吳陳興 宋洪旺 付曉君 李守巍

1.首都醫(yī)科大學三博腦科醫(yī)院神經外科，北京 100093；2.中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院急診科，遼寧沈陽 110004

膠質瘤是中樞神經系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤，發(fā)病率為22.52/106[1]。70%～80%的較低級別膠質瘤發(fā)生異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）突變，且是腫瘤發(fā)生的驅動基因[2-3]。2016 年世界衛(wèi)生組織（world health organization，WHO）中樞神經系統(tǒng)腫瘤分類首次引入IDH 突變作為膠質瘤的重要分類指標，并明確IDH 突變型（IDH mutant type，IDH-mut）和IDH野生型（IDH wild type，IDH-wt）膠質瘤是兩種具有不同生物特征的亞型[4]，IDH-mut 膠質瘤具有更好的預后[5]。IDH 突變的發(fā)現(xiàn)引起了對癌癥代謝的廣泛關注。

目前IDH-wt 膠質瘤預后差，缺乏有效治療手段。本文通過差異代謝基因聚類將IDH-wt 膠質瘤分成三種代謝亞型（C1、C2 和C3 型）。C1 型預后與IDH 突變型相似；C2、C3 型預后差。進一步利用隨機森林法篩選C1 型前5 個最顯著特征基因，簡化C1 型診斷模型以增加臨床應用的可行性。用此分型精確判斷不同IDH-wt膠質瘤預后，指導腦膠質瘤患者的個體化治療。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)采集

本研究使用2015 年1 月至2020 年1 月來自中國腦膠質瘤基因組圖譜計劃（Chinese glioma genome atlas，CGGA）（http：//www.cgga.org.cn）數(shù)據(jù)庫中294 例患者臨床資料及組織信使RNA（messenger RNA，mRNA）芯片（RNA-array）數(shù)據(jù)，包含IDH 狀態(tài)（IDH-mut/wt）及年齡、性別、組織學分級及生存預后情況等[6]。納入標準：①發(fā)病年齡≥18 歲；②病理診斷為大腦半球彌漫性膠質瘤且符合2016 WHO 分類指南[4]。排除標準：①局限性膠質瘤；②彌漫中線膠質瘤；③小腦或脊髓膠質瘤。研究經首都醫(yī)科大學三博腦科醫(yī)院醫(yī)學倫理審查委員會批準，并符合赫爾辛基宣言[7]的原則。

1.2 分析方法

加權相關網絡分析（weighted correlation network analysis，WGCNA）旨在尋找共同表達的基因模塊，并探索基因網絡和感興趣表型之間的聯(lián)系，在共同表達網絡中，節(jié)點與基因相對應，連接強度由表達譜之間的成對相關性決定。加權網絡使用Pearson 相關矩陣的軟閾值來確定兩個基因之間的連接強度[8]。本研究對CGGA 數(shù)據(jù)庫294 例膠質瘤RNA-array 數(shù)據(jù)進行WGCNA 分析。相關矩陣的軟閾值定義為9 次冪，基于生成的連接矩陣，實施拓撲重疊計算[8]。通過對拓撲重疊進行平均連鎖層次聚類，將具有高度相似表達的基因分組聚類。進一步應用動態(tài)混合樹切割算法來切割層次聚類樹，計算基因模塊與IDH-mut/wt 狀態(tài)之間的相關性。

應用WGCNA 篩選與IDH 狀態(tài)相關基因，對所篩選基因進行差異表達分析得到差異表達基因（differentially expressed genes，DEG）。參照KEGG 代謝通路的基因集（http：//www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/genesets.jsp?collection=CP：KEGG），對DEG 中的代謝相關基因進行聚類分析，根據(jù)聚類分析結果將IDH-wt膠質瘤分型。應用Kaplan-Meier 生存分析及1 年及3 年生存率驗證新分型意義。應用隨機森林法篩選亞型的特征基因集，簡化診斷模型以增加臨床應用的可行性。

1.3 統(tǒng)計學方法

本研究使用R 語言（4.0.3 版）、SPSS（21.0 版）軟件和GraphPad Prism（7.0 版）軟件對數(shù)據(jù)進行分析。WGCNA 檢測應用“WGCNA 軟件包”。“ggplots 軟件包”繪制熱圖。使用“random Forest 軟件包”進行隨機森林分析。Log-Rank 檢驗用于分析兩組生存時間估計值差異性。計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 基于IDH-mut/wt 狀態(tài)的代謝基因鑒定

通過WGCNA 從CGGA 數(shù)據(jù)庫的294 例膠質瘤RNA-array 數(shù)據(jù)集中識別出10 個與IDH 狀態(tài)（IDHmut/wt）相關的基因模塊（圖1）。參照KEGG代謝通路的基因集鑒定出42 個代謝相關差異基因，其中14 個基因表達水平與IDH-mut 呈正相關，28 個基因呈負相關（P ＜0.05）（圖2）。應用這些基因對IDH-wt膠質瘤進行聚類，根據(jù)聚類結果將IDH-wt 膠質瘤分成3 個亞型，分別用C1、C2 和C3 標記（圖3）。

圖1 WCGNA 鑒定出10 個與IDH 狀態(tài)相關的基因模塊

圖2 代謝相關的差異基因

2.2 新分型的臨床預后價值

1 年及3 年生存率分析顯示，IDH-mut 膠質瘤患者的1 年及3 年生存率分別為65.1%與62.2%，C1 型膠質瘤患者1 年及3 年生存率分別為63.2%和60.0%，C2 型膠質瘤患者1 年及3 年生存率分別為5.9%和3.0%，C3 型膠質瘤患者1 年及3 年生存率分別為17.4%和9.0%。見圖4。

2.3 構建隨機森林模型診斷IDH-wt C1

應用42 個差異代謝基因構建隨機森林預測模型（圖5A）。根據(jù)MDG 值，選擇對分類貢獻最大的前5 位基因（TK1、GPX8、RRM2、NNMT 和GPX7，見圖5B）。應用前5 位基因再次構建隨機森林預測模型。隨機選擇CGGA 數(shù)據(jù)庫中2/3 數(shù)據(jù)作為訓練組，其他的作為測試組。新模型中TK1、GPX8、RRM2、NNMT 和GPX7的MDG 值分別為13.98、13.94、10.48、10.37 和9.54。訓練組的分類準確度為95.12%，靈敏度為93.75%，特異性為95.60%。OBB 為4.88%。測試組分類準確度為97.44%，靈敏度為83.33%，特異性為100.00%。

圖5 差異代謝基因構建隨機森林預測模型

3 討論

腫瘤代謝改變被認為是維系腫瘤細胞形成及生長的“10 大特征”之一[9]。IDH 突變是最常見的代謝酶基因突變類型，為腦膠質瘤發(fā)生的早期分子事件，IDH活性位點突變形成一種新形態(tài)酶，催化α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，α-KG）轉化為R-2-羥戊二酸（R-2-hydroxyglutarate，R-2HG），R-2HG 積累引起基因組廣泛超甲基化，表觀激活癌基因、致癌[10-11]。IDH-wt 膠質瘤通常被認為惡性程度高、預后差，且缺乏有效治療手段[12]。但IDH-wt 膠質瘤包含多種亞型，“cIMPACTNOW 更新4 提出：具有H3 K27-或H3 G34-突變，MYB/MYBL 改變，BRAF V600 突變等的IDH-wt 彌漫性星形細胞瘤亞群具有較好的臨床預后，不應列為高度惡性腫瘤[13]。2020 年歐洲神經腫瘤協(xié)會（European Association for Neuro-Oncology，EANO）成人彌漫性膠質瘤診斷與治療指南明確指出：IDH-wt 膠質瘤是一組具有異質性的腫瘤，有待通過分子生物學研究將其中具有IDH-wt 膠質母細胞瘤分子特征的惡性腫瘤和具有生物學相對惰性生長特性腫瘤（諸如類似兒童彌漫性膠質瘤）加以區(qū)分，并進行個體化治療[14]。本研究采用WGCNA 方法對CGGA 數(shù)據(jù)庫的轉錄組數(shù)據(jù)進行分析篩選出與IDH 狀態(tài)相關的代謝基因，并根據(jù)其聚類情況將IDH-wt 膠質瘤分為C1、C2 和C3 型。生存分析表明，IDH-wt C2、C3 型的預后差，IDH-wt C1與IDH-mut 生存率相近。此分型對精確判斷不同IDH-wt 膠質瘤預后具有指導意義。

本研究中經差異表達分析和相關性分析所取得的代謝基因，在IDH-mut 和IDH-wt 膠質瘤中具有顯著表達差異（圖2），其產物多數(shù)是腫瘤細胞氨基酸、核苷酸等代謝通路中的關鍵酶，例如谷氨酸脫氫酶1（glutamate dehydrogenase1，GLUD1）、支鏈氨基酸轉氨酶1（branched-chain amino acid1，BCAT1）等。理解膠質瘤中關鍵代謝途徑將有助于鑒定更多的治療靶標，開發(fā)更有效的治療方法。

IDH-mut 膠質瘤細胞通過GLUD1 催化谷氨酸轉化為α-KG，促進膠質瘤祖細胞的生長[15]。本研究中IDH-mut 膠質瘤GLUD1 的表達水平明顯高于IDH-wt 膠質瘤，GLUD1 表達和IDH-mut 致癌驅動機制相關，谷氨酸代謝是膠質瘤潛在治療靶點。BCAT1 是支鏈氨基酸分解代謝的酶，BCAT1 高表達是IDH-wt 膠質瘤的特征。膠質瘤細胞中BCAT1 的減少可阻止谷氨酸的分泌，并導致腫瘤細胞增殖和侵襲性降低[16-17]。BCAT1 在膠質瘤發(fā)病機制中起重要作用，BCAT1 及支鏈氨基酸代謝成為IDH-wt 膠質瘤患者的治療靶點。還原型輔酶Ⅱ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）作為谷胱甘肽（glutathione，GSH）還原酶的輔酶，促進細胞抗氧化[18]。在IDH-mut膠質瘤細胞中，NADPH 缺乏，電離輻射、活性氧造成DNA 雙鏈斷裂增加，這是IDH-mut 膠質瘤對放化療敏感的原因之一[19]。谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基是GSH 合成的限速酶；谷胱甘肽過氧化物酶7/8 是GSH 過氧化物酶家族的成員，催化GSH 還原氫過氧化物，是生物體內重要的氧自由基清除劑[20]。GSH 的代謝脆性可能是提高IDH-mut 膠質瘤對放療和化療敏感性的潛在治療靶點[21]。

脫氧胞苷酸脫氨酶（deoxycytidylate deaminase，DCTD）基因編碼的蛋白質催化脫氧胞苷一磷酸脫氨為脫氧尿苷酸，而脫氧尿苷酸是胸苷酸合成酶（thymidine synthase，TYMS）的核苷酸底物[22]。TYMS 在DNA 生物合成的早期階段起著至關重要的作用，并已成為抗代謝制劑5-氟尿嘧啶和培美曲塞化療的重要靶標[23]。吉西他濱為DCTD 的抑制劑，吉西他濱及其代謝物二氟-脫氧尿苷具放療增敏作用，并具有良好的血-腫瘤屏障通過率，與放療聯(lián)用于IDH-wt 膠質瘤具潛在治療效果[24-25]。

本研究進一步利用隨機森林法篩選C1 型前5 個最顯著特征基因（TK1、GPX8、RRM2、NNMT 和GPX7），其表達水平可用于IDH-wt C1 型診斷，診斷準確度為95.12%，敏感性為93.75%，特異性為95.60%，簡化C1型診斷模型以增加臨床應用的可行性。一方面，準確的預后預測可以指導針對IDH-wt 膠質瘤的更合理的隨訪和更積極的治療方案的制訂；另一方面，針對IDH-wt C1 組與C2、C3 組之間的代謝差異可進行針對性代謝缺陷靶向治療。本研究尚局限于生信分析層面，應進一步完善蛋白質水平研究，以闡明蛋白質水平各種代謝酶活性的差異，且需要進一步的研究來解釋這種表觀遺傳差異。