張祎明,宋 陽(yáng),高 揚(yáng),張 靜,韓玉琴

(承德市兒童醫(yī)院麻醉科,承德 067000;*通訊作者,E-mail:zhangyimingcd@yeah.net)

七氟醚是外科手術(shù)中常用的吸入麻醉劑,因其氣道刺激性小、麻醉過程平穩(wěn)、蘇醒迅速等特點(diǎn),廣泛應(yīng)用于新生兒、嬰幼兒的手術(shù)麻醉[1]。妊娠后期至出生后6個(gè)月是人類大腦發(fā)育的高峰期[2]。既往研究表明,新生兒早期多次暴露于七氟醚與其學(xué)習(xí)認(rèn)知功能障礙有關(guān)[3-5]。目前研究發(fā)現(xiàn),七氟醚對(duì)學(xué)習(xí)認(rèn)知功能障礙的影響可能與其誘導(dǎo)海馬區(qū)一些基因的改變從而降低海馬神經(jīng)元的再生和存活有關(guān),但具體機(jī)制尚不清楚[6,7]。

微小RNA(miRNAs)是一類小的非編碼RNA,由22-25個(gè)核苷酸組成,存在于所有真核生物中,參與細(xì)胞生命活動(dòng)的調(diào)控[8]。研究顯示miRNA介導(dǎo)的基因調(diào)控與神經(jīng)精神功能障礙有關(guān)[9,10]。近期葉濟(jì)世等[11]通過miRNA微流體芯片分析顯示,miR-214在七氟醚吸入麻醉的新生大鼠海馬組織中表達(dá)明顯上調(diào),可能與七氟醚吸入麻醉誘發(fā)的新生大鼠的發(fā)育期神經(jīng)毒性有關(guān)。至今,miR-214對(duì)七氟醚吸入麻醉誘發(fā)的新生兒學(xué)習(xí)認(rèn)知能力的影響及作用機(jī)制尚不明確。因此,本研究旨在探討miR-214在七氟醚麻醉后新生小鼠海馬區(qū)的表達(dá)變化,并進(jìn)一步觀察抑制miR-214對(duì)七氟醚麻醉后新生小鼠學(xué)習(xí)認(rèn)知能力的影響和可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

七氟醚購(gòu)自日本Maruishi公司;antagomiR-NC、antagomiR-214及PCR引物購(gòu)自上海吉瑪制藥公司;TUNEL(綠色熒光)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天公司;IL-1β、TNF-α和IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物公司;Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;逆轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒、qRT-PCR試劑盒購(gòu)自日本TAKARA公司;一抗p-PI3K、GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司;HPR偶聯(lián)的二抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

6日齡健康雄性C57BL/6小鼠64只,SPF級(jí),體質(zhì)量3-5 g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)公司。所有小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、七氟醚組、七氟醚+antagomiR-NC組、七氟醚+antagomiR-214組,每組16只。對(duì)照組不給予七氟醚暴露,余三組均給予七氟醚暴露。七氟醚暴露模仿臨床麻醉狀態(tài)[12]:首先3.5%七氟醚麻醉30 min后,再采用3%七氟醚麻醉30 min,最后用2.5%七氟醚麻醉30 min,共1.5 h。七氟醚+antagomiR-NC組和七氟醚+antagomiR-214組在七氟醚暴露前24 h分別給予尾靜脈注射抑制物陰性對(duì)照antagomiR-NC(80 mg/kg)和miR-214抑制物antagomiR-214(80 mg/kg),七氟醚組給予尾靜脈注射等體積生理鹽水。待麻醉結(jié)束后,每組隨機(jī)選取8只小鼠頸椎脫臼法處死取得海馬組織進(jìn)行檢測(cè);每組剩余8只小鼠于麻醉結(jié)束后繼續(xù)培養(yǎng)至性成熟期(出生后第60天)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作的3R原則。

1.3 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.3.1 TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測(cè)海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡 取小鼠海馬組織,4%的多聚甲醛固定24 h后,石蠟包埋,經(jīng)冠狀平面制作5 μm厚連續(xù)組織切片,參考幼鼠腦解剖圖譜,每只小鼠選擇5個(gè)相同的海馬區(qū)平面切片進(jìn)行TUNEL染色,切片常規(guī)脫蠟至水,加入20 μg/ml不含DNase的蛋白酶K溶液后,37 ℃反應(yīng)15 min,PBS洗滌3次后,加入TUNEL檢測(cè)液37 ℃避光孵育60 min,加含熒光素抗體,37 ℃避光孵育30 min,熒光顯微鏡下觀察并計(jì)算單位面積內(nèi)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.3.2 ELISA法檢測(cè)海馬組織中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平 取小鼠海馬組織進(jìn)行組織勻漿,4 ℃離心后收集上清液,應(yīng)用IL-1β、TNF-α和IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定上清液中IL-1β、TNF-α和IL-6的濃度水平。

1.3.3 qRT-PCR檢測(cè)海馬組織中miR-214的表達(dá) 取小鼠海馬組織,應(yīng)用Trizol試劑提取組織總RNA,參照逆轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒說(shuō)明書操作逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以合成的cDNA為模板,加入PCR引物,參照qRT-PCR試劑盒說(shuō)明書步驟操作進(jìn)行qPCR擴(kuò)增反應(yīng)。miR-214引物序列,正向:5′-TATACATCA AACAGCAGGCACA-3′,反向:5′-CATTCGATCTTCTCCACAGTCTC-3′;內(nèi)參U6引物序列,正向:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反向:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反應(yīng)條件:94 ℃ 60 s,92 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,76 ℃ 30 s,進(jìn)行42個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算海馬組織中miR-214的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.4 Western blot法檢測(cè)海馬組織中p-PI3K蛋白的表達(dá) 取小鼠海馬組織,加入RIPA裂解液提取海馬組織總蛋白,并應(yīng)用BCA法進(jìn)行蛋白定量。各組取50 μg蛋白上樣,然后行10% SDS-PAGE電泳,采用半干法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,洗膜3次,加入5%脫脂牛奶中封閉1 h,加入一抗p-PI3K(工作濃度1 ∶1 000)和GAPDH一抗(工作濃度1 ∶2 000),4 ℃孵育一抗過夜,洗膜3次,次日加入HPR偶聯(lián)的二抗后室溫孵育1 h,經(jīng)LI-COR Odyssey成像分析系統(tǒng)掃描、拍照并分析條帶灰度值。

1.3.5 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠認(rèn)知功能 取性成熟期(出生后第60天)的各組剩余小鼠進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn),Morris水迷宮為高50 cm、直徑150 cm、深25 cm的黑色圓柱形水池,水池平均分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四個(gè)象限。實(shí)驗(yàn)時(shí),首先在水桶內(nèi)加入氧化鈦使水變成不透明的乳白色,在水池第Ⅰ象限中央放置一個(gè)直徑6 cm的圓形隱藏平臺(tái),低于水面1 cm,實(shí)驗(yàn)時(shí),水溫保存在25 ℃,水池周圍的參照物保持不變,實(shí)驗(yàn)前一天將小鼠放入沒有平臺(tái)的水池中自由游泳120 s適應(yīng)水池環(huán)境。①定位航行實(shí)驗(yàn):將小鼠從水池不同的象限面向池壁放入水池,記錄小鼠找到平臺(tái)的時(shí)間記為逃避潛伏期,連續(xù)進(jìn)行5 d,4次/d,取平均值;②空間探索實(shí)驗(yàn):定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后第2天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn),撤除圓形隱藏平臺(tái),以第Ⅳ象限作為小鼠入水點(diǎn),記錄小鼠120 s時(shí)間內(nèi)穿越原平臺(tái)象限(第Ⅰ象限)的次數(shù)及原平臺(tái)象限的停留時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況比較

與對(duì)照組比較,七氟醚組小鼠海馬區(qū)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增多(P<0.05)。七氟醚組與七氟醚+antagomiR-NC組小鼠海馬區(qū)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與七氟醚+antagomiR-NC組比較,七氟醚+antagomiR-214組小鼠海馬區(qū)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05,見表1,圖1)。

表1 各組小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡及miR-214、PTEN蛋白的相對(duì)表達(dá)水平比較

圖1 TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡Figure 1 Apoptosis of hippocampal neurons in mice by TUNEL assay

2.2 各組小鼠海馬組織中miR-214、p-PI3K蛋白表達(dá)水平的比較

與對(duì)照組比較,七氟醚組小鼠海馬組織中miR-214的相對(duì)表達(dá)顯著升高(P<0.05),而p-PI3K蛋白的相對(duì)表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。七氟醚組與七氟醚+antagomiR-NC組小鼠海馬組織中miR-214和p-PI3K蛋白的相對(duì)表達(dá)比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與七氟醚+antagomiR-NC組比較,七氟醚+antagomiR-214組小鼠海馬組織中miR-214的相對(duì)表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),而p-PI3K蛋白的相對(duì)表達(dá)水平顯著升高(P<0.05,見表1,圖2)。

1.對(duì)照組;2.七氟醚組;3.七氟醚+antagomiR-NC組;4.七氟醚+antagomiR-214組圖2 Western blot檢測(cè)小鼠海馬組織中p-PI3K蛋白的表達(dá)Figure 2 Expression of p-PI3K protein in mouse hippocampus by Western blot

2.3 各組小鼠海馬組織中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平比較

與對(duì)照組比較,七氟醚組小鼠海馬組織中IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著升高(P<0.05)。七氟醚組與七氟醚+antagomiR-NC組小鼠海馬組織中IL-1β、IL-6和TNF-α水平比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與七氟醚+antagomiR-NC組比較,七氟醚+antagomiR-214組小鼠海馬組織中IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著降低(P<0.05,見表2)。

表2 各組小鼠海馬組織中IL-1β、TNF-α和IL-6水平的比較

2.4 各組小鼠逃避潛伏期及空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

與對(duì)照組比較,七氟醚組小鼠逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)(P<0.05),而穿越原平臺(tái)象限的次數(shù)明顯減少(P<0.05),原平臺(tái)象限的停留時(shí)間明顯縮短(P<0.05)。七氟醚組與七氟醚+antagomiR-NC組小鼠逃避潛伏期、穿越原平臺(tái)象限的次數(shù)及原平臺(tái)象限停留的時(shí)間比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與七氟醚+antagomiR-NC組比較,七氟醚+antagomiR-214組小鼠逃避潛伏期顯著縮短(P<0.05),而穿越原平臺(tái)象限的次數(shù)明顯增多(P<0.05),原平臺(tái)象限停留的時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P<0.05,見表3)。

表3 各組小鼠逃避潛伏期及空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較

3 討論

未成熟大腦是神經(jīng)發(fā)育的關(guān)鍵期,近年來(lái)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,吸入性麻醉藥能夠?qū)ξ闯墒齑竽X造成不同程度的損傷從而產(chǎn)生認(rèn)知學(xué)習(xí)功能障礙,其機(jī)制可能與吸入麻醉可導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生凋亡,從而影響正常神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建有關(guān)[13,14]。海馬區(qū)是由中間腦皮質(zhì)分化,被公認(rèn)是認(rèn)知記憶學(xué)習(xí)中至關(guān)重要的腦區(qū)。研究顯示吸入性麻醉藥造成發(fā)育關(guān)鍵期大腦海馬區(qū)基因的改變是產(chǎn)生認(rèn)知學(xué)習(xí)功能障礙的關(guān)鍵因素[15,16]。miRNA是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的參與機(jī)體生命活動(dòng)調(diào)控的非編碼小分子RNA,研究顯示海馬區(qū)miRNA的異常改變是吸入性麻醉藥造成新生兒產(chǎn)生認(rèn)知學(xué)習(xí)功能障礙的關(guān)鍵因素[17]。

miR-214近期發(fā)現(xiàn)的miRNA家族重要的成員之一,在機(jī)體細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、炎癥、免疫調(diào)控、腫瘤發(fā)生等方面均發(fā)揮著極其重要的作用[18,19]。近期研究發(fā)現(xiàn)miR-214與神經(jīng)損傷的再生有關(guān)[20]。miR-214能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞的分化,抑制神經(jīng)突起的生長(zhǎng)[21]。Mellios等[22]發(fā)現(xiàn)野生型小鼠胚胎腦中高表達(dá)的miR-214能夠干擾神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)元的遷移。近期miRNA微流體芯片分析研究顯示miR-214在七氟醚麻醉的新生大鼠海馬組織中表達(dá)明顯上調(diào),但具體作用機(jī)制尚不清楚[11]。本研究中選用6日齡SPF級(jí)雄性健康C57BL/6小鼠作為研究對(duì)象,模仿臨床麻醉狀態(tài)給予七氟醚暴露,結(jié)果發(fā)現(xiàn)七氟醚組小鼠海馬TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多,性成熟期后逃避潛伏期明顯延長(zhǎng),穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少,提示臨床麻醉狀態(tài)下七氟醚的暴露能夠造成小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡增加,認(rèn)知記憶功能障礙,與既往研究結(jié)果一致[11,23]。并且本研究發(fā)現(xiàn)七氟醚組小鼠海馬組織中miR-214的表達(dá)明顯升高,提示異常增高的miR-214可能與七氟醚對(duì)新生小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡增加有關(guān)。進(jìn)一步本研究通過尾靜脈antagomiR-214抑制小鼠海馬組織miR-214的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制miR-214能夠明顯減少小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡,縮短逃避潛伏期,增加穿越原平臺(tái)象限的次數(shù),延長(zhǎng)原平臺(tái)象限停留的時(shí)間,提示抑制miR-214能夠減輕小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡,從而減輕認(rèn)知記憶功能障礙。

PI3K信號(hào)通路機(jī)體一種重要的細(xì)胞存活信號(hào)通路,在神經(jīng)系統(tǒng)也廣泛存在,參與神經(jīng)元細(xì)胞的分化、增殖、凋亡等過程[24]。PI3K信號(hào)通路的激活能夠抑制炎癥反應(yīng)從而減輕神經(jīng)損傷[25,26]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),七氟醚吸入暴露能夠抑制新生小鼠海馬區(qū)p-PI3K蛋白的表達(dá),增加海馬組織中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平,說(shuō)明七氟醚吸入暴露能夠抑制PI3K信號(hào)通路的激活,增加海馬區(qū)的炎癥反應(yīng),從而造成海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡。龔濤武等[27]也在研究中發(fā)現(xiàn)相同的結(jié)論。既往研究發(fā)現(xiàn)miR-214能夠調(diào)控PI3K信號(hào)通路參與機(jī)體重要生命活動(dòng)的調(diào)控[28,29]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)通過尾靜脈antagomiR-214抑制小鼠海馬組織中miR-214的表達(dá),能夠明顯升高p-PI3K蛋白的表達(dá)水平,提示抑制miR-214減輕七氟醚致新生小鼠海馬區(qū)的炎癥反應(yīng)和認(rèn)知功能的損傷,可能與miR-214對(duì)PI3K信號(hào)通路的調(diào)控有關(guān)。

綜上所述,七氟醚可造成新生小鼠認(rèn)知功能損傷及海馬組織中miR-214的升高。抑制miR-214能夠減輕七氟醚致新生小鼠海馬區(qū)的炎癥反應(yīng)從而減輕小鼠認(rèn)知功能的損傷,其機(jī)制可能與其對(duì)PI3K信號(hào)通路的調(diào)控有關(guān)。