宋殿芳 賈素敏 徐沖

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 1婦產(chǎn)科，山東 濱州 256600；2臨床實驗中心)

宮頸癌是女性中常見惡性腫瘤之一，其已嚴(yán)重威脅女性健康，宮頸癌早期診斷準(zhǔn)確率較低與患者預(yù)后差是亟待解決問題，研究表明宮頸癌發(fā)生與人乳頭狀瘤病毒感染相關(guān)，而單獨人乳頭狀瘤病毒感染并不是引起宮頸癌的主要原因〔1〕。既往研究顯示原癌基因激活與抑癌基因失活及其涉及多種信號通路可參與宮頸癌發(fā)生及發(fā)展過程〔2〕。長鏈非編碼RNA(LncRNA)可參與基因轉(zhuǎn)錄激活、染色質(zhì)修飾等多種過程，并可參與乳腺癌、肝癌及宮頸癌等發(fā)生及發(fā)展過程〔3〕。LncRNA LINC00277在人乳頭狀瘤病毒誘導(dǎo)的宮頸癌形成過程中表達(dá)下調(diào)，但關(guān)于其具體作用機(jī)制尚未可知〔4〕。研究表明HPV16 E7可通過調(diào)控miR-27b進(jìn)而影響宮頸癌細(xì)胞增殖及凋亡〔5〕。miR-27b-3p在宮頸癌中上調(diào)表達(dá)，并可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖及遷移〔6〕。p53屬于抑癌基因，p53在許多癌癥中發(fā)揮抑癌作用〔7〕。通過生物學(xué)信息網(wǎng)站預(yù)測miR-27b可能是LINC00277的靶基因，p53可能為miR-27b的靶基因，但LINC00277是否可通過調(diào)控miR-27b/p53進(jìn)而參與宮頸癌發(fā)生及發(fā)展過程尚未可知。因此，本研究著重探討LINC00277在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)及其對細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響，分析其對miR-27b/p53的調(diào)控作用，為揭示宮頸癌發(fā)病機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1研究對象 收集2015年3月至2017年2月山東省濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院就診的宮頸癌患者36例為研究對象，所有患者經(jīng)手術(shù)病理證實為宮頸癌，年齡55～70〔平均(63.25±6.26)〕歲，納入標(biāo)準(zhǔn)：宮頸癌病理類型均為腺癌；生存時間超過6個月；患者病理分期為Ⅱ期或Ⅲ期患者〔8〕；依從性強(qiáng)。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前接受放療、化療等；合并其他惡性腫瘤者；既往心肌梗死等心血管疾病者；心、腎等臟器功能受損者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者及其家屬知情且簽署同意書。所有患者于術(shù)中切除宮頸癌組織(36例)及癌旁組織(28例)，迅速放入液氮中，術(shù)后將其轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱保存。

1.2材料與試劑 宮頸癌細(xì)胞系Hela、SiHa與正常宮頸細(xì)胞系E6E7均購自中國科學(xué)院中國細(xì)胞庫。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清與胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；miR-27b mimics及其陰性對照mimic-NC、miR-27b inhibitor及其陰性對照miR-NC均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)檢測試劑盒、蛋白裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、ECL試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Transwell小室購自美國Corning公司；Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒購自上海鈺博生物科技有限公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司；目的質(zhì)粒pcDNA3.1與空白質(zhì)粒pcDNA3.1均購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司；兔抗人p53抗體購自美國CST公司；Trizol、反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 取對數(shù)生長期宮頸癌Hela細(xì)胞，接種于6孔板，放入不含血清及青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到50%時按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將pcDNA-LINC00277、pcDNA-NC、miR-27b mimics、mimic-NC、miR-27b inhibitor、miR-NC分別轉(zhuǎn)染至宮頸癌Hela細(xì)胞，分別為pcDNA-LINC00277組、pcDNA-NC組、mimic-miR-27b組、mimic-NC組、inhibitor-miR-27b組、miR-NC組，同時將pcDNA-LINC00277與mimic-miR-27b共轉(zhuǎn)染至宮頸癌Hela細(xì)胞，pcDNA-LINC00277與miR-NC共轉(zhuǎn)染至宮頸癌Hela細(xì)胞，分別為pcDNA-LINC00277+mimic-miR-27b組、pcDNA-LINC00277+miR-NC組，轉(zhuǎn)染6 h后更換培養(yǎng)基為含有10%胎牛血清及青鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h，將轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞用于實驗。

1.3.2qRT-PCR檢測細(xì)胞中LINC00277、miR-27b表達(dá)水平 收集宮頸癌組織及癌旁組織，研磨后加入Trizol試劑提取組織RNA，同時收集各組細(xì)胞，采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板配置qRT-PCR反應(yīng)體系，qRT-PCR反應(yīng)條件為95℃ 2 min，(95℃ 30 s，60℃30 s，72℃ 30 s)×40次循環(huán)，采用2-ΔΔCt法計算LINC00277、miR-27b相對表達(dá)量。

1.3.3MTT檢測細(xì)胞增殖 收集對數(shù)生長期宮頸癌Hela細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個/ml，按照每孔1×104個細(xì)胞的密度接種于96孔板，按照1.3.1轉(zhuǎn)染后，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，每孔分別加入20 μl 5 mg/ml的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清，每孔分別加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min，分別于溶解后的0 h、24 h、48 h、72 h時放入酶標(biāo)儀檢測450 nm處各孔吸光度值(OD)。實驗均設(shè)置3次重復(fù)。

1.3.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測各組對數(shù)生長期宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡率，預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌宮頸癌Hela細(xì)胞，4℃，1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min(離心半徑6 cm)，加入PBS洗滌細(xì)胞，4℃，1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min(離心半徑6 cm)，棄上清，加入200 μl結(jié)合緩沖液，分別加入5 μl Annexin V-FITC與PI，充分混勻，室溫避孵育20 min，加入400 μl結(jié)合緩沖液，于1 h內(nèi)上機(jī)檢測，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.3.5Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移及侵襲 用100 μl無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋800 μl Matrigel基質(zhì)膠，取100 μl稀釋液鋪于Transwell小室上室，取含胎牛血清DMEM培養(yǎng)基500 μl加入Transwell小室下室，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，擦去未侵入細(xì)胞表面的細(xì)胞，采用多聚甲醛固定侵入Transwell小室下室的細(xì)胞20 min，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，干燥后置于顯微鏡下拍照并計算侵襲細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞遷移實驗：取不含血清的DMEM培養(yǎng)基100 μl放入Transwell小室的上室，取含胎牛血清DMEM培養(yǎng)基500 μl加入Transwell小室下室，其余步驟同細(xì)胞侵襲實驗，在顯微鏡下觀察遷移細(xì)胞數(shù)。

1.3.6Western印跡檢測p53蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，加入RIPA、PMSF裂解液，冰上裂解30 min，提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法檢測蛋白濃度，取20 μg蛋白樣本進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫下使用5%脫脂奶粉封閉1 h，孵育一抗(1∶1 000)，4℃條件下孵育24 h，TBST洗膜3次×5 min，室溫條件下孵育二抗(1∶5 000)1 h，TBST洗膜3次×5 min，滴加ECL發(fā)光顯影，應(yīng)用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.3.7雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CLINC00277、miR-27b及p53的靶向關(guān)系 使用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫對LINC00277的靶基因進(jìn)行預(yù)測，構(gòu)建含有LINC00277與miR-27b的結(jié)合位點的野生型載體LINC00277-wt，構(gòu)建含有LINC00277與miR-27b突變結(jié)合位點的突變型載體LINC00277-mut，同時將宮頸癌Hela細(xì)胞接種于24孔板，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%左右時將LINC00277-wt與miR-27b mimics或miR-NC分別共轉(zhuǎn)染入宮頸癌Hela細(xì)胞，將LINC00277-mut與miR-27b mimics或miR-NC分別共轉(zhuǎn)染入宮頸癌Hela細(xì)胞。使用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫對miR-27b的靶基因進(jìn)行預(yù)測，構(gòu)建含有p53與miR-27b的結(jié)合位點的野生型載體p53-wt，構(gòu)建含有p53與miR-27b突變結(jié)合位點的突變型載體p53-mut，同時將宮頸癌Hela細(xì)胞接種于24孔板，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%左右時將p53-wt與miR-27b mimics或miR-NC分別共轉(zhuǎn)染入宮頸癌Hela細(xì)胞，將p53-mut與miR-27b mimics或miR-NC分別共轉(zhuǎn)染入宮頸癌Hela細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后，各組細(xì)胞放入37℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出培養(yǎng)板，每孔分別加入60 μl細(xì)胞裂解液，低速振蕩20 min，參照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測各組細(xì)胞熒光素酶活性。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1LncRNA LINC00277在宮頸腫瘤組織、腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)量 LINC00277在宮頸癌組織中的表達(dá)水平(0.52±0.05)顯著低于癌旁組織(1.95±0.20，P<0.05)；宮頸癌Hela、SiHa細(xì)胞中LINC00277的表達(dá)水平(0.75±0.08，0.83±0.06)均顯著低于E6E7細(xì)胞(2.41±0.21，P<0.05)，其中在宮頸癌Hela細(xì)胞中LINC00277的表達(dá)水平降低最為顯著。因此后續(xù)實驗中選取宮頸癌Hela細(xì)胞為研究對象。

2.2LncRNA LINC00277在體外的表達(dá)量對細(xì)胞增殖和活力的影響 pcDNA-LINC00277組宮頸癌Hela細(xì)胞增殖活性低于pcDNA-NC組(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率高于pcDNA-NC組(P<0.05)，見圖1和表1。

圖1 過表達(dá)LINC00277時細(xì)胞的凋亡率

表1 過表達(dá)LINC00277對Hela細(xì)胞增殖活性的影響

2.3LncRNA LINC00277在體外的表達(dá)量對細(xì)胞的遷移和侵襲能力的影響 pcDNA-LINC00277組細(xì)胞遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著低于pcDNA-NC組(均P<0.05)，見圖2和表2。表明LINC00277過表達(dá)可抑制宮頸癌Hela細(xì)胞遷移及侵襲能力。

圖2 過表達(dá)LINC00277對細(xì)胞遷移力和侵襲力的影響(結(jié)晶紫染色，×200)

表2 過表達(dá)LINC00277對細(xì)胞遷移力和侵襲力的影響個)

2.4LncRNA LINC00277可以靶向miR-27b 宮頸癌Hela細(xì)胞中miR-27b的表達(dá)水平(1.27±0.12)顯著高于正常宮頸細(xì)胞E6E7(0.56±0.05，P<0.05)。靶基因預(yù)測網(wǎng)站顯示miR-27b與LINC00277的3′UTR存在結(jié)合位點，見圖3。

圖3 LINC00277和miR-27b的結(jié)合位點

雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，與mimic-NC、LINC00277-wt共轉(zhuǎn)染組相比，mimic-miR-27b、LINC00277-wt共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，見表3。pcDNA-LINC00277組miR-27b的表達(dá)水平(0.52±0.05)顯著低于pcDNA-NC組(1.46±0.13，P<0.05)。

表3 雙熒光素酶報告實驗

2.5miR-27b可靶向調(diào)控p53表達(dá) 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，與mimic-NC、p53-wt共轉(zhuǎn)染組相比，mimic-miR-27b、p53-wt共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，見表4。靶基因預(yù)測網(wǎng)站顯示miR-27b與p53的3′UTR存在結(jié)合位點，見圖4。Hela細(xì)胞中p53的表達(dá)水平(0.68±0.06)顯著低于正常宮頸細(xì)胞E6E7(1.53±0.12，P<0.05)。inhibitor-miR-27b組宮頸癌Hela細(xì)胞中p53的表達(dá)水平顯著高于inhibitor-miR-NC組(P<0.05)，見圖5和表5。

表4 雙熒光素酶報告實驗

圖4 miR-27b和p53的結(jié)合位點

圖5 Western印跡檢測干擾miR-27b對p53蛋白表達(dá)水平的影響

表5 干擾miR-27b對p53表達(dá)量的影響

2.6LINC00277可與miR-27b結(jié)合調(diào)控p53的表達(dá)來抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移 pcDNA-LINC00277+mimic-miR-27b組p53的表達(dá)水平顯著低于pcDNA-LINC00277+miR-NC組(P<0.05)，細(xì)胞增殖活性高于pcDNA-LINC00277+miR-NC組(P<0.05)，遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)顯著多于pcDNA-LINC00277+miR-NC組(P<0.05)，見表6。

表6 LINC00277可與miR-27b結(jié)合調(diào)控p53的表達(dá)來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖活力、遷移和侵襲

3 討 論

人乳頭狀瘤病毒的預(yù)防性疫苗可有效預(yù)防宮頸癌，但其對宮頸癌晚期患者治療效果較差，目前宮頸癌發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明〔9〕。因而探究宮頸癌細(xì)胞遷移及侵襲的分子機(jī)制并尋找有效診斷的分子治療靶點對提高宮頸癌治療效果有重要意義。研究表明LncRNA在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)并可參與腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程〔10〕。已有報道指出LncRNA GAS5、LncRNA H19等表達(dá)異常可能參與宮頸癌發(fā)生及發(fā)展過程，并可為宮頸癌分子靶向治療提供理論依據(jù)〔11〕。

本研究結(jié)果說明LINC00277在宮頸癌中呈低表達(dá)并可能發(fā)揮抑癌基因作用。LINC00277過表達(dá)可通過降低宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力及增強(qiáng)細(xì)胞凋亡能力進(jìn)而抑制宮頸癌發(fā)生及發(fā)展。研究表明miR-27b在乳腺癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，并可通過靶向抑制HMG3表達(dá)進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化〔12〕。miR-27b在口腔鱗癌細(xì)胞中表達(dá)降低，上調(diào)miR-27b表達(dá)可通過靶向抑制FZD7表達(dá)進(jìn)而抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖〔13〕。miR-27b通過靶向NR2F2抑制胃癌細(xì)胞遷移及侵襲〔14〕。但miR-27b在宮頸癌細(xì)胞表達(dá)上調(diào)，并可促進(jìn)細(xì)胞生長，細(xì)胞周期從G1期向S期轉(zhuǎn)變，侵襲及減少細(xì)胞凋亡〔15〕。LncRNA ZEB2-AS1可通過調(diào)節(jié)miR-27b進(jìn)而促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡〔16〕。這可能與腫瘤細(xì)胞類型不同相關(guān)。提示LINC00277可能通過競爭性吸附miR-27b而抑制miR-27b表達(dá)進(jìn)而抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

miRNA通過靶向抑制下游靶基因表達(dá)進(jìn)而參與多種腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程，通過靶基因預(yù)測顯示p53可能是miR-27b的靶基因，通過雙熒光素酶報告基因證實miR-27b可靶向結(jié)合p53，并可負(fù)向調(diào)控p53表達(dá)，研究表明上調(diào)p53表達(dá)可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡〔17～19〕。二甲雙胍可通過促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白D1和p53表達(dá)而抑制細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡〔20〕。本研究結(jié)果提示LINC00277可通過調(diào)控miR-27b/p53表達(dá)進(jìn)而抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。

綜上，LINC00277過表達(dá)可通過抑制miR-27b表達(dá)而上調(diào)p53表達(dá)進(jìn)而減弱宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力，LINC00277可能成為宮頸癌潛在治療分子靶點及預(yù)后的生物標(biāo)志物，并可能應(yīng)用于實時監(jiān)控宮頸癌發(fā)病進(jìn)展，為宮頸癌遷移及侵襲提供新的作用靶點。