傅麗君，林瀟雨，楊磊，黃靖，李婷

1. 福建省新型污染物生態(tài)毒理效應(yīng)與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，莆田 351100 2. 莆田學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，莆田 351100 3. 福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350002

有害赤潮已成為當(dāng)今全球性的海洋災(zāi)害，嚴(yán)重制約沿海經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，破壞海洋生態(tài)環(huán)境，威脅人類健康。赤潮異彎藻(Heterosigmaakashiwo)屬于針胞藻類(Raphidophyceae)，為近岸海域廣布類型藻之一，能產(chǎn)生溶血性魚毒素，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)危害嚴(yán)重[1-2]。微生物治理赤潮因具有操作簡(jiǎn)單、高效、不會(huì)帶來(lái)環(huán)境二次污染等優(yōu)勢(shì)，被認(rèn)為是最具前途的赤潮防治方法之一[3-4]。溶藻細(xì)菌(algicidal bacteria)通過(guò)接觸細(xì)胞及侵入細(xì)胞等直接方式，或者通過(guò)分泌胞外活性物質(zhì)等間接方式抑制藻細(xì)胞生長(zhǎng)，因種類多、分布廣泛、功能強(qiáng)大等特點(diǎn)，成為目前最常用的微生物控藻細(xì)菌[5-6]。由于細(xì)菌分泌的殺藻物質(zhì)濃度較低、難以純化且殺藻活性不穩(wěn)定，使得細(xì)菌殺藻作用的機(jī)制和過(guò)程未能得到詳盡的闡釋。

國(guó)內(nèi)外已有研究表明，殺藻物質(zhì)或殺藻菌作用藻細(xì)胞后，藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，光合、呼吸作用受到抑制[7-8]。藻細(xì)胞在進(jìn)化過(guò)程中形成了一系列適應(yīng)外界脅迫的生理生態(tài)響應(yīng)體系，但當(dāng)這種脅迫到一定程度，細(xì)胞啟動(dòng)的防御機(jī)制不足以應(yīng)對(duì)脅迫對(duì)機(jī)體造成的損傷，藻細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)過(guò)度積累，降低光合作用效率，進(jìn)而會(huì)導(dǎo)致藻細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)崩潰，膜脂過(guò)氧化程度加劇[9-10]。為減輕氧化脅迫造成的傷害，藻類體內(nèi)衍生出一套抗氧化防御系統(tǒng)(包括酶促抗氧化系統(tǒng)和非酶促抗氧化系統(tǒng))，使ROS含量處于平衡狀態(tài)。目前，關(guān)于抑藻細(xì)菌脅迫下微藻非酶促抗氧化系統(tǒng)的報(bào)道相對(duì)較少，但是氧化應(yīng)激啟動(dòng)后，細(xì)胞酶類和非酶促抗氧化系統(tǒng)通常同時(shí)啟動(dòng)，以避免機(jī)體受到氧化損傷，同時(shí)也有研究表明，過(guò)量的ROS極有可能作為信號(hào)分子來(lái)介導(dǎo)藻細(xì)胞程序性死亡(PCD)[11-12]。

本課題組前期從福建省云霄紅樹(shù)林區(qū)泥樣中分離出對(duì)赤潮異彎藻具殺藻作用的芽孢桿菌屬溶藻細(xì)菌HSY-03，其溶藻方式為分泌胞外代謝產(chǎn)物進(jìn)行間接殺藻[13]，本研究通過(guò)開(kāi)展溶藻菌HSY-03胞外代謝產(chǎn)物對(duì)赤潮異彎藻藻細(xì)胞光合系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)的影響，為探討溶藻細(xì)菌對(duì)赤潮異彎藻溶藻機(jī)制和溶藻制劑開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

1.1.1 供試菌株和藻種

實(shí)驗(yàn)所用菌株HSY-03屬芽孢桿菌屬(Bacillussp.)，分離自中國(guó)福建省云霄紅樹(shù)林區(qū)。供試藻種為單細(xì)胞赤潮異彎藻(Heterosigmaakashiwo)，由暨南大學(xué)水生生態(tài)研究所提供，經(jīng)廈門大學(xué)應(yīng)用環(huán)境微生物研究所采用無(wú)菌藻除菌技術(shù)純化獲得無(wú)菌菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

菌株HSY-03培養(yǎng)基為本課題組前期優(yōu)化所得配方：蛋白胨4.8 g·L-1，酵母粉4.1 g·L-1，NaCl 2.0 g·L-1，葡萄糖0.75 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.3 g·L-1，KCl 0.06 g·L-1，KBr 0.2 g·L-1，KH2PO40.08 g·L-1，CaCl20.8 g·L-1，F(xiàn)e2(SO4)30.0375 g·L-1，pH=7.5，于28 ℃、150 r·min-1，培養(yǎng)48 h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

赤潮異彎藻所用培養(yǎng)液為f/2培養(yǎng)基[14]，采用三角瓶置于20 ℃±1 ℃光照生化培養(yǎng)箱，光暗周期12 h L∶12 h D，光照強(qiáng)度為3 000 lx。

1.2 主要化學(xué)試劑與儀器

酶標(biāo)儀(BIO-RAD，深圳市科力易翔儀器設(shè)備有限公司，中國(guó))，紫外可見(jiàn)光光度計(jì)(TU-1900，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司，中國(guó))，光照培養(yǎng)箱(GTOP-310C，寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠，中國(guó))，超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(SCIENTZ-IID，寧波新芝生物科技股份有限公司，中國(guó))，高級(jí)浮游植物熒光儀(PHYTO-PAM，Walz公司，德國(guó))等。

總超氧化物歧化酶(T-SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)和抗壞血酸(AsA)測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所(中國(guó))。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 HSY-03對(duì)赤潮異彎藻光合色素和光合效率的影響

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HSY-03發(fā)酵培養(yǎng)液在10 000×g條件下離心10 min，去除菌體，制得發(fā)酵上清液，以HSY-03上清液和添加藻液的體積比計(jì)算處理終濃度。不同終濃度(0.5%、1.5%和3.0%)HSY-03上清液處理組，以2216E培養(yǎng)基處理作為對(duì)照組，分別取處理組和對(duì)照組藻液各50 mL，95%乙醇萃取細(xì)胞中色素，4 ℃避光靜置24 h，萃取液3×103×g離心5 min，取上清液分別于664、630和480 nm處測(cè)定吸收值，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3組平行。葉綠素a含量計(jì)算采用Jeffrey和Humphrey[15]的公式：

Chla(μg·cell-1)=11.47×A664-0.40×A630

類胡蘿卜素含量計(jì)算采用Strickland和Parsons[16]的公式：Carotenoids (μg·mL-1)=4×A480

式中：A664、A630和A480分別為上清液在波長(zhǎng)為664、630和480 nm條件下的吸收值。

室溫下用高級(jí)浮游植物熒光儀測(cè)定葉綠素?zé)晒?，激發(fā)光強(qiáng)為最大光強(qiáng)3 000 μmol·(m2·s)-1，藻液暗處理15～30 min，記錄時(shí)間5 s，每隔24 h測(cè)定一次，用可變熒光(Fv)與最大熒光(Fm)的比值Fv/Fm表示光合效能活性的大小。

1.3.2 HSY-03對(duì)赤潮異彎藻細(xì)胞生理生化指標(biāo)的影響

將HSY-03無(wú)菌上清液以1.5%終濃度加入到100 mL赤潮異彎藻中，于培養(yǎng)12、24、36、48和72 h后取20 mL藻液，4 ℃、3 000×g離心10 min收集藻細(xì)胞，加入經(jīng)4 ℃預(yù)冷的0.05 mol·L-1H3PO4緩沖液(pH為7.5)5 mL，冰浴條件下超聲破碎(工作3 s，間隙3 s，共20次)，破碎液于4 ℃、1.2×104×g離心15 min，取上清液即制得粗酶液。采用南京建成生物工程公司生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定酶促抗氧化系統(tǒng)CAT、SOD、POD活性和非酶促抗氧化系統(tǒng)GSH、AsA含量。以2216E培養(yǎng)基處理作為對(duì)照組，每處理設(shè)置3組平行。

藻細(xì)胞內(nèi)部ROS強(qiáng)度測(cè)定采用熒光染料DCFH-DA進(jìn)行[17]，DCFH-DA主要針對(duì)過(guò)氧化物伴隨下的H2O2及·OH。取0.5 mL終濃度為10 μg·mL-1的DCFH-DA，加入到上述處理藻細(xì)胞中，避光置于37 ℃下溫浴1 h，間隔3 min搖勻一次，之后用f/2藻培養(yǎng)基洗滌藻細(xì)胞3次。在485 nm下激發(fā)，525 nm下采用酶標(biāo)儀測(cè)定藻細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 對(duì)光合色素含量和熒光效率的影響

葉綠素a是藻類初始光捕獲色蛋白之一，與藻細(xì)胞的生物量密切相關(guān)，能反映殺藻物質(zhì)對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的影響。由圖1可知，經(jīng)溶藻細(xì)菌HSY-03無(wú)菌上清液處理后，赤潮異彎藻葉綠素a含量降低，并表現(xiàn)出明顯的時(shí)間和劑量效應(yīng)，高濃度處理組抑制現(xiàn)象極為明顯。低濃度(0.5%)HSY-03上清液處理前24 h，藻細(xì)胞葉綠素a含量與對(duì)照組在同一水平，48 h開(kāi)始葉綠素a含量即顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。整個(gè)處理時(shí)期，中高濃度(1.5%和3.0%)處理組藻細(xì)胞葉綠素a含量均顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。0.5%、1.5%濃度處理96 h后，藻細(xì)胞葉綠素a含量分別下降了46.0%(P<0.05)、68.4%(P<0.01)，3.0%濃度處理96 h后藻細(xì)胞葉綠素a含量幾乎為0。這說(shuō)明，HSY-03胞外活性物質(zhì)對(duì)葉綠素a造成破壞，葉綠素a的分解使得為藻細(xì)胞提供有機(jī)物及能量的光合系統(tǒng)被破壞，導(dǎo)致能量運(yùn)輸被阻斷，從而引起藻細(xì)胞死亡。

不同濃度HSY-03上清液處理下，赤潮異彎藻類胡蘿卜素含量變化如圖2所示，結(jié)果表明，對(duì)照組藻細(xì)胞類胡蘿卜素含量總體變化幅度較小，低濃度(0.5%)HSY-03上清液處理24 h，藻細(xì)胞類胡蘿卜素含量為對(duì)照組1.07倍(P<0.01)，之后藻細(xì)胞類胡蘿卜素含量接近對(duì)照水平。1.5%上清液處理24 h，藻細(xì)胞類胡蘿卜素含量上升，為對(duì)照組的1.09倍(P<0.01)，處理48 h后藻細(xì)胞類胡蘿卜素含量逐漸開(kāi)始下降，顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。而高濃度處理組藻細(xì)胞類胡蘿卜素始終低于對(duì)照組(P<0.01)，24、48和72 h分別下降了18.3%、43.1%和74.5%，處理96 h，藻細(xì)胞類胡蘿卜素基本降為0。這表明，HSY-03無(wú)菌上清液的加入可能造成了藻細(xì)胞的氧化脅迫，低濃度上清液在一定程度上能夠刺激藻細(xì)胞產(chǎn)生類胡蘿卜素來(lái)削弱氧化脅迫的危害，但隨著脅迫的持續(xù)增長(zhǎng)，藻細(xì)胞功能代謝受損，間接影響了藻細(xì)胞類胡蘿卜素的合成，從而表現(xiàn)出類胡蘿卜素含量的下降。

圖2 HSY-03上清液對(duì)赤潮異彎藻細(xì)胞類胡蘿卜素含量影響Fig. 2 Effects of HSY-03 cell-free filtrate on carotenoids contents of Heterosigma akashiwo

藻細(xì)胞的Fv/Fm可代表光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)的光化學(xué)效率，能準(zhǔn)確反映藻細(xì)胞PSII反應(yīng)中心開(kāi)放狀態(tài)的量子產(chǎn)量，是衡量藻細(xì)胞光合作用能力的重要參數(shù)之一。利用葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)可以快速、靈敏、無(wú)損傷地探測(cè)逆境對(duì)藻類光合作用的影響[18]。由圖3可知，HSY-03上清液處理后，藻細(xì)胞Fv/Fm值均呈下降趨勢(shì)，且呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。處理24 h，低濃度(0.5%)處理組Fv/Fm值即表現(xiàn)出降低的趨勢(shì)，1.5%和3.0%濃度處理組Fv/Fm值明顯低于對(duì)照(P<0.01、P<0.05)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理組Fv/Fm值均顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。處理96 h，0.5%、1.5%和3.0%濃度處理組Fv/Fm比值比對(duì)照分別下降了37.9%、51.5%和80.3%(P<0.01)。這表明，HSY-03無(wú)菌上清液的加入降低了PSⅡ活性，抑制藻類光合系統(tǒng)，導(dǎo)致光合作用效率下降。

圖3 HSY-03上清液對(duì)赤潮異彎藻細(xì)胞葉綠素a 熒光Fv/Fm的影響注：Fv/Fm表示藻細(xì)胞可變熒光(Fv)強(qiáng)度與最大熒光(Fm)強(qiáng)度之比。Fig. 3 Effects of HSY-03 cell-free filtrate on chlorophyll a fluorescence Fv/Fm of Heterosigma akashiwoNote: Fv/Fm represents the ratio of variable fluorescence (Fv) intensity to maximum fluorescence (Fm) intensity of algal cells.

2.2 藻細(xì)胞胞內(nèi)ROS含量變化

藻細(xì)胞受到脅迫時(shí)，胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的ROS，為了表征HSY-03上清液對(duì)藻細(xì)胞的脅迫作用，對(duì)藻細(xì)胞內(nèi)的ROS含量變化進(jìn)行了測(cè)定。由圖4可知，在殺藻菌作用下，藻細(xì)胞內(nèi)的ROS含量表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。3%濃度HSY-03上清液作用2 h后，藻細(xì)胞內(nèi)ROS含量即顯著上升(P<0.01)，為對(duì)照組1.6倍，至第6小時(shí)ROS含量達(dá)到峰值，為初始階段的2.61倍(P<0.01)。隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，藻細(xì)胞內(nèi)ROS含量開(kāi)始下降，10 h后ROS含量低于初始水平，12 h后ROS含量為初始階段的66.7%(P<0.01)。

圖4 HSY-03上清液對(duì)赤潮異彎藻細(xì)胞 活性氧(ROS)含量影響注：**表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.01)。Fig. 4 Effects of HSY-03 cell-free filtrate on reactive oxygen species (ROS) of Heterosigma akashiwoNote: **means significant differences compared with the control (P<0.01).

2.3 藻細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)活性響應(yīng)

由圖5(a)可知，經(jīng)HSY-03上清液處理12 h，各處理組SOD活性即開(kāi)始升高，表明藻細(xì)胞防御機(jī)制啟動(dòng)。但藻細(xì)胞的防御能力有限，藻細(xì)胞無(wú)法產(chǎn)生更多的SOD以抵抗傷害，至處理36 h，SOD活性開(kāi)始下降接近對(duì)照水平。為了維持對(duì)藻細(xì)胞內(nèi)部ROS的持續(xù)清除作用，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，藻細(xì)胞SOD活性又開(kāi)始上升，至處理48 h達(dá)峰值，各處理組SOD活性分別是對(duì)照組1.69倍(P<0.01)、2.10倍(P<0.01)和2.55倍(P<0.01)，隨后SOD活性又逐漸下降，但始終高于對(duì)照組(P<0.01)。由圖5(b)和圖5(c)可知，藻細(xì)胞內(nèi)CAT活性與SOD活性表現(xiàn)出相似的變化趨勢(shì)。處理至48 h時(shí)CAT活性達(dá)峰值，分別是對(duì)照組CAT活性的2.06倍(P<0.01)、3.95倍(P<0.01)和4.90倍(P<0.01)，隨后CAT活性開(kāi)始下降。SOD和CAT活性的增高有助于清除細(xì)胞內(nèi)部的ROS，但當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ROS超出了抗氧化酶的清除能力時(shí)，依然會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。由圖5(c)可知，POD活性變化趨勢(shì)與SOD活性類似，但低濃度(0.5%)處理組POD活性變化較為不明顯，至處理48 h，1.5%和3.0%處理組POD活性分別是對(duì)照組1.81倍(P<0.01)和2.16倍(P<0.01)，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，各處理組POD活性呈下降趨勢(shì)，接近初始階段。這表明，高濃度處理組POD可用于緩解過(guò)量的ROS，從而造成自身含量下降。在HSY-03上清液脅迫下，CAT和POD均發(fā)揮酶活特性，清除胞內(nèi)H2O2，使機(jī)體氧自由基含量平衡。這也進(jìn)一步證實(shí)了氧化脅迫是誘導(dǎo)藻細(xì)胞死亡的作用機(jī)理之一。

圖5 HSY-03上清液對(duì)赤潮異彎藻細(xì)胞超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和過(guò)氧化物酶(POD)活性的影響注：*、**表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05、P<0.01)；下同。Fig. 5 Effects of HSY-03 cell-free filtrate on the activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and peroxidase (POD) of Heterosigma akashiwoNote: *, **mean significant differences compared with the control (P<0.05, P<0.01); the same below.

由圖6可知，MDA含量與HSY-03上清液濃度呈正相關(guān)型劑量-效應(yīng)關(guān)系。處理12 h，0.5%、1.5%和3.0%處理組MDA含量分別是對(duì)照組的1.15倍(P<0.05)、1.35倍(P<0.01)和1.73倍(P<0.01)。隨著處理時(shí)間的增加，各處理組的MDA含量繼續(xù)上升，在48 h時(shí)達(dá)到各自的最高水平，分別為對(duì)照組的1.40倍(P<0.05)、1.76倍(P<0.01)和2.28倍(P<0.01)。在處理60 h時(shí)，各處理組的MDA含量相對(duì)于48 h有所下降，但是仍顯著高于對(duì)照組。這說(shuō)明，在細(xì)菌HSY-03胞外活性物質(zhì)的脅迫下，藻細(xì)胞內(nèi)ROS不斷積累，造成藻細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度增強(qiáng)，MDA含量上升。但持續(xù)的脅迫環(huán)境，致使藻細(xì)胞自身抗氧化系統(tǒng)的啟動(dòng)或者膜脂損傷加劇，MDA含量則開(kāi)始逐漸下降。

圖6 HSY-03上清液對(duì)赤潮異彎藻丙二醛(MDA)含量的影響Fig. 6 Effects of HSY-03 cell-free filtrate on themalondialdehyde (MDA) content of Heterosigma akashiwo

藻細(xì)胞的非酶促抗氧化系統(tǒng)包括GSG和AsA，HSY-03上清液對(duì)赤潮異彎藻細(xì)胞GSH和AsA含量影響結(jié)果如圖7所示。由圖7(a)可知，在整個(gè)處理過(guò)程中，對(duì)照組GSH水平基本保持不變；在處理12 h時(shí)，各處理組藻細(xì)胞GSH含量顯著上升，分別為對(duì)照組1.63倍、1.85倍(P<0.01)和2.72倍(P<0.01)；隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，GSH含量繼續(xù)增大，以清除過(guò)量的ROS，在處理36 h時(shí)，各處理組GSH含量分別達(dá)到峰值，分別是對(duì)照組的2.33倍(P<0.01)、2.80倍(P<0.01)和3.36倍(P<0.01)；從48 h開(kāi)始，處理組的GSH含量逐漸下降至接近對(duì)照水平，這可能是GSH在清除ROS的同時(shí)，自身轉(zhuǎn)換成了氧化型谷胱甘肽(GSSGs)，因此GSH含量降低到低水平。由圖7(b)可知，低濃度(0.5%)處理組藻細(xì)胞內(nèi)AsA含量與對(duì)照相比無(wú)顯著差異，中高濃度(1.5%和3.0%)處理12 h后AsA含量則顯著高于對(duì)照(P<0.01)，處理36 h時(shí)達(dá)到峰值，為對(duì)照組的1.70倍(P<0.01)和2.0倍(P<0.01)；隨后各處理組AsA含量開(kāi)始下降，但仍顯著高于對(duì)照(P<0.01)。AsA通過(guò)與GSSG反應(yīng)以清除部分ROS，但過(guò)多的ROS消耗了大量的AsA，導(dǎo)致處理后期AsA含量開(kāi)始下降。

圖7 HSY-03上清液對(duì)赤潮異彎藻細(xì)胞谷胱甘肽(GSH)和抗壞血酸(AsA)含量的影響Fig. 7 Effects of HSY-03 cell-free filtrate on the glutathione (GSH) and ascorbic acid (ASA) contents of Heterosigma akashiwo

3 討論(Discussion)

ROS在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)方面有著重要的作用，同時(shí)也會(huì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等造成不可逆的損傷，并引起細(xì)胞死亡[23]。本研究采用DCFH-DA法測(cè)定ROS含量變化，經(jīng)3% HSY-03無(wú)菌上清液處理后，赤潮異彎藻細(xì)胞H2O2/·OH水平顯著上升到一定水平后逐漸下降。由于·OH是ROS中活性最強(qiáng)的基團(tuán)，其半衰期<1 μs，對(duì)其產(chǎn)生位點(diǎn)附近的生物大分子有非常強(qiáng)的親合力，反應(yīng)速率極快(K>109mol-1·L·s-1)，因此對(duì)生物體危害極大[24]。H2O2/·OH水平上升表明HSY-03誘導(dǎo)藻細(xì)胞產(chǎn)生ROS，預(yù)示了HSY-03無(wú)菌上清液可能介導(dǎo)了藻細(xì)胞的氧化損傷，研究結(jié)果與張化俊等的[25]一致。

非酶促抗氧化系統(tǒng)的GSH和AsA，二者常共同作用以清除過(guò)量ROS。GSH是一種由谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸組成的三肽，其分子結(jié)構(gòu)含有巰基，巰基自身氧化后能將ROS清除，同時(shí)巰基變成GSSG；AsA作為GSH的輔助，通過(guò)自身的氧化將GSSG轉(zhuǎn)化成GSH，再次用于ROS的清除[29]，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。在HSY-03上清液作用下，藻細(xì)胞GSH含量上升，用于清除過(guò)量ROS，在清除ROS的同時(shí)，自身轉(zhuǎn)換成了GSSG，故含量開(kāi)始下降。在HSY-03脅迫下，AsA含量上升，通過(guò)與GSSG反應(yīng)含量逐漸下降。在GSH和AsA共同作用下繼續(xù)清除過(guò)量的ROS。雖然ROS的含量在藻細(xì)胞自身抵抗作用下開(kāi)始下降，但是其作用效果沒(méi)有被完全緩解，同時(shí)大量的抗氧化系統(tǒng)的響應(yīng)過(guò)度消耗了藻自身的能量，造成了藻細(xì)胞的氧化損傷。

以上結(jié)果表明，溶藻細(xì)菌HSY-03溶藻機(jī)制主要是通過(guò)胞外活性物質(zhì)抑制藻細(xì)胞光合作用，引起藻細(xì)胞內(nèi)部氧化損傷，當(dāng)胞內(nèi)產(chǎn)生的過(guò)量ROS得不到及時(shí)清除時(shí)，ROS引發(fā)含有膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化，并通過(guò)引發(fā)一定的級(jí)聯(lián)反應(yīng)造成藻細(xì)胞死亡。但關(guān)于菌株HSY-03分泌的溶藻活性物質(zhì)的特性和結(jié)構(gòu)確認(rèn)，赤潮異彎藻藻遺傳信息的解析和抑藻物質(zhì)作用下藻細(xì)胞關(guān)鍵功能基因的響應(yīng)有待于進(jìn)一步探討。