)胞破碎的目的[9]。高壓均質(zhì)法作為一種物理破碎方式，具有破碎效率高[3-4]、無(wú)試劑消耗和污染[5]、可用于工業(yè)化生產(chǎn)等諸多優(yōu)點(diǎn)[10]，正在被越來(lái)越多的研究者采用。

有學(xué)者利用高壓均質(zhì)法研究破碎大腸桿菌的試驗(yàn)條件[7]，但主要是探討單個(gè)因素對(duì)破碎結(jié)果的影響，沒(méi)有考慮到因素之間的交互作用，也沒(méi)有探討最優(yōu)化的試驗(yàn)條件。本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法探討因素之間的交互作用以及最優(yōu)化的試驗(yàn)條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：E. coli DH5α為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所保存，重組質(zhì)粒pCold-10477為小麥研究所構(gòu)建，按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化獲得相應(yīng)重組工程菌。

試劑：蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、瓊脂糖、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、卡那霉素、二硫蘇糖醇（DTT），購(gòu)自Sigma公司;Bradford蛋白質(zhì)濃度檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自上海碧云天生物公司;PBS緩沖液（pH值7.2），購(gòu)自英濰捷基公司。

儀器：高壓均質(zhì)機(jī)（JN-Mini，廣州聚能納米公司）、酶標(biāo)儀（Infinite200，TECAN）、離心機(jī)（CR21，Hitachi）、搖床（Ks4000，IKA）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌液的培養(yǎng)和收集 重組基因的E. coli DH5α工程菌采用兩步法培養(yǎng)，取3 μL重組工程菌液接種到3 mL新鮮LB培養(yǎng)基（含50 μg/mL卡那霉素） 中，于37? ℃、220 r/min過(guò)夜培養(yǎng)15 h獲得種子液。隨后將種子也按照1%比例接種到新鮮LB培養(yǎng)基（含50 μg/mL卡那霉素）中，37 ℃、220 r/min 繼續(xù)培養(yǎng)至D600 nm達(dá)到0.6左右，加誘導(dǎo)劑后繼續(xù)16 ℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)15 h。每 100 mL 誘導(dǎo)后的菌液于10 000 r/min 離心5 min，收集菌體，加入預(yù)冷的PBS緩沖液（pH值7.2） 50 mL 洗滌1次，然后加入預(yù)冷的PBS緩沖液 15 mL，充分懸浮，懸浮液置于-4 ℃待用。

1.2.2 菌液濃度測(cè)定 當(dāng)菌液在600 nm時(shí)的吸光度值D600 nm小于0.7時(shí)，D600 nm與菌液濃度呈線(xiàn)性關(guān)系[11]，可用來(lái)監(jiān)測(cè)菌體生長(zhǎng)情況，濃縮之后的菌液濃度用每升菌液中菌體濕質(zhì)量（g/L）表示。

1.2.3 蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 破碎之后上清液中可溶性蛋白的濃度用Bradford染色法測(cè)得[12]。將蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋成1.500、1.000、0.750、0.500、0.250、0.125 mg/mL的濃度梯度，然后分別取5 μL不同濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液到96孔酶標(biāo)板，每個(gè)孔各加250 μL的G250染色液，反應(yīng) 5 min 后，用酶標(biāo)儀測(cè)定595 nm處的吸光度，重復(fù)3次，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的方程為y=0.632 9x+0.532 5，相關(guān)系數(shù)r2=0.992 3，表明標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相關(guān)性很好，可用于檢測(cè)樣品的蛋白質(zhì)濃度。

1.2.4 蛋白破碎率的測(cè)定 用上清液中可溶性蛋白的濃度與菌體濃度的比值表示蛋白破碎率。

1.2.5 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)已有研究[7]，選取高壓均質(zhì)過(guò)程中關(guān)鍵影響因素均質(zhì)壓力、均質(zhì)次數(shù)、菌液濃度，設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)，研究每個(gè)因素對(duì)破碎結(jié)果的影響，試驗(yàn)方案如下：（1）在菌液濃度為100 g/L，均質(zhì)次數(shù)為3次時(shí)，分別用80、100、120、140、160 MPa均質(zhì)壓力破碎菌液，分析均質(zhì)壓力對(duì)大腸桿菌破碎結(jié)果的影響。（2）在均質(zhì)壓力為 120 MPa，菌液濃度為100 g/L時(shí)，分別均質(zhì)1、2、3、4、5次，分析均質(zhì)次數(shù)對(duì)大腸桿菌破碎結(jié)果的影響。（3）在均質(zhì)壓力為120 MPa，均質(zhì)次數(shù)為3次時(shí)，分別用60、80、100、120、140 g/L濃度的菌液進(jìn)行破碎，分析菌液濃度對(duì)大腸桿菌破碎結(jié)果的影響。

1.2.6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Design Expert V8.0.6軟件中Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，以均質(zhì)壓力（A）、均質(zhì)次數(shù)（B）、菌液濃度（C）為試驗(yàn)因素，以蛋白破碎率為響應(yīng)值設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，并用方程對(duì)結(jié)果進(jìn)行擬合及優(yōu)化，各因素及水平見(jiàn)表1所示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

單因素試驗(yàn)每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)做3次重復(fù)，使用Excel 2016處理數(shù)據(jù)及制作圖表。響應(yīng)面結(jié)果用Design Expert V8.0.6進(jìn)行擬合，方差分析并優(yōu)化參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 不同均質(zhì)壓力對(duì)破碎結(jié)果的影響 由圖1可知，在均質(zhì)壓力達(dá)到120 MPa之前，隨著壓力的增大，大腸桿菌蛋白破碎率明顯升高，100 MPa和 120 MPa 處理之間差異達(dá)到顯著水平（P<0.05）。當(dāng)均質(zhì)壓力達(dá)到120 MPa之后，隨著均質(zhì)壓力上升，大腸桿菌蛋白破碎率緩慢升高，但是處理之間差異不顯著，說(shuō)明壓力達(dá)到120 MPa時(shí)，樣品的破碎已經(jīng)接近完成，升高壓力對(duì)結(jié)果的影響已經(jīng)不明顯，因此，選用的均質(zhì)壓力為120 MPa。

2.1.2 不同均質(zhì)次數(shù)對(duì)破碎結(jié)果的影響 由圖2可知，樣品破碎前期（次數(shù)≤3）增加均質(zhì)次數(shù)可以顯著提高大腸桿菌蛋白破碎率，處理之間差異達(dá)到顯著水平（P<0.05）。但是均質(zhì)3次之后，繼續(xù)增加均質(zhì)次數(shù)，結(jié)果的增加幅度明顯放緩，均質(zhì)3、4和5次處理之間差異均不顯著。過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的破碎有可能導(dǎo)致釋放出的蛋白質(zhì)降解，并且考慮時(shí)間成本，選擇的均質(zhì)次數(shù)為3次。

2.1.3 不同菌液濃度對(duì)破碎結(jié)果的影響 由圖3可知，隨著菌液濃度的提高，大腸桿菌的蛋白破碎率呈緩慢下降的趨勢(shì)，但各處理的結(jié)果基本維持在較高的水平（>9.5%），除了濃度最低的60 g/L處理，其他處理之間差異都不顯著，說(shuō)明菌液濃度對(duì)大腸桿菌蛋白破碎率的影響較小。因此，選取差異不顯著的第1個(gè)處理，也就是80 g/L作為后續(xù)試驗(yàn)條件。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，一共安排響應(yīng)面試驗(yàn)15組，試驗(yàn)順序及結(jié)果如表2所示。通過(guò)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行二元多次回歸擬合，得到蛋白破碎率的回歸方程為Y=11.55+0.82A+1.5B+0.18C-0.38AB-0.59AC+0.055BC+0.25A2-0.12B2+0.062C2。該回歸方程模型的P模型=0.000 8<0.01，表明模型極顯著;失擬項(xiàng)p失擬=0.155 4>0.05，表明模型失擬項(xiàng)不顯著;模型的確定系數(shù)R2=0.9820，調(diào)整確定系數(shù)R2adj=0.949 5，說(shuō)明該模型能解釋94.95%的響應(yīng)值變化，因此，該模型擬合良好，可以用此模型對(duì)最優(yōu)破碎參數(shù)進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

從表3可知，一次項(xiàng)A、B達(dá)到極顯著水平（P<0.01），而C不顯著，表明均質(zhì)壓力和均質(zhì)次數(shù)對(duì)蛋白破碎率影響極大，菌液濃度對(duì)蛋白破碎率的影響相對(duì)不顯著。二次項(xiàng)中除了AC因素之間交互作用顯著外，其他因素之間交互作用都不顯著，表明因素之間的交互作用對(duì)蛋白破碎率的影響較小。而且各因素對(duì)大腸桿菌蛋白破碎率影響大小順序?yàn)榫|(zhì)次數(shù)（B）>均質(zhì)壓力（A）>菌液濃度（C）。

通過(guò)觀(guān)察兩因素之間的響應(yīng)曲面圖可以預(yù)測(cè)變量的響應(yīng)值以及確定變量之間的相互關(guān)系，響應(yīng)面越陡，反映兩因素之間的交互作用越顯著[13]。三因素兩兩之間的響應(yīng)面曲面見(jiàn)圖4，可見(jiàn)圖4-a的響應(yīng)曲面較陡，表明均質(zhì)壓力和均質(zhì)次數(shù)之間交互作用較顯著，對(duì)蛋白破碎率的影響較大。圖4-b、圖4-c的響應(yīng)曲面較平緩，表明均質(zhì)壓力與菌液濃度、均質(zhì)次數(shù)與菌液濃度之間的交互作用較不顯著，對(duì)響應(yīng)值的影響較小。

2.3 最優(yōu)參數(shù)的確定及驗(yàn)證

在選取的因素范圍內(nèi)，通過(guò)DesignExpert V8.0.6軟件提取的最優(yōu)條件：均質(zhì)壓力140 MPa、均質(zhì)次數(shù)4次、菌液濃度60 g/L，在此條件下，回歸模型預(yù)測(cè)的理論蛋白破碎率為14.04%。為了驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，根據(jù)預(yù)測(cè)試驗(yàn)條件，經(jīng)過(guò)3次重復(fù)，得到大腸桿菌實(shí)際蛋白破碎率為13.98%，這與預(yù)測(cè)值非常接近。說(shuō)明該模型能較好地?cái)M合實(shí)際情況，有一定的實(shí)踐指導(dǎo)意義。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)單因素試驗(yàn)，分析了均質(zhì)壓力、均質(zhì)次數(shù)和菌液濃度3個(gè)因素對(duì)大腸桿菌蛋白破碎率的影響。然后根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用響應(yīng)面試驗(yàn)擬合出大腸桿菌蛋白破碎率的二元多次回歸方程，各因素對(duì)大腸桿菌蛋白破碎率影響順序?yàn)榫|(zhì)次數(shù)（B）>均質(zhì)壓力（A）>菌液濃度（C），并確定最優(yōu)化的試驗(yàn)參數(shù)：均質(zhì)壓力140 MPa、均質(zhì)次數(shù)4次、菌液濃度60 g/L，在此條件下的大腸桿菌實(shí)際蛋白破碎率為13.98%。該結(jié)果可為高壓均質(zhì)法破碎大腸桿菌，提取胞內(nèi)外源蛋白提供一定的方法借鑒，并適用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Tripathi N K. Production and purification of recombinant proteins from Escherichia coli[J]. Chembioeng Reviews，2016，3（3）：116-133.

[2]Eggenreich B，Rajamanickam V，Wurm D J，et al. A combination of HPLC and automated data analysis for monitoring the efficiency of high-pressure homogenization[J]. Microbial Cell Factories，2017，16（1）：134.

[3]趙燁清，石 莉，歐陽(yáng)臻，等. 化學(xué)-滲透壓法溫和破碎處理下大腸桿菌細(xì)胞胞內(nèi)蛋白質(zhì)的釋放率[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（19）：146-149.

[4]謝 琦，劉永明. 滲透休克法從大腸桿菌中提取GST-Tα1-TP5融合蛋白[J]. 華夏醫(yī)學(xué)，2016，29（4）：9-12.

[5]沈徐凱，周 斌，王云艷，等. 丙酮破碎法提取重組大腸桿菌表達(dá)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶原[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2011（5）：223-226.

[6]劉 紅，潘紅春，蔡紹皙，等. 酶解-超聲法破碎大腸桿菌提純包含體[J]. 重慶大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2004，27（10）：75-78.

[7]吳 蕾，洪建輝，甘一如，等. 高壓勻漿破碎釋放重組大腸桿菌提取包含體過(guò)程的研究[J]. 高?；瘜W(xué)工程學(xué)報(bào)，2001，15（2）：191-194.

[8]徐 龍，曹小安，劉永生，等. 布魯氏菌BP26蛋白對(duì)鼠源樹(shù)突狀細(xì)胞分化及抗原提呈作用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2020，36（4）：984-991.

[9]梁蕊芳，徐 龍，岳明強(qiáng). 細(xì)胞破碎技術(shù)應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技，2013（1）：113-114.

[10]Pekarsky A，Spadiut O，Rajamanickam V，et al. A fast and simple approach to optimize the unit operation high pressure homogenization-a case study for a soluble therapeutic protein in E. coli[J]. Preparative Biochemistry & Biotechnology，2019，49（1）：74-81.

[11]Glazyrina J，Materne E M，Dreher T，et al. High cell density cultivation and recombinant protein production with Escherichia coli in a rocking-motion-type bioreactor[J]. Microbial Cell Factories，2010，9（1）：42.

[12]Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry，1976，72（1/2）：248-254.

[13]魯 龍，畢生雷，金洪波，等. 高壓勻質(zhì)法破碎小球藻細(xì)胞工藝優(yōu)化[J]. 食品工業(yè)科技，2017，38（6）：304-307，349.