李涵，李俊，劉春生

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢 430070

水質(zhì)基準(zhǔn)(WQC)是制定水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的重要科學(xué)依據(jù)，在環(huán)境保護(hù)方面發(fā)揮著重要作用，是環(huán)保部門制定水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)、評(píng)價(jià)水質(zhì)和進(jìn)行水質(zhì)管理不可或缺的科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)[1]。美國(guó)是最早開(kāi)展水質(zhì)基準(zhǔn)研究的國(guó)家[2]，隨后許多學(xué)者針對(duì)水質(zhì)基準(zhǔn)建立中存在的問(wèn)題，提出了一系列相關(guān)的理論和方法[3-4]，目前已形成以保護(hù)水生生物和人體健康的水質(zhì)基準(zhǔn)為主，輔以沉積物基準(zhǔn)、營(yíng)養(yǎng)物基準(zhǔn)、細(xì)菌基準(zhǔn)、野生生物基準(zhǔn)、生物學(xué)基準(zhǔn)和物理基準(zhǔn)等較為完整的水環(huán)境基準(zhǔn)體系[5]。在美國(guó)環(huán)境保護(hù)局水質(zhì)基準(zhǔn)中，水生生物基準(zhǔn)是最早制定的，它的目標(biāo)在于防止化學(xué)污染物對(duì)具有商業(yè)和娛樂(lè)價(jià)值的水生生物及其他重要物種(如河流湖泊中的魚(yú)類、底棲無(wú)脊椎動(dòng)物和浮游生物)造成不可接受的長(zhǎng)期和短期影響。水生生物基準(zhǔn)制定包含2個(gè)參數(shù)的確定，即基準(zhǔn)最大濃度(criteria maximum concentration, CMC)和基準(zhǔn)連續(xù)濃度(criteria continuous concentration, CCC)，這2個(gè)閾值濃度是為了防止化學(xué)污染物短期和長(zhǎng)期作用對(duì)水生生物造成急性和慢性毒性效應(yīng)而設(shè)，其值分別為水生生物短期或長(zhǎng)期暴露在有毒物質(zhì)中，沒(méi)有產(chǎn)生不可接受的影響時(shí)，有毒物質(zhì)在環(huán)境水體中的最大濃度。CMC的制定參考的是水生動(dòng)物急性毒性數(shù)據(jù)，CCC的制定參考的是水生動(dòng)物慢性毒性、植物毒性、生物富集的綜合影響。在CCC制定中浮游甲殼類動(dòng)物的毒理學(xué)數(shù)據(jù)是必須參考的，因?yàn)檫@類生物在水體中分布廣泛，具有很強(qiáng)的代表性。在浮游甲殼類生物中，大型溞(Daphniamagna)是最為常用的毒理學(xué)測(cè)試模式生物[6-11]，通常棲息在淡水水域環(huán)境中，在南半球及南非地區(qū)的分布非常廣泛。美國(guó)環(huán)境保護(hù)局在1978年將大型溞定為毒性試驗(yàn)的必測(cè)項(xiàng)目，其慢性毒理學(xué)數(shù)據(jù)在美國(guó)環(huán)境保護(hù)局水質(zhì)基準(zhǔn)CCC的制定中發(fā)揮了很重要的作用。

傳統(tǒng)的慢性毒性測(cè)試獲得的毒理學(xué)數(shù)據(jù)在大部分情況下是可以保護(hù)水生生物免受污染物危害的，然而對(duì)于一些具有較強(qiáng)生物累積性和環(huán)境持久性的化學(xué)污染物而言，其對(duì)大型溞的慢性毒性數(shù)據(jù)與實(shí)際風(fēng)險(xiǎn)數(shù)據(jù)可能存在一定的偏差。大型溞的壽命通常為50～100 d，在自然水體中其全生命周期可能均暴露于污染物中。傳統(tǒng)慢性暴露實(shí)驗(yàn)只涵蓋其部分生命階段，可能存在以下2個(gè)不足：(1)由于慢性暴露實(shí)驗(yàn)的暴露周期較短，獲得的化學(xué)污染物對(duì)生物發(fā)育生殖指標(biāo)的最低觀察效應(yīng)濃度(lowest observed effective concentration, LOEC)大都高于環(huán)境濃度，因此環(huán)境濃度化學(xué)污染物潛在的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)通常難以得到充分評(píng)估；(2)由于慢性暴露實(shí)驗(yàn)是在生物的部分生命周期內(nèi)進(jìn)行的，對(duì)于一些壽命較短而全生命周期都暴露于化學(xué)污染物中的生物而言，慢性暴露實(shí)驗(yàn)可能會(huì)低估化學(xué)品的實(shí)際環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。以往的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯(TDCIPP)對(duì)大型溞的暴露時(shí)間達(dá)到62 d時(shí)，大型溞生長(zhǎng)和生殖指標(biāo)的LOEC在32 d的基礎(chǔ)上均降低了一個(gè)數(shù)量級(jí)[12]。因此在對(duì)一些持久性污染物CCC的制定中，參考大型溞部分生命周期暴露的毒理學(xué)數(shù)據(jù)得出的閾值濃度在實(shí)際中可能仍然會(huì)對(duì)水生生物造成一定的毒性效應(yīng)。為了探究這個(gè)問(wèn)題，本研究從美國(guó)環(huán)境保護(hù)局水質(zhì)基準(zhǔn)文件NationalRecommendedWaterQualityCriteria: 2002中選取4,4’-滴滴涕(4,4’-DDT)為代表性污染物，以其CCC為參考測(cè)試濃度，對(duì)大型溞開(kāi)展全生命周期暴露實(shí)驗(yàn)，評(píng)估閾值濃度的4,4’-DDT對(duì)大型溞不同生命階段生長(zhǎng)、生殖、心率、行為、存活和基因轉(zhuǎn)錄等指標(biāo)的影響并比較各指標(biāo)LOEC與暴露時(shí)間的關(guān)系。

4,4’-DDT是一種廣泛使用的有機(jī)氯類殺蟲(chóng)劑，也是一種典型的內(nèi)分泌干擾物質(zhì)[13]。4,4’-DDT自身毒性不是很強(qiáng)，但具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性，生物降解緩慢，能長(zhǎng)期存在于環(huán)境中，并在食物鏈和生物體組織中積累，尤其是脂肪組織[14]。由于4,4’-DDT使用廣泛，目前已出現(xiàn)全球范圍的污染[15]，在許多鳥(niǎo)類和魚(yú)類組織中均發(fā)現(xiàn)了4,4’-DDT殘留物，包括生活在沙漠地區(qū)的鳥(niǎo)類或海洋深處的魚(yú)類。美國(guó)環(huán)境保護(hù)局在2002年的文件中規(guī)定4,4’-DDT在水體中的CCC為1 ng·L-1。本研究選取持久性污染物4,4’-DDT對(duì)大型溞開(kāi)展全生命周期暴露實(shí)驗(yàn)，旨在驗(yàn)證其CCC在全生命周期暴露下是否會(huì)對(duì)水生生物造成毒性效應(yīng)，從而對(duì)部分生命周期暴露和全生命周期暴露之間的關(guān)系和應(yīng)用做進(jìn)一步思考，以及探究在對(duì)持久性污染物進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和基準(zhǔn)制定時(shí)應(yīng)通過(guò)何種暴露手段獲取更為精準(zhǔn)的毒理學(xué)數(shù)據(jù)來(lái)源。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

4,4’-DDT購(gòu)自Dr. Ehrenstorfer試劑公司(德國(guó))，CAS號(hào)為50-29-3，純度為98%；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)購(gòu)自Sigma公司(美國(guó))，CAS號(hào)為67-68-5，純度>99%；總RNA提取所需的RNAiso Plus試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑PrimeScriptTMRT reagent kit及熒光定量試劑SYBR? Primex Ex TaqTMⅡ均購(gòu)自TaKaRa公司(大連，中國(guó))；氯仿(CAS 67-66-3)、異丙醇(CAS 67-63-0)、無(wú)水乙醇(CAS 64-17-5)均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 大型溞的培養(yǎng)

大型溞溞種來(lái)自南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前在本實(shí)驗(yàn)室恒溫光照培養(yǎng)箱中至少連續(xù)穩(wěn)定培養(yǎng)了10代。大型溞培養(yǎng)溫度為22 ℃±1 ℃，光暗比為16 h∶8 h。參考之前的相關(guān)研究中大型溞的培養(yǎng)方案，除氯自來(lái)水適用于大型溞的養(yǎng)殖[16-18]。本研究大型溞的培養(yǎng)液為經(jīng)安吉爾凈水器(J1205-ROB12)過(guò)濾后，連續(xù)曝氣48 h除氯的自來(lái)水，曝氣后溶氧含量為8.6 mg·L-1，在此培養(yǎng)液中大型溞生長(zhǎng)狀態(tài)良好、個(gè)體活躍。喂食小球藻(Chlorellapyrenoidesa)和斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)混合液，喂食密度為產(chǎn)溞前2.5×106cell·mL-1，產(chǎn)溞后5×106cell·mL-1，每天上午9:00喂食一次。每隔一天更換一次培養(yǎng)液。

在本研究培養(yǎng)條件下大型溞只營(yíng)孤雌生殖。孤雌生殖是大型溞在營(yíng)養(yǎng)狀況良好的條件下所營(yíng)的一種無(wú)性生殖方式，由大型溞卵巢內(nèi)的干細(xì)胞均等分裂生成卵母細(xì)胞進(jìn)而發(fā)育成雌性個(gè)體[19]，此繁殖方式有利于大型溞迅速擴(kuò)大種群[20]。在孤雌生殖模式下，大型溞能保持遺傳的穩(wěn)定性和基因的純凈性，個(gè)體差異較小使毒理學(xué)研究能在可重復(fù)和統(tǒng)一的實(shí)驗(yàn)條件下開(kāi)展[21]。此外孤雌生殖模式下大型溞繁殖周期短、子代產(chǎn)量大，使實(shí)驗(yàn)材料的獲取更為便捷。而有性生殖是大型溞在營(yíng)養(yǎng)狀況不良條件下的生殖方式，產(chǎn)生的卵鞍需要在適宜條件下孵化才能發(fā)育成幼溞，此種繁殖方式是大型溞為渡過(guò)不良環(huán)境所進(jìn)行的，出現(xiàn)有性生殖說(shuō)明大型溞受到了環(huán)境脅迫，是一種不健康的狀態(tài)[22]，不適用于開(kāi)展毒理學(xué)研究。在本研究中大型溞的所有子代均由孤雌生殖得到。

1.3 綠藻的培養(yǎng)與收集

小球藻和斜生柵藻藻種來(lái)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，使用BG11液體培養(yǎng)基在恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。BG11液體培養(yǎng)基配方如表1和表2所示。在接種第7天綠藻生長(zhǎng)達(dá)到平臺(tái)期，在此時(shí)收集綠藻。將收取的2種新鮮藻液按照1∶1的比例置于50 mL離心管內(nèi)，配平后置于高溫冷凍離心機(jī)內(nèi)，20 ℃、8 000 r·min-1離心5 min，棄去上清，加入適量純水，將沉淀?yè)u勻后重復(fù)進(jìn)行離心，洗滌2次之后，加入適量純水，搖勻后用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Cellometer Mini, Nexcelom，美國(guó))測(cè)定綠藻細(xì)胞密度，適當(dāng)稀釋至所需密度后置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 BG11液體培養(yǎng)基配方Table 1 The formulation of BG11 medium

表2 A5痕量金屬溶液配方Table 2 The formulation of A5 trace metal solution medium

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 4,4’-DDT濃度設(shè)置及母液配制

本研究以4,4’-DDT的CCC為標(biāo)準(zhǔn)，在高于其一個(gè)數(shù)量級(jí)和低于其一個(gè)數(shù)量級(jí)分別設(shè)置一個(gè)濃度梯度，從而比較LOEC與暴露時(shí)間之間的關(guān)系。之前的研究表明暴露時(shí)間延長(zhǎng)可能使LOEC在數(shù)量級(jí)上降低，設(shè)置濃度梯度能探究4,4’-DDT全生命周期暴露是否也存在這種現(xiàn)象，從而揭示其是否能準(zhǔn)確評(píng)估化學(xué)污染物的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)[12]。4,4’-DDT的CCC為1 ng·L-1，據(jù)此本研究選取10 ng·L-1為最高濃度，1 ng·L-1為次高濃度，0.1 ng·L-1為最低濃度，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行，同時(shí)設(shè)置一個(gè)溶劑對(duì)照組。之前的研究表明，體積分?jǐn)?shù)為0.01%的DMSO不會(huì)對(duì)大型溞造成毒性效應(yīng)，因此本研究以溶劑對(duì)照作為空白對(duì)照[12]。暴露液的體積為1 000 mL，為了保證對(duì)照組DMSO的體積分?jǐn)?shù)為0.01%，加入母液的體積應(yīng)為100 μL。

4,4’-DDT原液的濃度為100 ng·μL-1，先吸取50 μL原液于棕色玻璃瓶?jī)?nèi)，加入950 μL DMSO，配制成5 000 ng·mL-1的母液，然后將其稀釋5倍，得到1 000 ng·mL-1的母液，然后將母液按照梯度稀釋的方法依次稀釋，得到100、10和1 ng·mL-1的母液。將這3個(gè)濃度的母液吸取100 μL加入1 000 mL的暴露液中，得到4,4’-DDT的濃度即為10、1和0.1 ng·L-1，對(duì)照組加入等體積DMSO。

1.4.2 全生命周期暴露取樣時(shí)間點(diǎn)的確定

根據(jù)之前繪制的大型溞全生命周期特征曲線[12]，將大型溞的全生命周期分為生長(zhǎng)階段(0～12 d)、繁殖階段(13～53 d)和死亡階段(54 d～自然死亡)。為了與21 d慢性毒性測(cè)試作比較，選擇的取樣時(shí)間點(diǎn)分別為第6天、第21天、第32天和第55天，其中第6天、第32天和第55天分別是生長(zhǎng)、繁殖和死亡階段的代表性取樣時(shí)間點(diǎn)。

1.4.3 4,4’-DDT對(duì)大型溞全生命周期暴露及取樣

暴露實(shí)驗(yàn)使用1 000 mL的圓底燒杯，暴露培養(yǎng)液與日常培養(yǎng)保持一致，每個(gè)燒杯中盛入1 000 mL連續(xù)曝氣48 h的過(guò)濾自來(lái)水和50只出生<12 h的幼溞，保證每只幼溞所占的平均體積為20 mL。在暴露體系中加入不同濃度的4,4’-DDT母液，使體系中4,4’-DDT的濃度達(dá)到設(shè)定值，在空白對(duì)照中加入等體積的DMSO。在恒溫光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件與日常培養(yǎng)保持一致，每天喂食一次，每隔一天換水一次，每次換水完成后都隨機(jī)打亂燒杯在培養(yǎng)箱內(nèi)的位置，排除光照不勻等因素對(duì)實(shí)驗(yàn)造成的誤差。

從暴露的第0天起，每天觀測(cè)對(duì)照組和暴露組大型溞的生長(zhǎng)、繁殖和存活情況，并記錄每個(gè)燒杯內(nèi)存活的大型溞個(gè)數(shù)和每天新產(chǎn)出的子代總個(gè)數(shù)，每日新產(chǎn)出的子代在計(jì)數(shù)完成后需移出培養(yǎng)體系。在暴露的第6天、第21天、第32天和第55天，取樣前需先測(cè)定大型溞F0代和F1代的體長(zhǎng)(從頭盔至尾巴基部的長(zhǎng)度)、大型溞的心率和行為參數(shù)。體長(zhǎng)測(cè)量方法為：從每個(gè)燒杯內(nèi)隨機(jī)取8只大型溞，使用軟件Image Pro Plus和LEICA DFC450C(德國(guó))拍照并測(cè)量體長(zhǎng)，記為F0代體長(zhǎng)。收集取樣當(dāng)日新產(chǎn)出的子代(<24 h)10只，測(cè)量體長(zhǎng)，記為F1代體長(zhǎng)。心率的測(cè)定方法為：從每只燒杯內(nèi)隨機(jī)選取3只大型溞，使用LEICA DFC450C(德國(guó))和Camtasia Studio軟件，待大型溞心率平穩(wěn)后，在顯微鏡下將大型溞的心臟搏動(dòng)拍攝為視頻(50 f·s-1)，然后以慢動(dòng)作播放視頻并計(jì)數(shù)60 s內(nèi)的心跳次數(shù)。行為參數(shù)測(cè)定方法為：用動(dòng)物行為儀DanioVision(Noldus，荷蘭)監(jiān)測(cè)并拍攝大型溞在1 h內(nèi)(40 min光照+20 min黑暗)的水平游泳軌跡，隨后用Ethovision XT 13軟件分析計(jì)算其水平方向的游泳速度。由于本研究中大型溞的行為測(cè)定采用的是二維成像系統(tǒng)，為了最大程度消除垂直運(yùn)動(dòng)的影響，測(cè)定行為參數(shù)時(shí)選取的水深在不影響大型溞正常游動(dòng)的情況下盡可能小，以限制大型溞在垂直方向上的運(yùn)動(dòng)，之前的幾項(xiàng)研究也是通過(guò)在扁平的容器內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)以消除大型溞垂直方向運(yùn)動(dòng)的影響[23-25]。本研究均采取10 mm水深，大型溞的垂直運(yùn)動(dòng)可忽略不計(jì)。

各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定結(jié)束后對(duì)大型溞進(jìn)行取樣，為了保證能提取足量的總RNA，根據(jù)大型溞個(gè)體大小的差異，在第6天、第21天、第32天和第55天所取樣本數(shù)分別為15、10、5和5只。將大型溞樣本取至做好標(biāo)記的RNAase-free EP管內(nèi)，充分吸干水分后加入600 μL TRIzol和4～5顆勻漿鋼珠，用細(xì)胞破碎儀勻漿后置于-80 ℃凍存。

1.4.4 大型溞的階段特異性PCR array

本研究基因轉(zhuǎn)錄的檢測(cè)采用先前建立的大型溞階段特異性PCR array[12]。簡(jiǎn)言之，將大型溞的全生命周期分為為出生階段、生長(zhǎng)階段、繁殖階段和死亡階段。據(jù)推測(cè)，當(dāng)大型溞從某一個(gè)生命階段進(jìn)入下一個(gè)生命階段時(shí)，一些基因的轉(zhuǎn)錄將被上調(diào)以實(shí)現(xiàn)下一階段的生物學(xué)功能。因此采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序手段篩選每2個(gè)連續(xù)的生命階段之間上調(diào)的基因，開(kāi)發(fā)大型溞的階段特異性的PCR array。在以往的研究中，類似的假設(shè)也常被用來(lái)篩選具有階段特異性功能的基因[26-27]。在本研究中，大型溞階段特異性PCR array的開(kāi)發(fā)步驟為：(1)分別獲取第0天與第6天、第6天與第32天以及第32天與第62天之間的差異轉(zhuǎn)錄基因，并且對(duì)差異性上調(diào)的所有基因進(jìn)行KEGG pathway分析，得到第0天與第6天、第6天與第32天以及第32天與第62天之間顯著性上調(diào)的所有代謝通路，分別定義為生長(zhǎng)、繁殖和死亡階段的關(guān)鍵通路；(2)將3個(gè)階段的所有關(guān)鍵通路按照富集因子(rich factor, RF)值從大到小排序；(3)選取每個(gè)階段中RF排名前五的代謝通路進(jìn)行重點(diǎn)研究，在每條代謝通路中，選取基因倍數(shù)變化(fold change)最大的5個(gè)基因(readcount≥10)構(gòu)建大型溞的階段特異性PCR array。從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中挖掘出在4個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)錄均維持穩(wěn)定的基因作為內(nèi)參基因(internal control)，本研究的內(nèi)參基因?yàn)閎cl2(hypothetical protein DAPPUDRAFT_311135 )。據(jù)此開(kāi)發(fā)的大型溞階段特異性PCR array中所包含的基因及詳細(xì)信息列在表3中。

表3 大型溞階段特異性PCR array包含的代謝通路及基因Table 3 List of genes and corresponding pathways in the developed stage-specific PCR array of Daphnia magna

1.4.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

分別使用第6天、第32天和第55天的大型溞樣品檢測(cè)階段特異性PCR array中生長(zhǎng)階段、繁殖階段和死亡階段關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄情況?？俁NA的提取采用TRIzol法，RNA濃度和純度的檢測(cè)使用Epoch Microplate分光光度計(jì)(BioTek Instruments, Inc，美國(guó))，檢測(cè)RNA樣品在260 nm/280 nm波長(zhǎng)下的比值，若該比值在1.90～2.10之間，則確定所得RNA純度較高，可用于反轉(zhuǎn)錄，RNA濃度的測(cè)定是根據(jù)樣品在260 nm波長(zhǎng)下的光吸收度來(lái)確定的。反轉(zhuǎn)錄使用Prime Script RT reagent kits (Takara公司，大連，中國(guó))試劑，所使用RNA的量為500 ng，根據(jù)試劑盒的步驟將所提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，各試劑用量如下：5X Prime Script Buffer (for Real time) 2 μL，Prime Script RT Enzyme Mix 0.5 μL，Oligo Dt Primer (50 μmol·L-1) 0.5 μL，Random 6 mers (100 μmol·L-1) 0.5 μL，RNase Free dH2O 1.5 μL，Total RNA 5 μL。加樣完成并離心后放置于PCR儀中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，PCR儀反應(yīng)條件設(shè)置為：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s。反應(yīng)完成后得到cDNA。稀釋20倍后可用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)使用SYBR Green Primex Ex TaqⅡ kits (Takara公司，大連，中國(guó))試劑。各試劑用量如下：SYBR Green Mix試劑10 μL，DEPC水6 μL，Rox Reference Dye試劑0.4 μL，Primer F 0.8 μL，Primer R 0.8 μL，cDNA 2 μL。基因引物的設(shè)計(jì)使用的是Primer Premier 6軟件，擴(kuò)增條件設(shè)置為：95 ℃，2 min；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；共計(jì)40個(gè)循環(huán)。與之前的研究[12, 28]相同，本研究數(shù)據(jù)采用CT值計(jì)算，采用2-△△CT法分析，最后將轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)以fold change形式呈現(xiàn)。

1.4.6 數(shù)據(jù)分析與處理

本研究中數(shù)據(jù)分析使用Kyplot Demo 3.0 (Tokyo, Japan)軟件，參數(shù)方差的正態(tài)性和同質(zhì)性分別使用Kolmogorov-Smirnov和Levene’s檢驗(yàn)。處理組與對(duì)照組之間差異性的檢驗(yàn)使用的是one-way analysis of variance，在本實(shí)驗(yàn)中所有分析的顯著性水平設(shè)置為P<0.05。

2 結(jié)果(Results)

2.1 4,4’-DDT全生命周期暴露對(duì)大型溞生長(zhǎng)的影響

F0代的體長(zhǎng)是大型溞的生長(zhǎng)指標(biāo)。如圖1所示，與對(duì)照組相比，0.1、1和10 ng·L-1的4,4’-DDT暴露對(duì)大型溞F0代的體長(zhǎng)在第6天、第21天、第32天和第55天均沒(méi)有產(chǎn)生顯著性的影響。

圖1 4,4’-DDT (0.1、1和10 ng·L-1)暴露第6天、第21天、 第32天和第55天對(duì)大型溞F0代體長(zhǎng)的影響注：數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。Fig. 1 The effects of 4,4’-DDT (0.1, 1, 10 ng·L-1) on the body length of Daphnia magna of F0 generation after exposure to 4,4’-DDT for 6, 21, 32 or 55 dNote: Data was represented by mean±standard deviation.

2.2 4,4’-DDT全生命周期暴露對(duì)大型溞生殖的影響

本研究大型溞的子代全部由孤雌生殖得到，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中未出現(xiàn)有性生殖現(xiàn)象。大型溞的生殖指標(biāo)包括平均累積產(chǎn)溞數(shù)和F1代體長(zhǎng)，分別為生殖數(shù)量和生殖質(zhì)量的指標(biāo)，綜合體現(xiàn)大型溞的繁殖力。如圖2(a)所示，與對(duì)照組相比，0.1、1和10 ng·L-1的4,4’-DDT暴露對(duì)大型溞的平均累積產(chǎn)溞數(shù)沒(méi)有顯著性影響。由圖2(b)可知，與對(duì)照組相比，10 ng·L-1的4,4’-DDT在暴露第21天、第32天和第55天均顯著性降低了F1代體長(zhǎng)，在這3個(gè)時(shí)間點(diǎn)體長(zhǎng)降低的百分比分別為4.00%、2.70%和3.32%。其余2個(gè)濃度組對(duì)F1代體長(zhǎng)沒(méi)有顯著性影響。

圖2 4,4’-DDT (0.1、1和10 ng·L-1)全生命周期暴露對(duì)大型溞生殖的影響注：數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，*代表P<0.05，與對(duì)照組相比有顯著性差異。Fig. 2 The effects of 4,4’-DDT (0.1, 1, 10 ng·L-1) on the reproduction of Daphnia magna after the whole-life-stage exposureNote: Data was represented by mean±standard deviation; *represented P<0.05, and compared with control, the exposure group had significant difference.

2.3 4,4’-DDT全生命周期暴露對(duì)大型溞心率的影響

如圖3所示，4,4’-DDT全生命周期暴露顯著性改變了大型溞的心率。在暴露的第6天和第21天，大型溞的心率在1 ng·L-1和10 ng·L-1濃度組出現(xiàn)了顯著性的增加，其他濃度組沒(méi)有顯著性效應(yīng)；而在第32天和第55天，0.1 ng·L-1的4,4’-DDT對(duì)其心率也產(chǎn)生了顯著性影響。由此可見(jiàn)，4,4’-DDT對(duì)大型溞心率的LOEC在不同的生命階段出現(xiàn)了變化，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，LOEC從第21天的1 ng·L-1降低為第32天的0.1 ng·L-1，降低了一個(gè)數(shù)量級(jí)。

圖3 4,4’-DDT (0.1、1和10 ng·L-1)暴露第6天、 第21天、第32天和第55天對(duì)大型溞心率的影響注：數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，*代表P<0.05， 與對(duì)照組相比有顯著性差異。Fig. 3 The effects of 4,4’-DDT (0.1, 1, 10 ng·L-1) on the heart rate of Daphnia magna after exposure to 4,4’-DDT for 6, 21, 32 or 55 dNote: Data was represented by mean±standard deviation; *represented P<0.05, and compared with control, the exposure group had significant difference.

2.4 4,4’-DDT全生命周期暴露對(duì)大型溞行為的影響

由圖4可知，4,4’-DDT在不同的生命階段對(duì)大型溞游泳速度的影響是不同的。在暴露第6天，4,4’-DDT顯著性增加大型溞的游泳速度，LOEC為0.1 ng·L-1；在第21天，4,4’-DDT對(duì)大型溞的游泳速度沒(méi)有顯著性影響；在第32天和第55天，大型溞的游泳速度在4,4’-DDT作用下出現(xiàn)了顯著性降低，LOEC均為0.1 ng·L-1。由此可見(jiàn)，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，4,4’-DDT對(duì)大型溞游泳行為的影響從促進(jìn)到無(wú)影響到抑制，促進(jìn)和抑制作用的LOEC均為0.1 ng·L-1。

圖4 4,4’-DDT (0.1、1和10 ng·L-1)暴露第6天、 第21天、第32天和第55天對(duì)大型溞行為的影響注：數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，*代表P<0.05，與對(duì) 照組相比有顯著性差異。Fig. 4 The effects of 4,4’-DDT (0.1, 1, 10 ng·L-1) on the swimming speed of Daphnia magna after exposure to 4,4’-DDT for 6, 21, 32 or 55 dNote: Data was represented by mean±standard deviation; *represented P<0.05, and compared with control, the exposure group had significant difference.

2.5 4,4’-DDT全生命周期暴露對(duì)大型溞存活的影響

如圖5所示，與對(duì)照組相比，0.1、1和10 ng·L-1的4,4’-DDT暴露在第6天、第21天、第32天和第55天對(duì)大型溞的存活率均沒(méi)有產(chǎn)生顯著性影響。對(duì)照組與暴露組的存活率均在暴露第89天降為0%。

圖5 4,4’-DDT (0.1、1和10 ng·L-1)全生命周期 暴露對(duì)大型溞存活的影響注：數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。Fig. 5 The effects of 4,4’-DDT (0.1, 1, 10 ng·L-1) on the survival rate of Daphnia magna after the whole-life-stage exposureNote: Data was represented by mean±standard deviation.

2.6 4,4’-DDT全生命周期暴露對(duì)大型溞基因轉(zhuǎn)錄的影響

圖6顯示了4,4’-DDT暴露對(duì)大型溞階段特異性PCR array中生長(zhǎng)關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄的影響。在生長(zhǎng)階段的17個(gè)關(guān)鍵基因中，與對(duì)照組相比，有11個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄在4,4’-DDT暴露后發(fā)生了顯著性變化，這11個(gè)基因分布在5條代謝通路中。其中，同源重組(homologous recombination)通路中包含5個(gè)基因，分別是rpa1 (DNA-directed RNA polymerase Ⅰ subunit RPA1)、pold1 (DNA polymerase delta subunit 1)、rad54l(DNA repair and recombination protein RAD54 and RAD54-like protein)、rad52 (DNA repair and recombination protein RAD52)、mre11 (double-strand break repair protein MRE11)。其中，rpa1和pold1在10 ng·L-14,4’-DDT暴露下轉(zhuǎn)錄顯著性上調(diào)，rad54l、rad52和mre11在1 ng·L-1或10 ng·L-14,4’-DDT暴露下轉(zhuǎn)錄顯著性下調(diào)。在DNA復(fù)制(DNA replication)通路中，rnaseh1(ribonuclease HI)和rfc3_5 (replication factor C subunit 3/5)的轉(zhuǎn)錄被顯著性下調(diào)，而pold1的轉(zhuǎn)錄出現(xiàn)上調(diào)；在錯(cuò)配修復(fù)(mismatch repair)代謝通路中，rpa1和pold1的轉(zhuǎn)錄被顯著性上調(diào)而msh6 (DNA mismatch repair protein MSH6)和rfc3_5的轉(zhuǎn)錄被下調(diào)；在核苷酸切除修復(fù)(nucleotide excision repair)通路中，除了pold1的轉(zhuǎn)錄在4,4’-DDT作用下被上調(diào)之外，msh6和rfc3_5的轉(zhuǎn)錄均是被顯著性下調(diào)的；在細(xì)胞溶質(zhì)DNA傳感途徑(cytosolic DNA-sensing pathway)中，有3個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄均出現(xiàn)顯著性降低，分別為rpc1_2 (DNA-directed RNA polymerase Ⅲ subunit RPC1)、rpc3 (DNA-directed RNA polymerase Ⅲ subunit RPC3)和rpc1_4 (DNA-directed RNA polymerase Ⅲ subunit RPC1)。

圖6 4,4’-DDT (0.1、1和10 ng·L-1)暴露第6天對(duì)大型溞生長(zhǎng)關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄的影響注：數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，*代表P<0.05，與對(duì)照組相比有顯著性差異。Fig. 6 The effects of 4,4’-DDT (0.1, 1, 10 ng·L-1) on the vital gene transcriptions at the growth stage of Daphnia magna after exposure to 4,4’-DDT for 6 dNote: Data was represented by mean±standard deviation; *represented P<0.05, and compared with control, the exposure group had significant difference.

總體而言，在這11個(gè)轉(zhuǎn)錄被顯著性改變的基因中，只有2個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄是顯著性上調(diào)，另外9個(gè)基因在4,4’-DDT作用下均出現(xiàn)顯著性下調(diào)轉(zhuǎn)錄。

圖7顯示了4,4’-DDT暴露對(duì)大型溞階段特異性PCR array中生殖關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄的影響。在生殖階段的24個(gè)基因中有6個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄在4,4’-DDT暴露下出現(xiàn)顯著性變化，其中hspa1_8_3 (heat shock 70 kDa protein 1/8)的轉(zhuǎn)錄顯著性上調(diào)，abl1 (abelson tyrosine-protein kinase 1)、pik3c(phosphatidylinositol 3-kinase)、prom1 (prominin 1)、sgrap(RAS guanyl-releasing protein 1)和ptch1 (patched 1)的轉(zhuǎn)錄顯著性降低。這6個(gè)基因分布在4條代謝通路中，分別是慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia)通路、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)(transcriptional misregulation in cancer)通路、剪接體(spliceosome)通路和軸突導(dǎo)向(axon guidance)通路。

圖7 4,4’-DDT (0.1、1和10 ng·L-1)暴露第32天對(duì)大型溞生殖關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄的影響注：數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，*代表P<0.05，與對(duì)照組相比有顯著性差異。Fig. 7 The effects of 4,4’-DDT (0.1, 1, 10 ng·L-1) on the vital gene transcriptions at the reproduction stage of Daphnia magna after exposure to 4,4’-DDT for 32 dNote: Data was represented by mean±standard deviation; *represented P<0.05, and compared with control, the exposure group had significant difference.

圖8顯示了4,4’-DDT暴露對(duì)大型溞階段特異性PCR array中死亡關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄的影響。在死亡階段的18個(gè)基因中，有5個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄在0.1、1或10 ng·L-1的4,4’-DDT暴露下出現(xiàn)了顯著性上調(diào)，分別為sgcd(delta-sarcoglycan)、glra1 (glycine receptor alpha)、takr2 (tachykinin-like receptor)、crhr1 (corticotropin releasing hormone receptor 1)和ddc(aromatic-L-amino-acid decarboxylase)，1個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄被顯著性下調(diào)，為actb_g1 (actin beta/gamma 1)。其中上調(diào)的基因主要集中在擴(kuò)張型心肌病(dilated cardiomyopathy)和神經(jīng)活性配體-受體相互作用(neuro active ligand-receptor interaction)這2條代謝通路中。

圖8 4,4’-DDT(0.1、1和10 ng·L-1)暴露第55天對(duì)大型溞死亡關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄的影響注：數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，*代表P<0.05，與對(duì)照組相比有顯著性差異。Fig. 8 The effects of 4,4’-DDT (0.1, 1, 10 ng·L-1) on the vital gene transcriptions at the death stage of Daphnia magna after exposure to 4,4’-DDT for 55 dNote: Data was represented by mean±standard deviation; *represented P<0.05, and compared with control, the exposure group had significant difference.

3 討論(Discussion)

本研究采用先前建立的大型溞全生命周期毒性評(píng)估方法[12]，選取美國(guó)環(huán)境保護(hù)局水質(zhì)基準(zhǔn)文件中的環(huán)境持久性污染物4,4’-DDT為受試化學(xué)污染物及其基準(zhǔn)連續(xù)濃度為暴露濃度，以毒理學(xué)模式生物大型溞為模型開(kāi)展全生命周期暴露實(shí)驗(yàn)，研究依據(jù)部分生命周期毒理學(xué)數(shù)據(jù)得出的污染物閾值濃度在全生命周期暴露下對(duì)水生生物是否會(huì)造成毒性效應(yīng)。采用已開(kāi)發(fā)的大型溞階段特異性PCR array探究4,4’-DDT對(duì)不同生命階段關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄的影響。當(dāng)一條代謝通路中至少有一半基因或者數(shù)目≥3個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄在化學(xué)污染物的影響下發(fā)生顯著性變化時(shí)，即認(rèn)為其是受主要影響的代謝通路[28]，在本研究中采取同樣的規(guī)定。

體長(zhǎng)是大型溞的生長(zhǎng)指標(biāo)，大型溞快速生長(zhǎng)期為出生后的0～12 d，隨后體長(zhǎng)增長(zhǎng)減緩并逐漸趨于穩(wěn)定，到達(dá)平臺(tái)期。本研究中，10 ng·L-1及更低濃度的4,4’-DDT全生命周期暴露對(duì)大型溞的體長(zhǎng)沒(méi)有產(chǎn)生顯著性影響，說(shuō)明該濃度不足以對(duì)大型溞造成發(fā)育毒性。以往的研究表明，當(dāng)4,4’-DDT的濃度超過(guò)50 ng·L-1時(shí)才會(huì)使斑馬魚(yú)的體長(zhǎng)出現(xiàn)顯著性降低[29]，另一項(xiàng)研究表明，1 μg·L-1的4,4’-DDT暴露對(duì)大型溞的生長(zhǎng)并沒(méi)有產(chǎn)生顯著性的影響[30]。由此可見(jiàn)，4,4’-DDT對(duì)大型溞的發(fā)育毒性較低，美國(guó)環(huán)境保護(hù)局水質(zhì)基準(zhǔn)中制定的CCC(1 ng·L-1)對(duì)于大型溞的生長(zhǎng)沒(méi)有產(chǎn)生毒性效應(yīng)。此外，大型溞生長(zhǎng)階段的5條關(guān)鍵代謝通路在4,4’-DDT暴露下均受到了主要影響，其中同源重組(homologous recombination)、DNA復(fù)制(DNA replication)、錯(cuò)配修復(fù)(mismatch repair)和核苷酸切除修復(fù)(nucleotide excision repair)這4條通路內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄既有上調(diào)也有下調(diào)；而細(xì)胞溶質(zhì)DNA傳感(cytosolic DNA-sensing pathway)途徑包含的5個(gè)基因中有3個(gè)的轉(zhuǎn)錄在1 ng·L-1或10 ng·L-14,4’-DDT作用下出現(xiàn)顯著性下調(diào)。細(xì)胞溶質(zhì)DNA傳感(cytosolic DNA-sensing pathway)途徑中，細(xì)胞內(nèi)模式識(shí)別受體的特定家族負(fù)責(zé)檢測(cè)來(lái)自入侵微生物或宿主細(xì)胞的外源DNA，并產(chǎn)生先天免疫應(yīng)答[31-32]，該途徑與生物的先天免疫能力緊密相關(guān)，對(duì)大型溞個(gè)體的正常發(fā)育至關(guān)重要。研究表明，1 ng·L-1或10 ng·L-1的4,4’-DDT暴露顯著性抑制了大型溞免疫相關(guān)途徑中基因的轉(zhuǎn)錄，雖然沒(méi)有造成發(fā)育毒性，但可能在一定程度上降低了機(jī)體的免疫能力。

在生殖方面，10 ng·L-1的4,4’-DDT濃度組F1代體長(zhǎng)出現(xiàn)顯著性降低，這說(shuō)明大型溞的繁殖力降低。一般而言，大型溞投入繁殖活動(dòng)的總能量是固定的，在產(chǎn)溞總數(shù)不變的情況下，為降低總繁殖成本，只能減小子代個(gè)體。在食物、溫度等外界條件不變的前提下，污染物的脅迫是導(dǎo)致大型溞降低繁殖成本的主導(dǎo)因素。此外，較小的個(gè)體在環(huán)境中存活的風(fēng)險(xiǎn)更高。因此，10 ng·L-1的4,4’-DDT對(duì)大型溞造成了一定的生殖毒性。從基因轉(zhuǎn)錄的結(jié)果來(lái)看，沒(méi)有受主要影響的代謝通路存在。因此10 ng·L-1的4,4’-DDT對(duì)大型溞的生殖毒性可能主要來(lái)源于4,4’-DDT脅迫下的應(yīng)激反應(yīng)，美國(guó)環(huán)境保護(hù)局水質(zhì)基準(zhǔn)制定的CCC(1 ng·L-1)對(duì)于大型溞的生殖沒(méi)有產(chǎn)生毒性效應(yīng)。

心率和行為是大型溞毒理學(xué)研究中比較敏感的2個(gè)指標(biāo)，經(jīng)常被用于各種污染物的毒性檢測(cè)中，近些年相關(guān)的研究也得到廣泛開(kāi)展[33-35]。大型溞的心臟位于其頭部后方的背側(cè)，其心臟壁和殼瓣均為透明的，心臟搏動(dòng)可通過(guò)顯微鏡清晰地觀察到[36]。大型溞的游泳行為受到生理、感知、神經(jīng)和肌肉等多方面的影響，并且與其捕食、逃避天敵等行為直接相關(guān)[37-38]。這2個(gè)生理指標(biāo)能夠更敏感地指示一些環(huán)境濃度化學(xué)污染物對(duì)大型溞的毒性效應(yīng)，也能作為大型溞的毒性測(cè)試中生理指標(biāo)的補(bǔ)充，在對(duì)一些持久性環(huán)境污染物進(jìn)行環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估與環(huán)境基準(zhǔn)制定時(shí)應(yīng)予以考慮。大型溞有著與哺乳動(dòng)物類似的肌源性心臟(myogenic heart)，其心率對(duì)許多污染物表現(xiàn)出的反應(yīng)與哺乳動(dòng)物相似[39]。其起搏機(jī)制與一組獨(dú)特的離子通道有關(guān)，包括超極化激活、環(huán)核苷酸門控(HCN)和T型鈣離子通道[40]。心率的變化能夠反映出污染物對(duì)水生生物能量代謝的影響以及污染物進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)的程度[41]。許多研究表明，外源物質(zhì)能夠顯著性影響大型溞的心率，且不同的物質(zhì)表現(xiàn)出的反應(yīng)不同[41-42]。例如，尼古丁暴露能降低大型溞的心率，而乙醇則能增加其心率[43]。此外，全氟辛烷磺酸(PFOS)會(huì)導(dǎo)致大型溞心律失常[44]。我們之前的研究也表明，磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯(TDCIPP)暴露后大型溞可能死于心臟功能的喪失，并且TDCIPP能夠加速心臟功能喪失的進(jìn)程[12]。本研究中，4,4’-DDT暴露導(dǎo)致大型溞心率的增加可能與其代謝增強(qiáng)相關(guān)，機(jī)體增加基礎(chǔ)代謝從而抵御4,4’-DDT的脅迫。并且隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，LOEC的降低說(shuō)明4,4’-DDT在大型溞體內(nèi)的不斷累積，對(duì)大型溞的毒性增強(qiáng)。之前的研究也指出，DDT在大型溞體內(nèi)具有一定的生物累積性，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，其在大型溞體內(nèi)的濃度會(huì)逐漸升高，并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，最終濃度可達(dá)到幾千mg·kg-1[45]。在本研究中，即使是最低濃度的4,4’-DDT(0.1 ng·L-1)也會(huì)對(duì)大型溞的心率造成顯著性影響，說(shuō)明心率比生長(zhǎng)生殖指標(biāo)更加敏感。研究表明，大型溞的游泳速度隨著體長(zhǎng)的增長(zhǎng)而增加[46]，因此影響體長(zhǎng)的因素可能也會(huì)影響大型溞的游泳速度[24]。本研究中大型溞的體長(zhǎng)沒(méi)有發(fā)生顯著性變化，因此其體長(zhǎng)不是影響游泳速度的因素。有研究發(fā)現(xiàn)，蚤狀溞(Daphniapulex)的游泳速度隨著污染物暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，會(huì)先上升到一個(gè)峰值，然后降低，這可能是對(duì)污染物脅迫短時(shí)間內(nèi)的反應(yīng)[47]。4,4’-DDT對(duì)大型溞游泳速度的影響也是先促進(jìn)后抑制，并且LOEC均為0.1 ng·L-1。與心率一樣，行為參數(shù)也比生長(zhǎng)和生殖指標(biāo)更為敏感，因此對(duì)于心率和行為而言，美國(guó)環(huán)境保護(hù)局水質(zhì)基準(zhǔn)制定的CCC(1 ng·L-1)在全生命周期暴露下對(duì)大型溞表現(xiàn)出一定毒性效應(yīng)。

在存活方面，10 ng·L-1及較低濃度的4,4’-DDT暴露并沒(méi)有影響大型溞的平均壽命。之前一項(xiàng)急性毒性研究表明，4,4’-DDT對(duì)大型溞14 d的半數(shù)致死濃度(lethal concentration 50%, LC50)為670 ng·L-1[48]，本研究所設(shè)置的濃度相對(duì)較低，沒(méi)有對(duì)大型溞產(chǎn)生致死性。死亡階段基因轉(zhuǎn)錄的結(jié)果顯示，在4,4’-DDT作用下受主要影響的代謝通路只有神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路，該通路是質(zhì)膜上所有與細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)通路相關(guān)的受體和配體的集合[49]，說(shuō)明4,4’-DDT暴露對(duì)大型溞死亡階段的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)具有一定干擾作用。但是總體而言，美國(guó)環(huán)境保護(hù)局水質(zhì)基準(zhǔn)制定的CCC(1 ng·L-1)對(duì)大型溞的存活沒(méi)有造成顯著性毒性效應(yīng)。

總而言之，美國(guó)環(huán)境保護(hù)局水質(zhì)基準(zhǔn)中對(duì)4,4’-DDT制定的CCC在全生命周期暴露下對(duì)大型溞的生長(zhǎng)、生殖和存活均未造成顯著性毒性效應(yīng)，但是對(duì)其心率和行為會(huì)造成顯著的毒性效應(yīng)。基因轉(zhuǎn)錄結(jié)果表明，4,4’-DDT在生長(zhǎng)階段和死亡階段分別改變了大型溞與免疫功能和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)功能相關(guān)代謝通路中基因的轉(zhuǎn)錄。此外對(duì)于心率而言，隨著暴露時(shí)間延長(zhǎng)，其LOEC從第21天的1 ng·L-1降低至第32天的0.1 ng·L-1，說(shuō)明即使在0.1 ng·L-1暴露條件下仍然能夠觀察到4,4’-DDT對(duì)大型溞的毒性效應(yīng)。因此在對(duì)一些持久性環(huán)境污染物進(jìn)行環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估與環(huán)境基準(zhǔn)制定時(shí)，全生命周期毒性測(cè)試應(yīng)得到適當(dāng)考慮。