劉 通,王 利,史靜怡,閆泱錦,程 康,冀永春

(西安市第三醫(yī)院心血管內(nèi)科,西北大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科,西安 710018;*通訊作者,E-mail:18629057123@163.com)

心臟性猝死(sudden cardiac death,SCD)是由心功能喪失引起的突發(fā)性意外死亡[1]。大多數(shù)情況下室性心律不齊(ventricular arrhythmias,VA),尤其是室性心動過速、室顫[2]和致死性心律失常是造成心臟性猝死的主要原因。由于死亡的發(fā)生有時僅需幾分鐘甚至幾秒鐘,因此明確致死性、室性、快速性心律失常發(fā)生的功能指標(biāo)對于確定臨床診斷和法醫(yī)鑒定都很重要[3]。

腎上腺素能受體(adrenergic receptors,AR)是能與去甲腎上腺素(noradrenaline,NE)或腎上腺素結(jié)合的受體,是一種定位在細(xì)胞膜上的大分子蛋白質(zhì)或脂蛋白,主要分為β-AR和α1-AR[4]。其中,β-AR介導(dǎo)心臟的主要功能,所占比例也較多,但在心衰等病理條件下受體會脫敏下調(diào),而α1-AR表達(dá)可上調(diào)至25%(9%-45%)[4]。研究表明,AR是一種介導(dǎo)兒茶酚胺作用的G-蛋白偶聯(lián)受體,是近年來的研究熱點,也是最成功的藥物靶點之一[5]。目前有超過50%的臨床用藥,以及正在研發(fā)的藥物靶點都是G蛋白偶聯(lián)受體[6]。近年來關(guān)于β-AR對大鼠心臟病理的研究較多,如心臟炎性細(xì)胞浸潤和促炎細(xì)胞因子的合成在β-AR介導(dǎo)的心臟重塑和心力衰竭中發(fā)揮了重要作用[7];β1-AR募集巨噬細(xì)胞至心臟,引起心臟炎癥及心臟纖維化和心功能異常等[8]。但是僅有少數(shù)關(guān)于α1-AR介導(dǎo)的心臟炎癥中的作用的研究[9]。目前尚缺乏關(guān)于去甲腎上腺素調(diào)節(jié)α1-腎上腺素能受體對大鼠室性心律失常影響的研究。因此本研究利用NE誘導(dǎo)VA大鼠模型,通過給予α1-AR拮抗劑,檢測α1-AR與大鼠心臟室性心律失常的關(guān)系,以期明確VA大鼠心肌中α1-AR是否引起ERK1/2通路激活,為交感應(yīng)激引起的病理性室性心律失常尋找更為精確的臨床治療靶點。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

RNAiso Plus(D9108;Takara Biotechnology,Shiga),去甲腎上腺素(Macklin,N814761),PrimeScript RT試劑盒(DRA037,Takara),SYBR Premix Ex TaqⅡ(TliRNaseH Plus; RR820A,Takara),COMT酶(Bioruler,RH126075-150U),放射免疫沉淀緩沖液(sc-24948,Santa Cruz),牛血清白蛋白(SK3051,Sangon Biotech),PNPP(MedChemExpress,HY-15928),抗p-ERK1/2(ab1549,Abcam),抗GAPDH(ab8245,Abcam),山羊抗兔IgG(ZB2301,北京)。鼠尾血壓計(Softron,Japan,BP-98A)。

1.2 實驗分組及處理

30只體質(zhì)量300-350 g的SD雄性大鼠購自兵器工業(yè)衛(wèi)生研究所[SCXK(陜)2016-001]。飼養(yǎng)環(huán)境為室溫23 ℃、相對濕度65%,12 h光照/黑暗交替,期間大鼠可隨意獲取食物和水。將大鼠隨機(jī)分為3組:對照組、去甲腎上腺素組(NE組)和α1-AR拮抗劑處理組(NE+P組),每組10只。根據(jù)趙艷麗等[10]方法建立室性心律失常大鼠模型,NE組大鼠腹膜內(nèi)注射2%戊巴比妥鈉(1.5 mg/100 g體質(zhì)量)麻醉后,通過微量注射泵以0.004 ml/100 g體質(zhì)量的劑量行靜脈內(nèi)注射濃度為10-5mol/L的去甲腎上腺素(NE),建立大鼠室性心律失常模型,對照組大鼠則注射等體積的生理鹽水。然后使用Powerlab生物信號處理系統(tǒng)(Bella Vista)持續(xù)記錄大鼠心率的心電圖(ECG)信號。NE+P組大鼠在注射NE 15 min前,α1-AR拮抗劑哌唑嗪(Praz)以5 mg/kg的劑量行腹腔注射到大鼠體內(nèi)。在將大鼠麻醉后,通過微量注射泵行靜脈注射濃度為10-5mol/L的去甲腎上腺素。用鼠尾血壓計BP-98A檢測大鼠血壓,用含1%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠(0.1 ml/10 g),將鼠尾放入感應(yīng)器中,開始檢測給藥前后大鼠心率、收縮壓、舒張壓,連續(xù)測量至少5次。

1.3 血漿中去甲腎上腺素含量測定

在注射NE后1 h和24 h時,分別于各組大鼠頸靜脈處采集血液,2 000 r/min離心20 min后收集上清,-80 ℃下保存待用。加入新配制的COMT酶溶液(2.5 ml輔酶液、2.5 ml酶緩沖液和0.8 ml COMT附加液加入2.5 ml COMT酶溶液中混勻)、標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、血漿樣本各25 μl/孔于酶標(biāo)板中,混勻,可見其顏色變?yōu)榉奂t色。然后加入50 μl去甲腎上腺素抗血清,封板后于室溫?fù)u床孵育2 h,將0.1 ml酶連接產(chǎn)物加入各孔,再封板搖床孵育1 h,再加入0.2 ml底物溶液于各孔,孵育40 min,最后加入50 μl PNPP終止液,混勻后于60 min內(nèi)用酶標(biāo)儀于405 nm處檢測OD值,計算血漿去甲腎上腺素濃度。

1.4 RNA提取和實時定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測α1-AR基因表達(dá)水平

在注射NE后1 h時,行頸椎脫臼法處死大鼠,分離心臟,以生理鹽水灌洗后,取100 mg大鼠的心肌組織在液氮中冷凍后進(jìn)行研磨。用RNAiso Plus提取總RNA,并采用Prime Script RT試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR Premix Ex TaqⅡ和real-time PCR system(Thermo Fisher)進(jìn)行實時qPCR,每組重復(fù)3次。GAPDH作為內(nèi)參基因,通過2-ΔΔCt方法定量基因表達(dá)相對量。本研究所用的PCR引物序列如下:GAPDH F:5′-CTCCTGTTCGACAGTCAGCC-3′,R:5′-TTCCCGTTCTCAGCCTTGAC-3′;α1-AR F:5′-TGACTTTCCGCGATCTCCTG-3′,R:5′-TTACCTGCCACGGCCATAAG-3′。

1.5 蛋白質(zhì)免疫印跡分析p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平

大鼠心肌組織用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌,并用含有10 μg/ml蛋白酶抑制劑的RIPA免疫沉淀緩沖液裂解。4 ℃下12 000 r/min離心10 min,收集上清液,以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn),測定上清液中的蛋白質(zhì)含量。然后對蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE電泳,再進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。將電泳膠放置于用甲醇侵泡的PVDF膜上,倒入預(yù)冷轉(zhuǎn)膜液,200 mA恒流轉(zhuǎn)膜2 h。然后將膜置于5%脫脂牛奶中于搖床(240 r/min)室溫封閉1 h,加入一抗p-ERK1/2(1 ∶500)和GAPDH(1 ∶5 000)的稀釋比例在4 ℃下孵育過夜。用0.1% TBST洗膜10 min后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1 ∶5 000),在室溫下孵育。2 h后使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng),電泳凝膠成像分析系統(tǒng)(MF-ChemiBIS 3.2)將印跡可視化,并計算灰度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 21.0和GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,所有數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,兩組數(shù)據(jù)采用t檢驗比較差異性,多組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析的Tukey法或Dunnett-t法進(jìn)行多組比較差異性。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NE注射后大鼠血漿NE水平和心率變化

在NE注射1 h時,NE組大鼠血漿中的NE水平相較于對照組顯著升高[(15.08±0.39)mol/Lvs(2.98±0.51)mol/L,P<0.05];NE注射24 h時,NE組大鼠血漿中NE水平相較于1 h已明顯下降,但與對照組相比仍顯著升高[(8.02±0.31)mol/Lvs(2.98±0.51)mol/L,P<0.05]。大鼠的心電圖監(jiān)測結(jié)果顯示,NE注射1 h時,NE組大鼠的持續(xù)性室性心律失常發(fā)生次數(shù)相較于對照組顯著增加;NE注射24 h時,NE組大鼠的持續(xù)性室性心律失常發(fā)生次數(shù)相較于1 h已顯著下降(見圖1)。該結(jié)果表明本研究給大鼠注射NE后構(gòu)建大鼠室性心律失常模型成功。

A.NE注射1 h和24 h后大鼠血漿中的NE水平B.NE注射1 h和24 h后大鼠的心電圖變化與對照組比較,*P<0.05;與NE 1 h組比較,*P<0.05圖1 大鼠注射NE后血漿中NE水平和心電圖(ECG)檢測Figure 1 NE levels in plasma and ECG after NE injection in rats

2.2 NE對室性心律失常大鼠α1-AR基因表達(dá)的影響

在NE注射1 h時,與對照組相比,NE組大鼠心肌組織中α1-AR mRNA的表達(dá)量顯著上調(diào)(0.40±0.07vs2.18±0.3,P<0.01,見圖2),由此說明NE誘導(dǎo)了室性心律失常大鼠中α1-AR的高表達(dá),可能對大鼠室性心律存在調(diào)控作用。

與對照組比較,**P<0.01圖2 NE注射1 h后大鼠心肌中α1-AR基因表達(dá)量的變化Figure 2 Changes of α1-AR gene expression in rat myocardium at 1 h after NE injection

2.3 室性心律失常大鼠中ERK1/2信號通路的激活

磷酸化ERK1/2蛋白的表達(dá)水平結(jié)果顯示,與對照組相比,NE組大鼠心肌組織中p-ERK1/2蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào)(0.36±0.09vs2.61±0.28,P<0.01,見圖3)。該結(jié)果表明NE誘導(dǎo)的α1-AR可能激活ERK1/2信號途徑。

與對照組比較,**P<0.01圖3 NE誘導(dǎo)的α1-AR對室性心律失常大鼠中ERK1/2信號途徑的影響Figure 3 Effect of NE-induced α1-AR on ERK1/2 signaling pathway in ventricular arrhythmic rats

2.4 α1-AR拮抗劑的使用對室性心律失常大鼠心率和血壓的影響

α1-AR拮抗劑(哌唑嗪)使用后,NE組大鼠表現(xiàn)為血壓升高和持續(xù)性單形性心動過速,NE+P組大鼠室性心律失常則有所減緩,表現(xiàn)為室性心動過速的波形。與NE組比較,NE+P組大鼠的收縮壓和舒張壓均呈明顯降低(P<0.01,見圖4)。表明α1-AR拮抗劑對室性心律失常大鼠心率和血壓有明顯改善作用。

與NE組比較,*P<0.05,**P<0.01圖4 α1-AR拮抗劑使用后對室性心律失常大鼠心率和血壓的變化Figure 4 Changes of heart rate and blood pressure in rats with ventricular arrhythmia after using α1-AR antagonist

2.5 α1-AR拮抗劑使用對室性心律失常大鼠ERK1/2信號途徑的影響

使用α1-AR拮抗劑后,NE+P組大鼠中p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平相較于NE組顯著下調(diào)(2.61±0.28vs0.28±0.05,P<0.01,見圖5)。該結(jié)果表明α1-AR在NE誘導(dǎo)的大鼠室性心率失常中具有重要的調(diào)節(jié)作用,ERK1/2信號通路的激活也可能受到α1-AR的調(diào)節(jié)。

與NE組比較,**P<0.01圖5 α1-AR拮抗劑使用后對室性心律失常大鼠ERK1/2信號途徑的影響Figure 5 Effect of α1-AR antagonist on ERK1/2 signaling pathway in rats with ventricular arrhythmia

3 討論

腎上腺素能受體可以分為腎上腺素能α受體和β受體[11]。α受體(α1和α2)主要分布在皮膚、腎臟、腸胃的血管平滑肌。其中α1主要位于突觸前膜和血管平滑肌上,興奮時主要收縮血管[12]。α2主要位于去甲腎上腺素能神經(jīng)的突觸前膜上,興奮時負(fù)反饋調(diào)節(jié)NE的分泌。β受體主要位于心臟、骨骼肌、肝臟的血管平滑肌[13]。β-AR所占比例較多并參與心臟的主要調(diào)節(jié)功能,但在心衰等病理條件下受體會脫敏下調(diào)[14]。而α1-AR表達(dá)上調(diào)至25%,并可通過偶聯(lián)Gq蛋白激活磷脂酶C(PLC),分解磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)為三磷酸肌醇(IP3)和甘油二脂(DG),IP3使細(xì)胞內(nèi)外Ca2+大幅度升高從而造成心肌損傷[15]。目前關(guān)于α1-AR與室性心律失常的研究已存在諸多報道,而交感過度激活和兒茶酚胺釋放增加是引起心肌損傷的重要因素。且研究發(fā)現(xiàn)用去甲腎上腺素制備交感應(yīng)激的動物模型可以檢測到心臟白細(xì)胞浸潤[16]。因此,本研究使用NE誘導(dǎo)大鼠室性心律失常的動物模型對去甲腎上腺素調(diào)節(jié)α1-腎上腺素能受體和其可能的機(jī)制進(jìn)行研究和探索。

血漿NE水平與慢性心力衰竭的進(jìn)展和預(yù)后相關(guān)[17]。隨著血漿NE水平的增加,心力衰竭患者的死亡率也隨之增加[18]。研究表明,NE會促進(jìn)心臟炎癥和收縮功能障礙的發(fā)展[9],從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷。相似的,本研究也發(fā)現(xiàn)在注射NE 1 h后,大鼠血漿中的NE水平相較于對照組顯著升高,24 h后大鼠血漿中NE水平明顯下降,但仍顯著高于對照組。對大鼠的心電圖進(jìn)行監(jiān)測的結(jié)果發(fā)現(xiàn),NE注射后大鼠的室性心律失常發(fā)生次數(shù)較對照組明顯增加。由此表明注射NE可以引起大鼠血漿NE水平的升高,且室性心率失常也隨之加重。

研究發(fā)現(xiàn),給予β-AR選擇性激動劑的大鼠心臟出現(xiàn)了炎性細(xì)胞浸潤和促炎細(xì)胞因子合成的增加[19],促炎細(xì)胞因子可能在β-AR介導(dǎo)的心臟重塑和心力衰竭中發(fā)揮了重要作用[7]。激活心肌細(xì)胞β1-AR使巨噬細(xì)胞募集至心臟,引起心臟炎癥及心臟纖維化和心功能異常[8]。然而心肌細(xì)胞中表達(dá)的主要腎上腺素受體亞型除了β-AR還有α1-AR,目前仍不清楚α1-AR是否參與介導(dǎo)交感應(yīng)激所引起心臟室性心律失常。針對NE是否通過AR作用來調(diào)節(jié)大鼠室性心率的發(fā)展,本研究檢測了NE注射后產(chǎn)生VA的大鼠心肌中α1-AR基因的表達(dá)量,結(jié)果表明,NE可以顯著提高α1-AR的表達(dá),從而說明α1-AR可能參與了大鼠室性心律失常的調(diào)節(jié)作用。

哌唑嗪(prazosin)是一種α受體拮抗劑,主要用于高血壓、焦慮和創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙。拮抗血管平滑肌中的α-AR,從而抑制循環(huán)和局部釋放的腎上腺素和去甲腎上腺素的血管收縮作用,導(dǎo)致外周血管舒張。有研究報道NE激活血管中的α-AR,使血壓升高加重心臟后負(fù)荷,通過心臟氧化應(yīng)激產(chǎn)生ROS介導(dǎo)心臟炎癥[20],而哌唑嗪可以減輕NE誘導(dǎo)的心臟炎癥。但是關(guān)于哌唑嗪是否會緩解病理性心臟室性心律失常,尚無相關(guān)報道,因此本研究用α1-AR拮抗劑哌唑嗪處理NE誘導(dǎo)的室性心律失常大鼠后發(fā)現(xiàn),由NE誘導(dǎo)的血壓升高作用受到了顯著抑制,且大鼠室性心律也在α1-AR拮抗劑使用后有所改善。在本研究中,使用α1-AR拮抗劑后,大鼠中磷酸化的ERK1/2蛋白與未用拮抗劑處理的NE組相比顯著下調(diào),由此表明α1-AR在NE誘導(dǎo)的大鼠室性心率失常中具有重要的調(diào)節(jié)作用,且ERK1/2信號通路的激活也受到α1-AR的調(diào)節(jié)。

本研究從動物模型水平研究了α1-AR在NE誘導(dǎo)的大鼠室性心率失常中的作用,這為臨床上探究α1-AR作為治療心律失常的可能靶點提供了一定的基礎(chǔ),但是本研究仍存在局限性,其一是缺乏細(xì)胞水平的證據(jù),特別是α1-AR在心肌細(xì)胞生理層面的影響作用,其二本研究尚未過多的關(guān)注室性心率失常模型大鼠心臟炎癥等病理生理變化。這些局限性也是本課題接下來所需要進(jìn)行的研究方向。

綜上所述,NE可以引起大鼠血漿NE水平短暫而迅速的升高、室性心率失常也隨之加劇,α1-AR在NE誘導(dǎo)的大鼠室性心率失常中具有重要的調(diào)節(jié)作用,且α1-AR會激活ERK1/2信號途徑,從而對室性心律失常的大鼠起到調(diào)節(jié)作用。