田亞原 覃 譚 張旭林 覃繼肖王 旭 盧 琦,2 Paengkoum Pramote 田興舟,2

(貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院1，貴陽 550025)(貴州大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料研究所2，貴陽 550025)(泰國(guó)蘇蘭拉里理工大學(xué)3，呵叻 30000)

熱應(yīng)激是高溫高濕環(huán)境山羊產(chǎn)生熱量蓄積體內(nèi)，增強(qiáng)機(jī)體熱負(fù)荷引起的一系列非特異性生理反應(yīng)，是阻礙奶山羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素之一。如何有效地緩解反芻動(dòng)物熱應(yīng)激，提高生產(chǎn)性能，是現(xiàn)今亟需待解決的問題?；ㄇ嗨鼐哂袠O強(qiáng)的抗氧化活性，可與不穩(wěn)定自由基(free radical, FR)發(fā)生反應(yīng)，抑制鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。同時(shí)，花青素具無殘留、無污染、來源廣等優(yōu)點(diǎn)，且有抗氧化、抗炎癥等生理功能，對(duì)促進(jìn)家畜生長(zhǎng)、提高機(jī)體免疫力和抗氧化能力有積極作用[1]。Tian等[2]發(fā)現(xiàn)，奶山羊飼喂富含花青素紫玉米秸稈青貯飼料(purple corn stover silage，PSS)可顯著提高血漿超氧化物歧化酶(SOD)。周迪等[3]指出，花青素作為優(yōu)良的天然抗氧化劑源，有提高反芻動(dòng)物抗氧化能力、降低氧化應(yīng)激的作用。Matsuba等[4]飼予泌乳期奶牛紫玉米青貯飼料，對(duì)產(chǎn)奶量和奶成分無顯著影響，但可增強(qiáng)機(jī)體抗氧化性能。因此，植物源花青素飼料有提高反芻動(dòng)物免疫性能和抗氧化能力的作用，有緩解機(jī)體熱應(yīng)激的潛力。

當(dāng)奶山羊處于熱應(yīng)激環(huán)境中時(shí)，體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)功能發(fā)生紊亂，F(xiàn)R在體內(nèi)大量聚集且抗氧化酶清除FR的速率下降，造成機(jī)體損傷。研究指出，花青素不僅可直接消除體內(nèi)多余的FR數(shù)量，而且有通過激活Nrf2-ARE信號(hào)通路，間接抑制NF-κB活性，提高反芻動(dòng)物機(jī)體抗氧化性能的潛在作用，從而緩解機(jī)體熱應(yīng)激[3]。目前，花青素研究主要圍繞單胃動(dòng)物或其他草食動(dòng)物展開，反芻動(dòng)物亦多以瘤胃體外產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)為主，現(xiàn)有研究鮮見花青素緩解奶山羊熱應(yīng)激的報(bào)道。因此，本試驗(yàn)旨在研究富含花青素PSS對(duì)熱應(yīng)激奶山羊能量利用、血漿代謝和抗氧化參數(shù)的影響，為廣泛應(yīng)用這種新型綠色非常規(guī)飼料資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用4×4拉丁方試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取8只體況良好的經(jīng)產(chǎn)薩能奶山羊[體重(41.50±1.84) kg；平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差]隨機(jī)分為4組，四種日糧處理分別為(粗飼料均占日糧干物質(zhì)50%)：粗飼料為稻草日糧組(NC)、黏玉米秸稈青貯飼料(sticky corn stover silage，SSS)組(PC1)、SSS+1 g/d商業(yè)紫玉米花青素提取物組(PC2)與紫玉米秸稈青貯飼料組(AR)，見表1。每個(gè)處理組8個(gè)重復(fù)(n=8)。每期試驗(yàn)周期持續(xù)21 d，其中最后7 d為樣品采集期。紫玉米花青素提取物購(gòu)于南京草本源生物科技有限公司。通過高效液相色譜儀檢測(cè)，PSS總花青素水平高于SSS(74.55 mg/100 g DM vs. 28.65 mg/100 g DM)。羊只單籠飼養(yǎng)，自由采食和飲水，分別于08:00與17:00飼喂飼糧。羊只營(yíng)養(yǎng)需要參考NRC[5]，各組飼糧均一次配齊并置于干燥通風(fēng)處保存。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))%

1.2 檢測(cè)指標(biāo)

1.2.1 溫濕指數(shù)

將溫濕度記錄儀懸掛于羊圈中部與羊只等高處，測(cè)定試驗(yàn)周期每天06:00、14:00和20:00舍內(nèi)的溫度和相對(duì)濕度，根據(jù)Minka和Ayo[6]計(jì)算溫濕指數(shù)(THI)。數(shù)據(jù)顯示試驗(yàn)周期內(nèi)，羊舍全天平均溫度為26.10～37.20 ℃，總平均溫度為30.54 ℃；全天平均濕度為44.00%～94.00%，總平均濕度為72.66%；全天平均溫濕指數(shù)為76.55～90.12，總平均溫濕指數(shù)為82.28。因此，試羊處于中重度熱應(yīng)激環(huán)境范圍。

1.2.2 飼糧營(yíng)養(yǎng)成分

利用四分法將配好的各組試驗(yàn)飼糧采集500 g于65 ℃烘箱中烘干后，室溫回潮24 h過1 mm篩粉碎轉(zhuǎn)入自封袋制備風(fēng)干樣。參照AOAC[7]測(cè)定飼糧干物質(zhì)(DM)、有機(jī)物(OM)、粗蛋白質(zhì)(CP)、總能(GE)、中性洗滌纖維(NDF)及酸性洗滌纖維(ADF)。運(yùn)用Parr 6200全自動(dòng)氧彈量熱儀分析樣品能量。

1.2.3 玉米秸稈青貯飼料蛋白和能量?jī)r(jià)值參數(shù)

檢測(cè)玉米秸稈青貯飼料的中性洗滌不溶蛋白(NDICP)、中性洗滌不溶氮(NDIN)、酸性洗滌不溶蛋白(ADICP)、酸性洗滌不溶氮(ADIN)；維持水平總可消化養(yǎng)分(TDN1X)、維持水平消化能(DE1X)、生產(chǎn)水平消化能(DEP)、生產(chǎn)水平代謝能(MEP)和生產(chǎn)水平泌乳凈能(NELP)預(yù)測(cè)參照文獻(xiàn)[8]。每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。

1.2.4 能量代謝參數(shù)

每期最后7 d進(jìn)行消化代謝試驗(yàn)，全收糞尿法收集糞樣及尿樣，每天準(zhǔn)確稱量鮮糞并混勻，取10%作為樣品裝入自封袋中，尿液經(jīng)4層紗布過濾后記錄體積，取10%作為試樣，每期的糞樣和尿液混合均勻后置于-20 ℃保存?zhèn)錅y(cè)。待試驗(yàn)結(jié)束后，將糞樣置于65 ℃烘箱中烘至恒重，室溫回潮24 h過1 mm篩粉碎轉(zhuǎn)入自封袋制備風(fēng)干樣，尿樣解凍測(cè)定能量。通過公式計(jì)算能量平衡狀態(tài)。消化能(DE)=總能(GE)-糞能(FE)；代謝能(ME)=DE-尿能(UE)-甲烷能(Eg)；總能表觀消化能=DE/GE×100%；總能利用率=ME/GE×100%；消化能利用率=ME/DE×100%。

Eg根據(jù)Pelchen和Peters[9]方程預(yù)測(cè)。

Eg/GE=1.3+0.112D+L(2.37-0.05D)

式中：Eg/GE為甲烷占總能的百分比(%)；D為總能消化率(%)；L為飼養(yǎng)水平(維持飼養(yǎng)的倍數(shù))。

1.2.5 血漿代謝與抗氧化參數(shù)

在每個(gè)周期的20 d，通過K3-EDTA VACUETTE?真空管于晨飼前(0 h)和飼喂后(2、4 h)從頸靜脈采血10 mL，于1 788.6×g 4 ℃離心機(jī)離心15 min，上層血漿轉(zhuǎn)移至1.5 mL試管，儲(chǔ)存在-80 ℃?zhèn)錅y(cè)。葡萄糖(Glu)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、還原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Sigma-Aldrich公司。

2型糖尿?。═2DM）是一種臨床常見的代謝紊亂疾病，其主要特征為慢性高血糖以及高血糖致使的多器官損害并發(fā)癥。T2DM的特征性病理生理損害為胰島B細(xì)胞功能失調(diào)以及機(jī)體的胰島素抵抗（IR）。T2DM引起的最常見的病理改變包括糖尿病神經(jīng)病變以及糖尿病血管病變，這兩種病變成為糖尿病慢性并發(fā)癥的基礎(chǔ)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用Excel 2010對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行基本整理后，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 9.1.3統(tǒng)計(jì)分析軟件中的MIXED模板進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)分析模型為：Yij(k)=μ+Ri+Cj+τ(k)+εij(k)，式中：Yij(k)為觀測(cè)值，μ為總平均值，Ri為周期隨機(jī)效應(yīng)，Cj為奶山羊隨機(jī)效應(yīng)，τ(k)為組別固定效應(yīng)，εij(k)為均值為0，方差σ2的隨機(jī)誤差。差異顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白和能量?jī)r(jià)值參數(shù)

由表2可知，SSS和PSS的蛋白和能量?jī)r(jià)值參數(shù)(NDICP、NDIN、ADICP、ADIN、TDN1X、DE1X、DEP、MEP和NELP)差異均不顯著(P>0.05)。

表2 紫玉米秸稈青貯飼料的蛋白和能量?jī)r(jià)值參數(shù)

2.2 能量代謝參數(shù)

各組間干物質(zhì)采食量(DMI)差異不顯著(P>0.05)，見表3。相似地，4組間GE攝入量、UE、Eg無顯著(P>0.05)差異。NC組FE顯著(P<0.05)低于PC2組和AR組。與其他組相比，NC組顯示較低水平(P<0.05)的DE、ME、DE/GE和ME/GE。特別地，AR組ME/DE顯著(P<0.05)高于其他組。

表3 紫玉米秸稈青貯飼料對(duì)奶山羊能量代謝的影響

2.3 血漿代謝和抗氧化參數(shù)

由表4可見，對(duì)Glu，NC組顯著(P<0.05)低于PC2組和AR組。4組間山羊血漿AST和ALT差異均不顯著(P>0.05)。PC1、PC2和AR的UN顯著(P<0.05)低于NC組。對(duì)GST，PC2與AR組間差異未達(dá)顯著(P>0.05)水平，但均顯著(P<0.05)高于NC和PC1組。不同地，PC2與AR組間差異未表現(xiàn)差異顯著(P>0.05)，但均顯著(P<0.05)低于NC和PC1組。

表4 紫玉米秸稈青貯飼料對(duì)奶山羊血漿代謝和抗氧化參數(shù)的影響

3 討論

3.1 紫玉米秸稈青貯飼料的蛋白和能量?jī)r(jià)值參數(shù)

能量是衡量飼糧營(yíng)養(yǎng)價(jià)值重要指標(biāo)之一，通過檢測(cè)奶山羊PSS的蛋白和能量?jī)r(jià)值參數(shù)，可綜合評(píng)價(jià)PSS的內(nèi)在品質(zhì)?；ㄇ嗨厥且环N有效的抗氧化劑和FR清除劑，有保護(hù)植物免受外界生物和非生物脅迫損傷的作用[10]。此外，自然界的花青素均以糖苷形式存在，花青素中的糖苷可能參與碳水化合物代謝，有為機(jī)體提供能量的潛力[11-12]。但是，花青素對(duì)山羊機(jī)體能量代謝的調(diào)控機(jī)制研究鮮見報(bào)道，尚待進(jìn)一步研究與驗(yàn)證。Suksombat和Junpanichcharoen[13]試驗(yàn)指出，反芻動(dòng)物攝入高濃度NELP的粗飼料，機(jī)體也會(huì)表現(xiàn)較高水平的NELP，更有利于機(jī)體的泌乳性能。本研究發(fā)現(xiàn)，SSS與PSS各項(xiàng)能量?jī)r(jià)值參數(shù)(DE1X、DEP、MEP、NELP)差異均較小，一方面，表明飼予PSS不會(huì)降低奶山羊能量需要，影響產(chǎn)奶量，為花青素緩解機(jī)體熱應(yīng)激奠定基礎(chǔ)；另一方面，說明在給奶山羊提供能量方面，兩者粗飼料的功能可能基本相同，可以實(shí)現(xiàn)能量相互替換[14]。

3.2 紫玉米秸稈青貯飼料對(duì)奶山羊能量代謝參數(shù)的影響

反芻動(dòng)物汗腺不發(fā)達(dá)，處于高溫環(huán)境下的山羊難以通過皮膚蒸發(fā)散熱調(diào)節(jié)體溫，更易發(fā)生熱應(yīng)激，影響生產(chǎn)性能。一方面，熱應(yīng)激奶山羊降低DMI攝入，不能滿足機(jī)體能量需要，消耗組織維持機(jī)體需要。另一方面，熱應(yīng)激奶山羊加快皮膚和肺部血流量，減少胃腸道血流量，導(dǎo)致胃腸黏膜和細(xì)胞受損，降低營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。奶山羊更喜食甜味飼糧，花青素較苦澀，可能降低動(dòng)物的采食量。本研究顯示各組間DMI差異較小(表3)，說明PSS不降低熱應(yīng)激奶山羊適口性。有趣地，與PC2比，AR組山羊顯示更高水平消化能利用率，可能與植物和提取物花青素在反芻動(dòng)物中的代謝吸收效率差異有關(guān)[15]。研究發(fā)現(xiàn)，花青素既能有效清除體內(nèi)過多FR，協(xié)助機(jī)體修復(fù)損傷細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞新陳代謝；又可促進(jìn)谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶的分泌，加強(qiáng)機(jī)體自身清除FR的能力[2]。據(jù)本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，富含花青素PSS有提高奶山羊消化能、代謝能、總能表觀消化率、總能利用率及消化能利用率的作用，因此，花青素有改善機(jī)體能量代謝的潛力。自然界少見游離的花青素，常與一個(gè)或多個(gè)葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖結(jié)合形成，花青素結(jié)構(gòu)中糖類物質(zhì)可能參與奶山羊中的能量代謝途徑，進(jìn)一步有提高體內(nèi)抗氧化酶活性、抑制體內(nèi)FR數(shù)量的作用，這也是將來研究熱點(diǎn)之一。

3.3 紫玉米秸稈青貯飼料對(duì)奶山羊血漿代謝和抗氧化參數(shù)的影響

肝臟是機(jī)體重要解毒器官，轉(zhuǎn)氨酶可用來判斷肝臟損害程度，是檢測(cè)肝功能重要指標(biāo)。熱應(yīng)激增加反芻動(dòng)物細(xì)胞膜通透性，胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶釋放入血，增加肝臟代謝負(fù)擔(dān)。研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物能量攝入與血漿AST和ALT水平呈正相關(guān)關(guān)系[16]。Hosoda等[17]試驗(yàn)指出，泌乳期奶牛補(bǔ)飼富含花青素紫玉米青貯飼料對(duì)ALT無顯著性影響，但可顯著降低血漿AST的濃度，這可能與攝入能量水平有關(guān)。本研究中，各組日糧等能等氮，且DMI差異不顯著(表3)，因此，奶山羊補(bǔ)飼PSS/紫玉米提取物不影響血漿AST和ALT濃度，說明PSS對(duì)熱應(yīng)激試羊肝臟代謝無副作用影響。

血液UN含量是動(dòng)物機(jī)體蛋白質(zhì)代謝的主要終末產(chǎn)物之一，高分解代謝狀態(tài)可引起UN含量升高。熱應(yīng)激降低奶山羊消化機(jī)能，可導(dǎo)致飼糧蛋白質(zhì)在瘤胃中降解為氨，經(jīng)由瘤胃吸收進(jìn)去血液造成氨濃度升高，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為尿素排出體外。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PC1、PC2、AR組顯示較高水平的能量利用效率(表3)，因此，在奶山羊飼糧中飼喂PSS對(duì)肝臟代謝負(fù)擔(dān)無副作用影響。Hosoda等[17]研究顯示，泌乳奶牛飼喂富含花青素紫玉米青貯飼料，顯示較高水平血漿UN，可能與飼糧較高水平蛋白質(zhì)有關(guān)。本研究所有試羊在飼養(yǎng)周期均處于健康狀態(tài)，飼糧蛋白質(zhì)水平一致，因此血漿UN水平無顯著性差異。

動(dòng)物發(fā)生熱應(yīng)激，易造成腸道內(nèi)缺氧缺血，誘發(fā)內(nèi)源性FR產(chǎn)生，F(xiàn)R可根據(jù)刺激機(jī)體時(shí)間的長(zhǎng)短與氧化應(yīng)激的程度誘導(dǎo)相關(guān)信號(hào)通路，影響機(jī)體健康。研究表明，花青素作為Nrf2的活化劑，可直接修飾Keap1存在的傳感器半胱氨酸，激活Nrf2并誘導(dǎo)具有抗氧化功能的細(xì)胞保護(hù)蛋白；同時(shí)間接抑制NF-κB信號(hào)通路，降低相關(guān)炎癥因子的基因表達(dá)，達(dá)到提高反芻動(dòng)物抗氧化性能的作用[3]。因此，花青素可通過增強(qiáng)機(jī)體Mn-SOD、Cu/Zn-SOD和GSH-Px 等mRNA表達(dá)提高動(dòng)物抗氧化能力[18]。GST是機(jī)體解毒過程的關(guān)鍵酶，催化谷胱甘肽結(jié)合反應(yīng)起始步驟。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在奶山羊飼糧中補(bǔ)飼PSS或紫玉米提取物可顯著增強(qiáng)血漿GST濃度。GSH參與體內(nèi)氧化還原過程，可與過氧化物或FR反應(yīng)，減弱氧化應(yīng)激?；ㄇ嗨貨]有提高熱應(yīng)激奶山羊血漿GSH作用，可能是SOD將毒性更高的超氧陰離子自由基轉(zhuǎn)化為毒性較低的過氧化氫，對(duì)熱應(yīng)激奶山羊已有緩解作用[2]。MDA是氧化反應(yīng)終產(chǎn)物，可引起核酸、蛋白質(zhì)等生命大分子交聯(lián)聚合，降低機(jī)體抗氧能力?；ㄇ嗨啬転镕R提供電子，預(yù)防FR氧化鄰近細(xì)胞，保持處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)宿主動(dòng)物FR平衡。因此，PSS或紫玉米提取物可顯著降低血漿MDA水平。這說明花青素可提高奶山羊血漿抗氧化酶的活性，減少機(jī)體過程中FR和過氧化物等的生成，有提高機(jī)體抗氧化性能，進(jìn)一步緩解奶山羊熱應(yīng)激的潛力。Ngo Thi[19]報(bào)道，飼予生長(zhǎng)肉羊富含花青素象草青貯飼料有提升血漿GST和GSH，降低MDA水平的趨勢(shì)。Hosoda等[20]試驗(yàn)表明，在綿羊飼糧中補(bǔ)飼富含花青素青貯稻草有改善機(jī)體血漿抗氧化酶活性的作用。

4 結(jié)論

富含花青素PSS是一種值得推廣的優(yōu)良粗飼料，因?yàn)镻SS蛋白和能量?jī)r(jià)值參數(shù)與SSS差異較小；PSS可提高熱應(yīng)激奶山羊消化能利用率，改善能量利用效率；PSS對(duì)熱應(yīng)激奶山羊血漿代謝參數(shù)無副作用影響，可提高血漿抗氧化能力，有助于緩解山羊熱應(yīng)激。