李井干 吳晶 劉曉宇 許忠祥 李洋 郭靜 伏建國 楊曉軍

摘要：為了建立瀕危龍樹科植物DNA條形碼鑒定方法，本研究選取rbcL、matK、ycf1b等3對引物對9種21份龍樹科植物進行DNA提取、序列擴增及產(chǎn)物測序，比較序列擴增效率和測序成功率;應用DNASTAR Lasergene 軟件對測得的雙向序列進行拼接;使用MEGA-X軟件進行序列比對，分析種內(nèi)和種間變異;使用鄰接法構建系統(tǒng)聚類樹。結果表明，ycf1b序列可以區(qū)分龍樹科4個屬的植物，聚類效果好，種間存在可靠序列差異，可作為龍樹科植物DNA條形碼鑒定的有效序列片段。

關鍵詞：龍樹科;DNA條形碼;聚類分析;物種鑒定;基因片段

中圖分類號：S184?? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）17-0063-04

收稿日期：2021-01-28

基金項目：國家質(zhì)量基礎的共性技術研究與應用（編號：2017YFF0210300、2017YFF0210305）。

作者簡介：李井干（1987—），男，山東滕州人，碩士，農(nóng)藝師，主要從事瀕危物種鑒定方面的研究。E-mail：570109771@qq.com。

龍樹科（Didiereaceae）別稱刺戟木科，原產(chǎn)非洲馬達加斯加島的南部，當?shù)靥赜蟹N，是多肉植物中一個重要的科。按照恩格勒分類系統(tǒng)，龍樹科被分為4屬，分別是亞龍木屬[Alluaudia （Drake） Drake]、枝龍木屬（Alluaudiopsis Humbert & Choux）、曲龍木屬（Decarya Choux）和刺戟木屬（Didierea Baill）[1]，全科11種均被列入《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》（CITES）附錄Ⅱ。龍樹科刺奇葉美，具有很高的觀賞價值，世界多地有引種栽培。另外，龍樹科還是一類重要的資源植物，刺戟木屬（Didierea Baill）的阿修羅城（Didierea trollii）還是馬達加斯加當?shù)匾环N環(huán)尾狐猴的美味佳肴，對維護自然生態(tài)系統(tǒng)也起著重要作用[2]。由于環(huán)境氣候變化、過度采集利用等原因，導致龍樹科植物淪為瀕危植物，亟需準確快速的物種鑒定方法來加強龍樹科植物的保護。雖然龍樹科的分類鑒定研究較早，但也只是局限在形態(tài)特征和理化結構[3]，龍樹科DNA條形碼鑒定方法尚未有報道，且龍樹科條形碼數(shù)據(jù)庫在物種豐富度及數(shù)量上都相對不完整，仍需進行大量研究。

DNA條形碼（DNA barcoding）是依據(jù)1條或幾條短的DNA片段的序列差異作為物種鑒定標準的分子鑒定方法[4]。植物體內(nèi)葉綠體含量高，容易提取和擴增，因此植物DNA條形碼多選用葉綠體基因組DNA片段。常用的葉綠體片段有rbcL、matK、trnH-psbA、rpoB、accD、YCF5等[5]。植物家族種類龐大，不同類群存在較大遺傳差異，序列通用性差;且種內(nèi)序列差異性小、識別率低，因此，篩選可靠準確的DNA條形碼至關重要。

本研究選用rbcL、matK和ycf1b序列對龍樹科4屬9種21份樣品進行物種鑒定和聚類分析，建立龍樹科物種的分子鑒定方法，同時補充完善龍樹科植物DNA條形碼序列數(shù)據(jù)庫，為瀕危植物分類鑒定研究提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試樣品：龍樹科植物樣品數(shù)量及來源見表1。采集樣品均為活體植株，隨機取其葉片進行試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取

先將供試樣品進行表面消毒，將植物葉片研磨成粉，參照DNeasy Plant Mini Kit試劑盒說明書上的步驟方法，提取試驗樣品基因組DNA。

1.2.2 PCR擴增和測序

通過查閱相關文獻，選擇在植物中使用較廣泛的葉綠體基因組rbcL[6]序列、matK[7] 序列和ycf1b[8]序列作為DNA條形碼候選序列。擴增引物及反應條件見表2。擴增體系為25 μL：TaKaRa rTap酶11 μL，引物各0.5 μL，模版DNA 2 μL，滅菌水補足反應體系至25 μL。按照反應體系在TaKaRa PCR擴增儀上進行擴增反應，擴增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，擴增結果理想的PCR擴增產(chǎn)物送至南京思普金生物科技有限公司進行測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用DNASTAR Lasergene 軟件包中的Seqman程序?qū)y序獲得序列進行組裝和校對，去除低質(zhì)量區(qū)和引物區(qū)，獲得rbcL、matK和ycf1b這3種DNA條形碼序列。再運用MEGA-X軟件對候選條形碼序列進行序列分析，用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建系統(tǒng)進化樹，并用自舉檢驗法（Bootstrap 1 000 次）檢驗各分支的支持率。

2 結果與分析

以龍樹科21份樣品為模板，用3條目標序列進行擴增和測序。結果顯示，DNA擴增成功率和雙向測序成功率均為100%。rbcL序列大小均為 553 bp，matK序列大小為均925 bp，ycf1b序列大小均為889 bp。rbcL序列變異位點較少，matK序列和ycf1b序列的變異位點較多，長度也較長，具體信息見表3。

2.1 系統(tǒng)發(fā)育樹聚類分析

由于rbcL序列種間差異較小，因此選用matK和ycf1b 這2種序列構建系統(tǒng)聚類樹（圖1）。序列聚類樹聚類結果表明，ycf1b序列可以將21份樣品的各屬物種聚成一支，除阿修羅城（Didierea trollii） 3個樣品外，各物種的多條序列也分別聚為一支。matK序列屬間物種能夠被分開，物種間不能各自聚為一支。

2.2 種間和種內(nèi)變異

21份龍樹科樣品ycf1b序列長度均為889 bp，其中變異位點有14個。龍樹科植物種內(nèi)序列并無差異，屬、種間存在特有變異位點。彎曲龍屬（Decarya Choux）2份樣品D03、D09在337號和299號位分別存在特有變異位點G→C、T→A;亞龍木屬[Alluaudia（Drake） Drake]14份樣品在205號位存在特有變異位點G→T，屬內(nèi)也存在變異位點可以將各物種區(qū)分開來;枝龍木屬（Alluaudiopsis Humbert & Choux）樣品D21在58號、316號、357號和385號位分別存在特有變異位點G→T、C→T、T→C、T→C;刺戟木屬（Didierea Baill）樣品D02、D15和D19在522號位存在變異位點G→C，可以將該屬內(nèi)2種植物進行區(qū)分（表4）。這些關鍵變異位點均可以作為龍樹科種屬間鑒定的關鍵依據(jù)。

3 討論

龍樹科植物具有獨特的形態(tài)特征，莖上長有大量的刺，葉的形狀也豐富多樣，有線形、梭形、卵形、心形等，少數(shù)種類形態(tài)非常相似，非專業(yè)人員難以辨別，龍樹科植物作為瀕危物種，也需要對其進行準確的鑒定。本研究選用3條常用DNA條形碼片段（rbcL、matK和ycf1b）作為目的序列，對龍樹科4個屬的21份植物進行親緣關系分析及分類鑒定。結果表明，ycf1b可將龍樹科21份植物進行明確的系統(tǒng)分類，且各類群的ycf1b序列均具特有突變位點，因此ycf1b可作為龍樹科植物DNA條形碼的有效序列。

rbcL基因序列的變異水平在種間水平以上，在種間及種內(nèi)變異很小[9]，這可能是不能用于龍樹科植物的鑒定的主要原因，但rbcL同樣具有通用性強、易擴增等特點，可作為驗證物種基因組提取和擴增效率的參照序列。matK進化速度是rbcL的 2～3倍，遺傳變異大，一般用于植物科、屬水平的鑒定[10]，但在屬內(nèi)近源種只能提供極少的簡約信息位點[11]，matK序列引物通用性較差也是限制其應用的主要原因。ycf1序列是葉綠體基因組內(nèi)的片段，由于其進化速度快，序列變異較大，近年來已被陸續(xù)應用于白芨屬[12]、霸王屬[13]、楊屬[14]、蘭科[11]等植物的分子鑒定中;且對于陸地植物物種，其在PCR成功率、序列位點變異率及物種鑒別率等方面優(yōu)于rbcL、matK等常用葉綠體DNA條形碼，因此被認為是最具潛力的陸地植物DNA條形碼序列[8]。

ycf1b序列能對龍樹科植物親緣關系遠近進行準確的量化分析，這對龍樹科物種遺傳分類學具有重要意義，不僅可以補充龍樹科植物的DNA條碼數(shù)據(jù)庫，還可提高鑒定的準確性和可靠性。可見，對物種進行準確的序列測定和親緣關系分析，再結合序列間的堿基位點差異，是龍樹科物種鑒定的有效方法，也為其他瀕危物種鑒定研究奠定了基礎。

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