金向楠 高薇 馮欣 隋海娟 付強

錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1風(fēng)濕免疫科，3骨科（遼寧錦州121000）；2錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)藥理學(xué)教研室（遼寧錦州121000）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以累及外周小關(guān)節(jié)為主要表現(xiàn)的難治性自身免疫性炎性疾病［1-2］。其病理學(xué)特征體現(xiàn)為滑膜組織過度增生，大量炎細(xì)胞浸潤，關(guān)節(jié)軟骨和骨的進行性破壞［3-4］。盡管近年對RA 機制的進一步認(rèn)識推動對該病治療的進展，新藥和新療法層出不窮，也極大地改善了患者的預(yù)后，但是目前臨床上仍存在諸多難題，缺乏安全有效的治療方法［5-6］。因此進一步探討及尋找有效的干預(yù)藥物具有十分重要的科學(xué)意義。

金絲桃苷（hyperoside，Hyp）又名槲皮素-3-Oβ-D-吡喃半乳糖苷，屬黃酮醇苷類化合物，廣泛存在于各種植物體內(nèi)，如金絲桃科、薔薇科、桔?？?、葵科、藤黃科、豆科等的果實與全草中，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化，改善心血管循環(huán)功能等藥物作用［7］。Hyp 通過抑制腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α），白細(xì)胞介素6（interleukin 6，IL-6）和一氧化氮（NO）等炎癥因子的產(chǎn)生，有顯著的抗炎作用，在體外可以顯著抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖。

筆者前期的研究已證實［8-9］，金絲桃苷可以抑制人的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的成纖維樣滑膜細(xì)胞的過度增殖，并通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NFκB）的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控多種基因表達(dá)產(chǎn)生抗炎作用。本實驗通過膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠（collagen induced arthritis，CIA）模型針對Hyp 是否會對RA有抗炎和抑制軟骨受侵蝕作用進行研究，為該藥在臨床上治療RA 提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物8 周齡雄性DBA/1 小鼠45 只，體質(zhì)量20 ～24 g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，SPF 級飼養(yǎng)。

1.1.2 主要藥品、試劑與儀器金絲桃苷（Hyperoside），黃色粉末，純度＞98%，購于南京春秋生物工程有限公司；IL-6 購于Sigma 公司；弗氏完全佐劑及牛Ⅱ型膠原蛋白購于Sigma 公司，HE 染色試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所，其他相關(guān)試劑均由錦州醫(yī)科大學(xué)藥理實驗室提供。倒置相差顯微鏡，日本Olympus 公司。Luminex200 型多功能流式液相芯片分析儀，美國Millipore 公司。切片機，日本Yamato 公司。電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CIA 小鼠模型的建立，分組和用藥方法小鼠隨機分為正常對照組（8只），膠原誘導(dǎo)組（35只）。將牛Ⅱ型膠原溶于0.01 mol/L 的冰醋酸溶液中，使其終濃度為2 mg/mL，4 ℃過夜。取上述溶液與弗式完全佐劑等體積混合乳化，得到終濃度為1 mg/mL的牛Ⅱ型膠原乳化液。初次免疫在膠原誘導(dǎo)組小鼠尾根部注射150 μL 混合乳液，將初次免疫定為第0 天，增強免疫于第21 天再次注射150 μL 同樣新鮮制備的混合乳液，正常對照組均給予等量生理鹽水注射［10］。初次免疫4 周后開始，動態(tài)觀察小鼠的足掌厚度測量及臨床關(guān)節(jié)炎指數(shù)變化，檢查小鼠關(guān)節(jié)炎發(fā)病及嚴(yán)重程度，每周觀察2 ～3 次并進行臨床關(guān)節(jié)炎評分，第31 天在膠原誘導(dǎo)組中挑選出評分為2 分的小鼠隨機分為三組（每組8 只），進一步分為誘導(dǎo)組和藥物治療組（25 mg/kg和50 mg/kg）。金絲桃苷采用腹腔內(nèi)注射，每天一次直至處死。第52 天處死，取小鼠后踝關(guān)節(jié)，常規(guī)固定、脫鈣、石蠟包埋及切片處理，用于HE 染色。見圖1。

圖1 CIA 小鼠模型的誘導(dǎo)和給藥處理方法Fig.1 Induction and treatment of CIA model mice

1.2.2 足掌厚度測量及關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分初次免疫4 周后，以電子游標(biāo)卡尺測量小鼠足掌厚度，每周2 ～3 次，檢查小鼠關(guān)節(jié)炎發(fā)病及嚴(yán)重程度，每周觀察2 ～3 次并進行臨床關(guān)節(jié)炎評分。關(guān)節(jié)炎炎癥指數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn)：0 分，關(guān)節(jié)正常、無紅腫；1 分，小趾關(guān)節(jié)輕微紅腫；2 分，趾關(guān)節(jié)和足跖腫脹；3 分，踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹；4 分，包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹，伴有關(guān)節(jié)僵硬或強直；每只小鼠的關(guān)節(jié)炎癥的總評分為四肢評分的總和，每只小鼠的最高分值為16 分，關(guān)節(jié)總評分大于1 的小鼠為建模成功小鼠［11］。

1.2.3 血清細(xì)胞因子測定動態(tài)觀察并給藥至第52 天后，處死，取血清，采用ELISA 法測定小鼠血清中TNF-α及IL-6 的含量。按照ELISA試劑盒說明書進行操作，每孔分別加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品100 μL，放置于36 ℃水浴箱孵育90 min，充分洗滌5 次，再加入一抗100 μL/孔，再次36 ℃孵育60 min。洗板5次，加酶標(biāo)抗體100 μL/孔，避光36 ℃孵育30 min，再次洗板5 次后，加入底物100 μL/孔，避光36 ℃孵育15 min，加入終止液，用酶標(biāo)儀在450 nm 波長條件下測定各孔OD 值。

1.2.4 組織病理學(xué)評估動態(tài)觀察并給藥至第52天后，處死，取小鼠后踝關(guān)節(jié)，常規(guī)固定、脫鈣、石蠟包埋及切片處理。HE 染色：將準(zhǔn)備好的切片，常規(guī)經(jīng)過二甲苯及梯度濃度酒精脫蠟至水。入蘇木素染色10 min，蒸餾水沖洗，酸性乙醇分化3 s，蒸餾水洗1 min。入伊紅染色5 min，蒸餾水沖洗。脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察組織病理學(xué)改變并拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法以上實驗均重復(fù)至少3 次，數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 軟件處理分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較應(yīng)用單因素方差分析，P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hyp 對CIA 模型小鼠足腫脹度的影響模型組小鼠于免疫后第28 天開始出現(xiàn)后爪部及踝關(guān)節(jié)輕微腫脹，逐漸皮膚發(fā)紅，至第46 天左右CIA 模型組小鼠關(guān)節(jié)紅腫達(dá)到最高峰，部分小鼠皮膚出現(xiàn)結(jié)節(jié)、紅斑甚至潰爛，第52 天發(fā)現(xiàn)有的小鼠關(guān)節(jié)伴有僵直。同時模型組小鼠伴有飲食及活動減少，體質(zhì)量增長減慢，毛色泛黃無光澤。與模型組相比，用藥組早期也出現(xiàn)關(guān)節(jié)輕微腫脹，第31 天給藥后小鼠關(guān)節(jié)炎癥進展明顯減慢，腫脹程度明顯減低。而正常對照組未出現(xiàn)小鼠關(guān)節(jié)紅腫，直至第52 天處死未出現(xiàn)任何癥狀及體征改變。見圖2A。在CIA 模型進展過程中，模型對照組小鼠的足掌厚度逐漸增加，與模型對照組相比，金絲桃苷25 mg/kg 治療組和金絲桃苷50 mg/kg 治療組小鼠的足掌厚度均降低，且用藥劑量50 mg/kg 治療組更為明顯，與模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖2B。

圖2 金絲桃苷對CIA模型小鼠足腫脹度的影響Fig.2 Effect of Hyperoside on Paw swelling in CIA model mice

2.2 Hyp對CIA模型小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響CIA模型組小鼠免疫后第28 天開始發(fā)病，首先出現(xiàn)小趾關(guān)節(jié)輕微腫脹，然后蔓延至足跖及踝關(guān)節(jié)明顯紅腫，最后累積至踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹，有的小鼠伴有關(guān)節(jié)僵硬或強直。CIA 模型組小鼠于第46 天臨床關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分達(dá)到最高，隨后逐漸下降，不同濃度的金絲桃苷治療組的評分從第31天開始與CIA 模型組相比顯著下降，高劑量金絲桃苷治療組評分較低劑量治療組下降更為顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖3。

圖3 金絲桃苷對CIA 模型小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響Fig.3 Effect of Hyperoside on joint inflammatory index in CIA model mice

2.3 Hyp 對CIA 模型小鼠血清TNF-α及IL-6 含量的影響用ELISA 法測定小鼠血清中TNF-α及IL-6 的含量，來評定是否金絲桃苷可以抑制CIA模型小鼠炎癥因子的產(chǎn)生。ELISA 結(jié)果顯示，CIA模型組小鼠血清中TNF-α及IL-6 的含量明顯增加，與正常對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），而用藥組劑量為25、50 mg/kg 的Hyp 使得小鼠血清中TNF-α及IL-6 的含量成劑量依賴性降低。統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)：模型組與用藥組25 mg/kg 相比（P＜0.05），模型組與用藥組50 mg/kg 相比均差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖4。

圖4 金絲桃苷對CIA 模型小鼠血清TNF-α及IL-6 含量的影響Fig.4 Effect of Hyperoside on serum concentration of interleukin-6（IL-6）and tumor necrosis factor-α（TNF-α）in CIA model mice

2.4 Hyp 對CIA 模型小鼠踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)變化的影響進行HE 染色觀察小鼠踝關(guān)節(jié)滑膜增生及炎癥浸潤情況，與正常對照組相比，CIA 模型組滑膜組織增生明顯，且伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤。與模型組相比，金絲桃苷高劑量組滑膜組織形態(tài)較好，僅有少量炎癥細(xì)胞浸潤，與正常對照組形態(tài)基本接近。病理學(xué)染色表明金絲桃苷對CIA 小鼠關(guān)節(jié)的病理組織結(jié)構(gòu)有明顯的改善作用，可明顯減輕上述病理變化。見圖5。

圖5 金絲桃苷對CIA 模型小鼠踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)變化的影響（HE 染色，×200）Fig.5 Effect of Hyperoside on histopathological changes of ankle joints in CIA model mice（HE stained，×200）

3 討論

RA 的發(fā)病機制在整個病理生理過程中集中體現(xiàn)在自身免疫性炎癥，滑膜組織增生及關(guān)節(jié)軟骨和骨的進行性破壞，并且它們之間相互作用，形成了復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)［4，12-13］。膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠模型是目前研究類風(fēng)濕的動物模型［14］，CIA 的特征是多關(guān)節(jié)炎，發(fā)病機制和病理特征與人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎類似，CIA 的建立極大的推進了RA 發(fā)病機制及治療等方面的研究［10］。本實驗研究利用牛Ⅱ型膠原與弗氏佐劑誘導(dǎo)了CIA 小鼠模型，小鼠在免疫后第28 天開始出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹，至第46 天關(guān)節(jié)腫脹最為嚴(yán)重，有的小鼠伴有皮膚結(jié)節(jié)，紅斑甚至潰爛，最終出現(xiàn)關(guān)節(jié)僵直［15］。在第28 ～52 天對CIA 小鼠的足掌厚度及臨床關(guān)節(jié)炎指數(shù)評估的研究結(jié)果表明，金絲桃苷能顯著減輕CIA 小鼠模型關(guān)節(jié)炎的癥狀，表現(xiàn)為其治療組小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分明顯低于模型組，組織學(xué)結(jié)果表明治療組小鼠關(guān)節(jié)滑膜增生和炎癥細(xì)胞浸潤減輕。由此提示，金絲桃苷對于CIA 小鼠模型具有一定的治療作用。

在RA 患者的血清或關(guān)節(jié)液中，可檢測到高水平的促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，如TNF-α、IL-6、IL-1、IL-1β及細(xì)胞黏附分子（如ICAM 1）等，同樣的CIA 小鼠模型在發(fā)生發(fā)展中也會出現(xiàn)炎癥因子的大量釋放［16-18］。這些促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生增多，可以進一步刺激滑膜細(xì)胞的增殖，過度增殖的滑膜細(xì)胞又可以繼續(xù)上調(diào)細(xì)胞因子的水平，并誘導(dǎo)和提高蛋白酶表達(dá)水平的增多，進而促進了軟骨和骨的破壞［19-21］。本實驗通過ELISA 檢測細(xì)胞因子，測得金絲桃苷可以呈劑量依賴性的抑制TNF-α及IL-6 的產(chǎn)生［22］。還進一步通過組織病理學(xué)染色，同樣證實了金絲桃苷對滑膜細(xì)胞過度增生，關(guān)節(jié)周圍滑膜組織炎癥細(xì)胞浸潤有明顯的改善作用。由此證明，金絲桃苷具有抗炎作用，但目前的作用機制尚不明確，仍有待進一步研究。綜上提示，金絲桃苷對CIA 小鼠具有治療作用，并且其對關(guān)節(jié)炎的治療作用可能與抗炎作用有關(guān)。

本研究對小鼠足爪腫脹程度的觀察、足掌厚度及臨床關(guān)節(jié)炎指數(shù)的評分，發(fā)現(xiàn)金絲桃苷對于CIA 小鼠模型有顯著的治療作用。金絲桃苷是通過降低細(xì)胞因子的產(chǎn)生，起到有效抑制CIA 小鼠模型滑膜增生，炎癥反應(yīng)的作用。這些結(jié)果從整體水平上證實了金絲桃苷對RA 的治療作用，不僅豐富了治療RA 的臨床研究，也為中藥治療RA 提供新的研究方法和思路。目前RA 的治療的最重要的目標(biāo)是預(yù)防骨質(zhì)破壞，以維持正常的關(guān)節(jié)功能，盡管臨床上對于治療它有了很大的進步，也極大地改善了病人的預(yù)后，但仍缺乏安全有效的治療方法。金絲桃苷有望成為一種副作用小的中藥，對RA 起到抗炎，抗風(fēng)濕的治療作用。