王寅宇 周喆聿

肺癌是最為常見的癌癥，2018年我國新發(fā)肺癌774323例，發(fā)病率居于我國癌癥的首位，占總病例的21.9%[1]。而在所有肺癌患者中，有80%為非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)患者[2]。肺癌在中醫(yī)上屬于“肺積”“息賁”等范疇，其發(fā)病機制與腎精不足有關[3]。六君子湯則有益氣補腎的功效。臨床上也有用六君子湯輔助化療的實例[4]。但中藥方劑普遍存在多靶點、多途徑、多環(huán)節(jié)的治療特點，有效成分與靶點之間相互作用不明確等問題，因此六君子湯治療NSCLC的潛在機制仍不明了。

網絡藥理學是近年來基于高通量組學數(shù)據分析、計算機模擬技術及網絡數(shù)據庫檢索發(fā)展而來的研究方法[5]，用整體、系統(tǒng)的相互作用關系網絡來探究中藥方劑的藥理機制，與中醫(yī)藥研究的整體觀、辨證施治的特色不謀而合[6]。因此，本研究旨在利用網絡藥理學方法探討六君子湯治療NSCLC的作用機制，為六君子湯發(fā)揮作用的機制提供參考和依據。

1 材料與方法

1.1 中藥化學成分的搜集和整理六君子湯由人參、白術、茯苓、甘草、陳皮和半夏6味中藥組成。利用TCMSP數(shù)據庫(https://tcmspw.com/tcmsp.php)依次檢索其全部化學成分，并以口服利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18[7]作為活性化合物的篩選條件(其中甘草的篩選條件為OB≥50%，DL≥0.18)[8]。

1.2 中藥預測作用靶點的搜集與整理通過Pubchem數(shù)據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)搜集活性化合物成分的SMILES結構，并上傳至Swiss Target Prediction平臺(http://www.swisstarget prediction.ch/)，應用反向藥效團匹配方法得到虛擬篩選結果(篩選條件為probability>0)，運用Microsoft Excel 2010將所得結果進行刪重整理。

1.3 NSCLC疾病靶點的搜集與整理以“non-small cell lung caner”為關鍵詞在GeneCards(https://www.genecards.org/)、PharmGKB(https://pharmgkb.org/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)[9]數(shù)據庫搜索疾病靶點，匯總成表格并整合刪重，得到結果保存以備后續(xù)分析。

1.4 交集靶點的篩選及蛋白質—蛋白質相互作用(PPI)網絡的構建采用R軟件(v4.0.2)并引用venn package,篩選出中藥預測作用靶點與NSCLC疾病靶點的交集，繪制韋恩圖，并用String數(shù)據庫(https://string-db.org/)對交集靶點進行PPI網絡構建，其中將生物種類設為“Homo sapiens”，最低相互作用置信度得分設為“custom value”(0.99)，簡化顯示設為“隱藏網絡中斷開連接的節(jié)點”，其他參數(shù)保持默認設置，將得到的數(shù)據以TSV.格式導出。

1.5 核心靶點的篩選將String中得到的PPI網絡圖上傳至Cytoscape 3.7.2(https://cytoscape.org/)軟件，使用cytoNCA插件，以網絡中節(jié)點“Betweenness”“Closeness”“Degree”等參數(shù)大于中位值為條件對所得信息進行2次篩選，挑選出核心靶點。

1.6 基因本體(GO)功能富集分析為了說明中藥化合物的靶點在基因功能中的作用，利用R軟件(v 4.0.2)并引用BiocManager package(clusterProfiler、org.Hs.eg.db、enrichplot和ggplot2)對篩選后的核心靶點進行GO功能富集分析。

1.7 基因組百科全書(KEGG)功能富集分析采用R軟件(v 4.0.2)并引用BiocManager package(clusterProfiler、org.Hs.eg.db、enrichplot、ggplot2和pathview)對核心靶點進行KEGG通路富集分析，繪制氣泡圖及通路圖。

2 結果

2.1 活性化合物及靶點的篩選通過TCMSP分別搜索六君子湯中的6味中藥，得到化合物104個，其中人參22個，白術7個，茯苓15個，甘草42個，陳皮5個，半夏13個，經去重后共得到101個化合物，記錄化合物的MOL ID及名稱，并將其作為候選化合物，通過Pubchem平臺搜索化合物的SMILES結構。將化合物的SMILES結構提交到Swiss Target Prediction平臺，屬性設置為“Homo Sapiens”，得到6703個預測靶點。刪去重復的靶點，共獲得944個預測靶點。

2.2 疾病相關靶點的篩選與整理從GeneCards、PharmGKB和TTD數(shù)據庫分別搜集到4910、305、154個疾病靶點，共計5369個疾病靶點，刪重后得到5152個靶點。

2.3 交集靶點的篩選及蛋白質—蛋白質相互作用(PPI)網絡的構建將疾病與藥物的靶標基因取交集即可得到六君子湯治療NSCLC的潛在靶點，共得579個交集靶點。見圖1(a)。將579個交集靶點上傳至String數(shù)據庫即可得到PPI圖，最低相互作用置信度得分設為”custom value”(0.99)。見圖1(b)。共有579個節(jié)點，308條邊，平均節(jié)點數(shù)為1.06，網絡節(jié)點代表著各個靶點，線條代表著靶點之間的聯(lián)系。

圖1 中藥和NSCLC靶點交集的韋恩圖(a)及交集靶點的PPI圖(b)

2.4 核心靶點的篩選將String中得到的PPI網絡圖上傳至Cytoscape 3.7.2軟件，使用cytoNCA插件進行分析，以網絡中節(jié)點“Betweenness”“Closeness”“Degree”等參數(shù)大于中位值為條件共篩選2次得18個核心靶點。見圖2。

圖2 核心靶點圖

2.5 GO功能富集分析利用R軟件(v 4.0.2)對18個核心靶點進行GO功能富集分析，以Pvalue<0.05為篩選條件，共得到1482條富集結果。其中生物過程(Biological Process, BP)相關的共1339個，主要包括細胞因子合成的正向調控、骨髓細胞分化、細胞有絲分裂G1/S期的轉換等方面；細胞組成(Cellular Component, CC)相關的條目46個，主要有轉錄調節(jié)復合物、轉移酶復合物、膜筏、細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復合物等方面；分子功能(Molecular Function,MF)相關的條目97個，主要包括絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、激素受體結合、RNA聚合酶II特異性DNA結合轉錄因子結合、DNA結合轉錄因子結合等方面。見表1。

表1 GO富集分類結果前10條目

2.6 KEGG 富集分析采用R軟件(v 4.0.2)對核心靶點進行KEGG通路富集分析，以Pvalue<0.05為篩選條件，共得到131個相關通路，如通路hsa05223NSCLC通路。見圖3。并根據qvalue的大小將KEGG富集結果前30條繪制成氣泡圖。見圖4。

注：標紅基因為六君子湯核心靶點對該通路的影響位點

圖4 KEGG富集氣泡圖

3 討論

六君子湯具有益氣補腎、補氣益脾的功效，有學者通過整理文獻發(fā)現(xiàn)六君子湯在臨床上可以治療腫瘤疾病，如胃癌、肺癌、腸癌等，且具有顯著的臨床效果。本研究提示基于網絡藥理學分析了六君子湯治療NSCLC的作用機制可能是通過CCND1、STAT3、PIK3CA、AKT1、CDK6、CDK4、EGFR、HRAS、MAPK3等9個基因位點作用于NSCLC通路。除了NSCLC通路，六君子湯的作用機制還可能與PD-L1在腫瘤中的表達與PD-1檢查點通路、JAK-STAT、PI3K-Akt、VEGF、p53、Ras、mTOR、TGF-β、MAPK、AMPK、Wnt以及Notch信號通路等有關。

現(xiàn)代藥理研究證明，黃芩素對NSCLC細胞的增殖能力存在抑制作用，并下調細胞內Notch1和hes-1的表達，通過抑制Notch信號通路來達到治療的目的[10]。You[11]的實驗則證明了黃芩苷可以使腫瘤細胞內SIRT1和AMPK表達的siRNA含量降低，通過AMPK通路抑制腫瘤細胞的增殖。此外，Liao等[12]的研究將蟲草素與阿帕替尼相結合作用于腫瘤細胞，通過分子對接及western blot等技術測定腫瘤細胞內蛋白的改變，發(fā)現(xiàn)VEGF/PI3K/Akt通路被抑制，腫瘤細胞遷移和侵襲能力減弱。此外，Teng等[13]通過對腫瘤細胞使用中藥延齡草的提取成分重樓皂苷，發(fā)現(xiàn)mTOR通路被重樓皂苷抑制，使腫瘤細胞發(fā)生自噬現(xiàn)象，達到抑制腫瘤細胞增殖的效果。

隨著研究的深入，越來越多的與NSCLC相關的通路被人們發(fā)現(xiàn)，通過將人體雙肺正常組織與NSCLC組織進行比較，Kang等[14]發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中TGF-βRⅡ的表達部分降低，表明NSCLC的發(fā)生機制技能與TGF-β信號通路有關。Wu等[15]則在研究中發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中IL-17AR的表達明顯升高，而且IL-17RA和p38 MAPK信號通路的下游效應子MMP-2和MMP-9的含量升高明顯，提示了IL-17信號通路也可能是NSCLC的發(fā)生有關。Levallet等[16]通過腫瘤組織進行免疫組織化學測定，發(fā)現(xiàn)其中β-微管蛋白III(TUBB3)出現(xiàn)高表達現(xiàn)象，提示可能與K-Ras基因突變有關，為之后的藥物研究提供指導。

通過對腫瘤組織的研究，許多NSCLC的潛在靶點逐漸被人們發(fā)現(xiàn)，在許多腫瘤組織中均可發(fā)現(xiàn)細胞毒性T淋巴細胞抗原4(CLTA4)的表達，但是具體機制并不明了，近年來有研究顯示，通過MEK和ERK磷酸化的EGFR途徑介導，抗CLTA4可以誘導腫瘤細胞PD-1的表達，使腫瘤細胞出現(xiàn)免疫逃逸現(xiàn)象[17]。有藥物研究證明，HIF-1α/VEGF信號通路抑制劑PX-478能顯著降低HIF-1α和VEGF蛋白的表達并抑制細胞增殖活性[18]。He等[19]研究發(fā)現(xiàn)抑制HEATR1可以使核糖體的生物發(fā)生減少，作用于p53信號通路，達到治療NSCLC的效果。Li等[20]則在實驗中證明了OTUB2可以激活mTOR通路，從而促進了腫瘤的發(fā)展進程，Zhang等[21]亦在腫瘤組織中的組蛋白甲基轉移酶(G9a)可通過Wnt通路影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，為NSCLC的靶向治療提供了一個新的潛在靶點。

本研究采用網絡藥理學的方法，探究六君子湯辨證治療NSCLC的有關成分、靶點和通路的潛在作用機制，充分體現(xiàn)六君子湯治療NSCLC多靶點、多途徑、多通路的特點，在分子水平總結了六君子湯治療NSCLC的機制，為NSCLC的中醫(yī)藥治療提供了理論依據。