田 琳 張海洋 祁智慧 唐 芳

(國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院，北京 100037)

稻谷是我國重要的儲備糧品種，其儲藏安全受多種因素的影響。霉菌生長引起糧堆霉變發(fā)熱，甚至產(chǎn)生毒素，是導(dǎo)致稻谷數(shù)量和質(zhì)量損失、引發(fā)儲藏安全問題的主要因素之一[1-3]。霉菌生長的早期檢測是霉變防控的基礎(chǔ)[4]，只有盡早發(fā)現(xiàn)，才能及時有效處理，將儲糧損失降到最低。

儲糧霉菌檢測方法多樣，原理各不相同，大體可分為直接檢測法和間接檢測法兩大類。直接法主要包括平板菌落培養(yǎng)計數(shù)、真菌孢子計數(shù)法和電鏡觀察法等。儲糧真菌多屬絲狀真菌，具有典型的孢子結(jié)構(gòu)，通過檢測糧食中真菌孢子數(shù)量的變化，可了解儲糧中真菌生長情況。平板菌落培養(yǎng)計數(shù)法[5，6]是通過洗脫糧食上的真菌，對萌發(fā)形成菌落的真菌孢子進行觀察計數(shù)，該方法操作繁瑣且耗時長(一般需要5～7 d)；真菌孢子計數(shù)法是通過洗脫獲得孢子，借助顯微技術(shù)直接對真菌孢子進行觀察計數(shù)[7，8]，克服了平板培養(yǎng)耗時長的問題；掃描電子顯微鏡作為一種超微結(jié)構(gòu)的觀察手段，通過觀察糧食籽粒上霉菌孢子和菌絲生長分布情況，輔助觀察和判定稻谷霉變程度[9]，可以作為儲糧霉菌生長情況研究較為直觀的對照方法。間接法主要通過檢測儲糧霉菌細胞特定成分[10-12]、真菌酶類[13-15]、揮發(fā)性物質(zhì)[16，17]及能量代謝產(chǎn)物等[18-20]間接反映霉菌生長情況。間接法因操作復(fù)雜、檢測儀器昂貴，在實際儲糧中很少應(yīng)用，只有基于能量代謝的糧溫檢測技術(shù)被廣泛應(yīng)用，但對于儲糧霉菌的檢測有嚴(yán)重的滯后性[21-23]。近年來，糧堆CO2氣體檢測技術(shù)逐漸被重視，但受糧堆生態(tài)系統(tǒng)中其他生物代謝或儲糧工藝的干擾較大，檢測結(jié)果雖可判斷糧堆是否有異常變化，但不能直接用于判定霉菌生長情況。因此，在實際儲糧中，操作簡單、快速的直接檢測方法仍是必需的。

本研究在15～35 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中對含水量為14.6%的優(yōu)質(zhì)粳稻進行了模擬儲藏實驗，采用掃描電鏡觀察賦值法、真菌孢子計數(shù)法和平板菌落培養(yǎng)計數(shù)法三種直接方法(分別簡稱為電鏡賦值法、孢子計數(shù)法和平板培養(yǎng)法)定期檢測稻谷表面和糙米表面的霉菌生長狀況，總結(jié)了不同儲藏溫度下稻谷和糙米表面霉菌的生長規(guī)律，并對檢測方法的操作過程和檢出結(jié)果等方面進行分析，比較其優(yōu)缺點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

稻谷樣品：2017年產(chǎn)優(yōu)質(zhì)粳稻，初始含水量14.6%，產(chǎn)自吉林榆樹。

1.2 主要儀器

HPS-250生化培養(yǎng)箱，PL3002-IC 電子分析天平，DJSFM-1糧食水分測試粉碎磨，HG-9246A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，JDMZ 100 稻谷出米率檢測儀，HERAsafe KS12 生物安全柜，MLS-3781L-PC高壓蒸汽滅菌器，E1010離子濺射儀，S-3000N掃描電子顯微鏡。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理

準(zhǔn)備5個8 L密封箱，清洗、晾干后，75%酒精消毒處理。稱取清理、除雜的稻谷樣品裝入5個密封箱中，每箱裝入4 kg。密封箱分別放置在15、20、25、30、35 ℃生化培養(yǎng)箱中儲藏180 d，儲藏期間定期取樣檢測稻谷和糙米上霉菌的生長情況。

1.3.2 稻谷水分檢測

儲藏期間每30 d 在各密封箱中隨機取樣，按照GB 5497—85[24]中105 ℃的恒重法測定稻谷水分。

1.3.3 電鏡賦值法檢測

每30 d 在各密封箱中隨機取樣約20 g，隨機選出8粒作為掃描電鏡觀察樣品，其中4粒通過手工剝殼制成糙米。4粒稻谷和4粒糙米經(jīng)離子濺射儀噴金處理后，在掃描電鏡下觀察(放大倍數(shù)300倍)并記錄霉菌孢子及菌絲的生長情況。

為了量化分析檢測結(jié)果，對稻谷或糙米表面按觀察到霉菌孢子或菌絲的狀態(tài)進行污染程度分級(k)、區(qū)域劃分、并賦值(Vk)處理，具體方法如下：未觀察到霉菌孢子和菌絲的區(qū)域，污染程度定義為0級，不做標(biāo)記并賦值0；觀察到零星分布的霉菌孢子的區(qū)域，污染程度定義為一級，賦值20(見圖1a)；觀察到密度較高但零散分布的孢子和菌絲的區(qū)域，污染程度定義為二級，賦值 40(見圖1b)；觀察到聚集性分生孢子和分生孢子梗結(jié)構(gòu)的區(qū)域，污染程度定義為三級，賦值70(見圖1c)；觀察到成堆的霉菌孢子及菌絲的區(qū)域，污染程度定義為四級，賦值100(見圖1d)。在觀察過程中，評估霉菌孢子和菌絲污染等級(Vk)及其所占的面積百分比(Sk)。賦值結(jié)果(V)定義為污染等級面積百分比與等級賦值乘積之和。

圖1 掃描電鏡下觀察結(jié)果分級賦值依據(jù)

1.3.4 孢子計數(shù)法檢測

每10 d 在各密封箱中隨機取樣，采用 LS/T 6132—2018 《糧油檢驗儲糧真菌的檢測孢子計數(shù)法》[8]檢測稻谷表面攜帶霉菌孢子數(shù)量(FSN/g)。采取手工分離稻殼和糙米的方式，獲得10 g糙米，參照上述方法對糙米攜帶的霉菌孢子進行振蕩洗脫并檢測，根據(jù)稻谷的出糙率數(shù)據(jù)將結(jié)果換算成每克稻谷攜帶的霉菌孢子數(shù)量。

1.3.5 平板培養(yǎng)法檢測

收集實驗初始樣品和各溫度下儲藏180 d的稻谷樣品，參照GB 4789.15—2016[6]，使用高鹽察式培養(yǎng)基(氯霉素含量200～400 mg/L)，培養(yǎng)并檢查稻谷中攜帶的霉菌情況，結(jié)果使用菌落形成單位/克(CFU/g)表示。

設(shè)置碾米時間30 s，對上述稻谷樣品用稻谷出米率檢測儀處理，收集碾米過程中的糠皮層，用糠皮層的帶菌量表示糙米表面攜帶的霉菌情況，操作方法同上，對糠皮層進行培養(yǎng)，結(jié)果換算成每克稻谷的菌落形成單位。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0、EXCEL 2010軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻谷儲藏期間水分變化情況

實驗收集到含水量為14.6%的優(yōu)質(zhì)粳稻，置于不同溫度下模擬儲藏180 d，期間稻谷水分變化見圖2。

圖2 儲藏期間稻谷水分變化情況

由圖2可知，稻谷水分隨儲藏溫度而變化，溫度越高水分丟失越嚴(yán)重。除35 ℃外，其他溫度條件下模擬儲藏前90 d稻谷水分變化幅度不大，90 d后由于儲藏環(huán)境進入低濕度的秋冬季節(jié)，環(huán)境相對濕度由60%左右下降至20%左右，即使儲藏在密閉的塑料箱中，每次因取樣等開箱操作均會造成不同程度的水分損失。

2.2 電鏡賦值法檢出情況

機械礱谷脫殼過程中，由于機械摩擦振動或風(fēng)力作用，會引起真菌的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及孢子脫落，造成孢子數(shù)量減少，不能真實反映糙米表面霉菌的自然生長狀態(tài)[9]，因此本實驗檢測所用的糙米均采用手動剝除稻殼，盡量降低稻殼對糙米表面霉菌的影響。

按照方法1.3.3的方法，對稻谷和糙米樣品觀察并賦值。初始樣品和15 ℃條件下，儲藏180 d各樣品的在稻谷和糙米表面均未觀察到霉菌孢子和菌絲結(jié)構(gòu)，表明15 ℃低溫能有效抑制霉菌生長。其他溫度條件下的賦值結(jié)果見圖3。

由圖3可知，無論是稻谷表面還是糙米表面，霉菌賦值隨儲藏溫度的升高呈上升趨勢，表明適宜生長條件下，霉菌生長速度與儲藏溫度呈正相關(guān)。由圖中霉菌起始檢出點可知，20、25、30 ℃和35 ℃的儲藏條件稻谷樣品中開始檢出霉菌孢子或菌絲的時間分別為90、60、30 d和30 d，表明在一定的溫度范圍內(nèi)霉菌起始生長時間隨儲藏溫度升高而縮短。由圖3中各曲線增長趨勢可知，霉菌孢子在檢出后都經(jīng)歷一段時間的快速增長，隨后生長速度逐漸放慢或維持在一定水平，這與2.1中稻谷樣品的水分降低密切相關(guān)。水分是儲糧微生物生存的決定性條件，研究表明14.0%左右是真菌生長的臨界水分，在此水分下，真菌生長緩慢或停滯[1,25]。由圖2可知，20、25、30 ℃和35 ℃下樣品分別在儲藏150、120、120 d和60 d后降到14.0%及以下，與圖3中各溫度下霉菌生長最大值基本吻合。其中25 ℃及以上電鏡賦值40以上，污染程度達到二級，對應(yīng)真菌檢測達到106個/g[9]，對儲糧會造成一定的危害。

圖3 稻谷和糙米表面電鏡賦值法霉菌檢出情況

實際觀察到稻谷表面的霉菌生長量明顯多于糙米，因此稻谷表面賦值高于糙米表面。造成這種現(xiàn)象的原因，一是稻殼的天然保護作用，霉菌不容易侵入到糧粒內(nèi)；二是儲糧霉菌大部分具有好氧特性，趨于向稻殼外生長。

掃描電鏡放大倍數(shù)和分辨率高，可清晰的區(qū)分出糙米的胚和胚乳，因此，單獨賦值并計算。由圖3可見，各溫度下胚部和胚乳的賦值結(jié)果基本一致，胚部略高于胚乳，尤其是在30 ℃和35 ℃中后期，這是由于糙米胚部營養(yǎng)更豐富，更適于微生物的生長。

2.3 孢子計數(shù)法檢出情況

因孢子計數(shù)法操作簡單、耗時短，為更好地跟蹤稻谷樣品表面攜帶霉菌情況，稻谷的取樣檢測時間間隔設(shè)置為10 d。按1.3.4所述的方法，不同溫度條件下，稻谷表面的霉菌孢子檢測結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同儲藏時間稻谷表面孢子計數(shù)法霉菌檢出情況

由圖4可知，霉菌孢子開始檢出的時間隨儲藏溫度升高而逐漸縮短，在15～35 ℃條件下，分別是150、70、30、20和10 d。霉菌孢子起始檢出時間早于電鏡觀察賦值法10～30 d。15 ℃條件下，儲藏150 d 有少量檢出，20 ℃條件下，儲藏80 d開始有檢出，120 d 后霉菌孢子數(shù)升至最高，之后基本保持不變，主要受其水分降低影響。15 ℃和20 ℃條件下，雖有霉菌孢子檢出，但檢出量水平低于106個/g，不足以對稻谷的品質(zhì)造成危害[1，2]。25、30 ℃和35 ℃條件下，儲藏初期水分和溫度適于真菌生長，霉菌檢出量分別在30、20 d和20 d達到106個/g以上，后期由于稻谷水分降低趨于平穩(wěn)狀態(tài)。由此可見，14.6%含水量的稻谷長期儲存在25 ℃及以上，存在較大風(fēng)險。

各溫度下儲藏180 d及25 ℃條件下不同儲藏時間的稻谷和手剝糙米表面的霉菌生長對比情況如圖5所示。

圖5 稻谷和糙米孢子計數(shù)法霉菌檢出情況比較

由圖5可知，同一儲藏時間(180 d)不同儲藏溫度和同一儲藏溫度(25 ℃)不同儲藏時間，霉菌孢子在稻谷表面的檢出量都大于糙米，基本相差1個數(shù)量級左右。此外，各溫度下儲藏180 d稻谷樣品，15 ℃下稻谷表面有霉菌孢子檢出，而糙米表面未檢出；25 ℃下稻谷表面在30 d開始有霉菌孢子檢出，而糙米表面開始檢出時間在60 d。以上結(jié)果表明，稻殼能阻擋一部分霉菌孢子進入稻谷內(nèi)，在加工過程中，脫殼處理能去除大部分的霉菌，將糙米的帶菌量降低1個數(shù)量級左右。

2.4 平板培養(yǎng)法檢出情況

平板菌落培養(yǎng)法是一種微生物檢測的傳統(tǒng)方法，該方法主要使用不同營養(yǎng)成分的固體培養(yǎng)基對樣品中可培養(yǎng)的微生物進行分離培養(yǎng)，根據(jù)菌落形態(tài)及菌落數(shù)來檢測微生物的數(shù)量及種類[5,26]。霉菌對儲糧危害最大，而儲糧霉菌普遍具有耐高滲透壓的特性。因此，在本實驗中采用高鹽察式培養(yǎng)基對樣品攜帶的霉菌進行培養(yǎng)。檢測結(jié)果見圖6。

圖6 平板培養(yǎng)法霉菌檢出情況(180 d)

由圖6可知，稻谷和糠皮層初始樣品的菌落形成單位(CFU/g)數(shù)量級分別在2.0和3.0左右，相差1個數(shù)量級范圍。在25 ℃及以上溫度儲藏，稻谷和糠皮層的霉菌檢出量出現(xiàn)增加且呈現(xiàn)緩慢增長趨勢，且稻谷的檢出量均高于糠皮層1～2個數(shù)量級。可見，稻殼對糙米起到了一定的保護作用。

2.5 三種檢測方法比較分析

由2.2～2.4中三種方法的檢測結(jié)果可見，在儲藏150～180 d內(nèi)霉菌的生長基本趨于穩(wěn)定，且在實際儲糧中霉菌的檢測主要以稻谷原糧為主，因此，將不同溫度下儲藏180 d的稻谷樣品經(jīng)三種方法檢出的結(jié)果進行Tukey檢驗，結(jié)果見表1。

由表1可知，隨著儲藏溫度的升高，三種方法的檢出量都呈增長的趨勢，即儲藏溫度越高，檢出量越大。電鏡賦值法在初始樣品和15 ℃下儲藏樣品中均無檢出，在20 ℃和25 ℃下的檢出量有顯著性差異；孢子計數(shù)法在原始樣品中無檢出，各溫度下儲藏180 d后均有檢出，且在15 ℃和20 ℃下的檢出量有顯著性差異；平板培養(yǎng)法在15 ℃和20 ℃下的檢出量與原始樣品之間無顯著性差異，在25 ℃及以上溫度檢出結(jié)果與原始樣品之間有顯著性差異。與平板培養(yǎng)法和電鏡賦值法相比較，真菌孢子計數(shù)法在霉菌生長量較少的情況下即可檢出，且在檢出量較少的情況下能區(qū)分不同處理之間的差異性，因此，能更早地發(fā)現(xiàn)霉菌的生長。從不同溫度下儲藏180 d 稻谷樣品的檢出情況來看，三種方法的靈敏度排序為孢子計數(shù)法>電鏡賦值法>平板培養(yǎng)法。

表1 不同溫度下儲藏180 d的稻谷樣品檢出情況的多重比較

掃描電子顯微鏡是一種大型精密儀器，廣泛用于觀察固體物質(zhì)表面的超微結(jié)構(gòu)，所拍攝圖像的放大倍數(shù)和分辨率高，真實、清晰、并富有立體感。糧食行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中的真菌孢子計數(shù)法因操作簡單、快速，靈敏度高，成本低，已作為一種糧食霉變早期檢測方法在各大糧庫中使用。平板菌落培養(yǎng)計數(shù)法作為傳統(tǒng)的微生物檢測方法，廣泛應(yīng)用于糧食儲藏期間不同霉菌種類的研究。對三種檢測方法的操作過程、儀器設(shè)備要求，以及在本實驗中的檢測結(jié)果進行比較，結(jié)果見表2。

表2 三種檢測方法比較

掃描電子顯微鏡觀察賦值法在實驗前需要做噴金處理，一批次可觀察的糧粒數(shù)量有限。因觀察視野放大倍數(shù)較大，單個樣品單面全范圍掃描觀察耗時較長。掃描觀察過程中還發(fā)現(xiàn)，霉菌菌絲和孢子在糧粒表面分布不均勻，不同視野內(nèi)分布密度有差異，在同一批次糧粒間生長分布差異較大，造成檢測結(jié)果重復(fù)性較差。此外，掃描電鏡屬大型精密儀器，設(shè)備的規(guī)范性操作要求高，設(shè)備本身的購買和維護費用很高，單個樣本的檢測成本偏高。因此，掃描電子顯微鏡更適用于糧食表面附著霉菌結(jié)構(gòu)的精細觀察，針對不同區(qū)域分布密度的賦值累加比較的分析方法還有待進一步優(yōu)化。

孢子計數(shù)法分為孢子洗脫和孢子計數(shù)兩部分[8]，操作簡單，在孢子識別計數(shù)過程中需要具備一定的微生物學(xué)基礎(chǔ)，糧食儲藏從業(yè)人員有一定的霉菌基礎(chǔ)知識，稍加培訓(xùn)即可獨立操作。收集糧食樣品后，在3～5 min內(nèi)便能得到檢測結(jié)果。檢測所需的設(shè)備主要是生物顯微鏡，儀器成本低，單個樣品檢測成本不到1元，在糧食儲備庫檢化驗室普及的可能性高。因此，孢子計數(shù)法更適用于儲糧霉變的早期檢測，但該方法主要對洗脫出的所有霉菌孢子進行檢測，無法判斷洗脫出的霉菌孢子是否有活性，檢測結(jié)果偏高。

平板培養(yǎng)法的操作步驟主要有孢子洗脫和孢子培養(yǎng)，檢測過程需要提供無菌環(huán)境，對檢測人員的專業(yè)技能及實驗條件要求較高，糧食行業(yè)操作難度較大[27-29]。平板培養(yǎng)法將樣品表面洗脫的有活性的霉菌培養(yǎng)成菌落，可對感染的真菌進行初步鑒定。但由于培養(yǎng)條件與實際倉儲環(huán)境和以糧食為營養(yǎng)基質(zhì)的環(huán)境有較大差別，不能真實反映儲糧環(huán)境中正常生長霉菌的類群，檢測結(jié)果偏低，且培養(yǎng)時間至少在5～7 d，檢測結(jié)果存在一定的滯后性，檢測時效性較差[30]。

綜上所述，本研究所使用的三種檢測技術(shù)各有優(yōu)缺點，在應(yīng)用中需根據(jù)實際需求進行選擇，多種方法相結(jié)合可更準(zhǔn)確地反映儲糧中霉菌的生長情況。

3 結(jié)論

綜合上述三種方法的檢測結(jié)果可知，含水量為14.6%的稻谷在15 ℃低溫條件下儲藏，可有效地抑制霉菌生長，20 ℃條件下雖有少量霉菌生長，但不會造成較大的危害，而在25 ℃及以上長期儲藏，存在較大的風(fēng)險。霉菌的生長與稻谷的水分密切相關(guān)，當(dāng)?shù)竟群拷抵?4.0%以下，霉菌生長基本趨于停滯?？刂苾Σ販囟群偷竟人挚捎行Ы档兔咕奈廴境潭?。

稻殼對稻谷具有天然保護作用。同一儲藏條件下，儲藏霉菌在稻谷表面的檢出時間早于糙米表面；同一儲藏時間，稻谷表面的檢出量大于糙米表面，相差1個數(shù)量級左右。稻谷加工過程中經(jīng)脫殼處理可顯著降低糙米的帶菌量。

掃描電鏡觀察賦值法、真菌孢子計數(shù)和平板菌落培養(yǎng)計數(shù)法三種方法在本研究中的霉菌檢出情況基本一致。三種方法各有優(yōu)缺點，相比較而言，真菌孢子計數(shù)法在霉菌生長量較少的情況下可檢出，且在檢出量較少的情況下能區(qū)分不同處理之間的差異性，能更早、更快地發(fā)現(xiàn)霉菌的生長，從而為糧食的安全儲藏提供預(yù)警信息。