王百喬,林小茹,韓 敏,劉 煜,唐超玲

(1.海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院藥學部,海口570100;2.海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院基礎實驗室,?？?70100)

阿爾茨海默癥（Alzheimer's disease，AD）又名老年癡呆癥，以老年斑、神經(jīng)原纖維纏結(jié)和神經(jīng)元缺失為主要病理表現(xiàn)，是一種復雜的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾?。?-2］。隨著社會老齡化加重，AD發(fā)病率呈逐年升高的趨勢，給家庭和社會都造成了沉重負擔［3］。AD發(fā)病機制復雜，其認知功能障礙發(fā)生、發(fā)展的機制一直是臨床研究的熱點和重點問題之一［4］。

磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）通路可調(diào)控細胞生長、增殖、分化及凋亡等多種生理活動［5］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt通路參與AD神經(jīng)元凋亡、自噬等多種生理過程［6］。因此，研究AD病理過程中PI3K/Akt通路的調(diào)控機制，具有一定的臨床意義。

二甲雙胍（metformin，Met）是國際公認的人用降糖藥［7］。近來臨床報告顯示，Met能夠通過改善AD患者胰島素抵抗，改善AD患者的認知功能［8］。但Met改善AD患者認知功能的具體分子生物學機制還不甚明確。本研究建立AD大鼠模型，探究Met對AD大鼠認知功能的影響，以及對PI3K/Akt通路的調(diào)控作用，以期闡明AD認知功能障礙發(fā)生、發(fā)展的機制，并為臨床合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量為200～220 g，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心［SCXK（粵）2018-0002］提供。所有大鼠常規(guī)飼養(yǎng)于海南藥物研究所有限責任公司［SYXK（瓊）2019-0007］動物設施。本實驗經(jīng)本院倫理委員會批準（IACUC-20190003）。

1.2 主要試劑及儀器

Met（批號20032322，規(guī)格0.25 g×48T）購自江蘇蘇中藥業(yè)集團股份有限公司；鏈脲霉素（streptozotocin，STZ）（貨號：sf1446）購自上海士鋒生物科技有限公司；蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒（貨號G1120）購自北京索萊寶科技有限公司；檢測β-淀粉樣蛋白42（β-amyloid 42，Aβ42）用ELISA試劑盒（貨號E-EL-R1402）購自上海振譽生物科技有限公司；檢測磷酸化Tau蛋白（phosphorylated Tau protein，p-tau）用ELISA試劑盒（貨號EHJ-ZH1216）購自廈門慧嘉生物科技有限公司；PI3K抗體、磷酸化Akt（p-Akt）抗體、胰島素受體底物-1（insulin receptor substrate-1，IRS-1）抗體、糖原合酶激酶-3（glycogensynthasekinase-3，GSK-3）抗體（貨號分別為ab39307、ab38449、ab40777、ab93926）均購自美國Abcam公司；BCA蛋白定量試劑盒和胰蛋白酶（貨號分別為P0768、P0231）均購自美國Pierce公司。

手動輪轉(zhuǎn)式切片機（型號RM2125RTS）購自德國Leica公司；光學顯微鏡（型號SMZ745）購自日本Nikon公司；蛋白電泳儀（型號1659001）、半干轉(zhuǎn)膜儀（型號Trans-Blot SD）購自美國Bio-Rad公司；凝膠成像儀（型號GIS-500）購自杭州米歐儀器有限公司。

1.3 大鼠AD模型建立及分組給藥

取SD大鼠50只，用隨機數(shù)字表法分為正常組（Normal組）、AD模型組（AD組）、Met低劑量（50 mg/kg）組、Met中劑量（100 mg/kg）組、Met高劑量（200 mg/kg）組，每組10只。除Normal組大鼠腦雙側(cè)室注射10μL生理鹽水（即0.9%氯化鈉溶液）外，其余各組大鼠均參照文獻［9］，于腦雙側(cè)室注射10μL的STZ溶液（3 mg/kg）建立AD模型。具體建模操作方法：將大鼠用3%戊巴比妥鈉麻醉后，將其頭部固定于腦立體定位儀上，剪去局部毛發(fā)，碘伏消毒，沿矢狀線切開皮膚，將骨膜向兩側(cè)推開，暴露顱骨；以前囟點為基準，在前囟后1.0 mm、矢狀縫旁開1.5 mm處用骨鉆鉆孔，利用微量注射泵和10μL微量注射器將10μL的STZ溶液按3 mg/kg的劑量緩慢注入，注射完畢后留針1 min；以同樣方法在大鼠另一側(cè)腦室注射10μL STZ溶液，術(shù)后間隔2 d再重復注射一次；術(shù)野灑青霉素溶液，縫合皮膚，碘伏消毒；術(shù)后大鼠分籠飼養(yǎng)，并連續(xù)5 d肌內(nèi)注射慶大霉素3 U/d，以防感染。Normal組除注射生理鹽水外，其余操作同模型組。各組大鼠均于術(shù)后觀察9 d，于第10天開始給藥，參照文獻［10］用生理鹽水將Met配制成5、10和20 mg/mL的溶液，按10 mL/kg的劑量灌胃給予相應質(zhì)量濃度的Met溶液；Normal組及AD組按10 mL/kg的劑量灌胃給予生理鹽水。各給藥組連續(xù)給藥14 d，1次/d。

1.4 大鼠Morris水迷宮行為檢測實驗

各組大鼠在末次給藥后12 h，參照文獻［11］進行Morris水迷宮行為檢測。首先制作一個直徑150 cm、深60 cm、黑色內(nèi)壁的不銹鋼水池，四周帶有不同視標并用布簾圍繞。將黑色圓形逃生平臺（直徑14 cm，高29 cm）置于水池第一象限中央，注水后深度超過平臺1～2 cm，水溫（23±2）℃。水池上方安裝有與計算機相連的攝像頭，用于記錄大鼠游泳軌跡。實驗分兩部分。（1）定位航行實驗：即將大鼠面朝池壁隨機從4個象限之一放入水中，記錄大鼠找到隱藏在水下的平臺的時間，即逃避潛伏期。如果大鼠120 s內(nèi)未找到平臺，則引導其找到平臺，并讓其在平臺上停留10 s。每只大鼠每日訓練4次，平均值作為該鼠當日的平均逃避潛伏期。連續(xù)訓練觀察5 d，以第5天數(shù)據(jù)的平均值進行比較。（2）空間探索實驗：定位航行實驗結(jié)束后24 h，撤去水下平臺，隨機選2個象限（平臺所在的第一象限除外），將大鼠面朝池壁投入池中，并讓其自由游泳120 s，統(tǒng)計大鼠穿越原平臺位置的次數(shù)，計算在原平臺象限內(nèi)游泳時間占總時間的比值，以及游過路程占總路程的比值。（3）可視平臺驗證實驗：航行實驗和空間探索實驗結(jié)束后，降低水位露出平臺，大鼠隨機投放后應無困難地游向平臺，以排除前兩項實驗過程中其存在視覺或運動障礙的可能性，證明結(jié)果可信。

1.5 大鼠標本采集

各組大鼠在Morris水迷宮行為檢測實驗結(jié)束后第2天，麻醉下心臟灌注PBS，斷頭。冰塊上迅速取出一側(cè)海馬組織，并將海馬組織浸泡于質(zhì)量分數(shù)為4%的多聚甲醛溶液中固定，備用。然后，迅速取另一側(cè)海馬組織，放于凍存管中，并迅速置于液氮罐中速凍，轉(zhuǎn)移至－80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 大鼠海馬組織HE染色

取經(jīng)4%多聚甲醛溶液中固定24 h的海馬組織，用含30%蔗糖的多聚甲醛溶液脫水，行海馬組織冷凍切片。取部分切片，根據(jù)試劑盒說明書進行HE染色，并在在顯微鏡下觀察海馬組織變化。

1.7 免疫組織化學法檢測大鼠海馬組織中PI3K陽性表達

取16節(jié)HE染色實驗剩余的海馬組織石蠟切片，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇溶液水化、過氧化氫滅活、內(nèi)源性過氧化物酶封閉進行抗原修復后，加入抗PI3K抗體（稀釋比例為1∶500），置于濕盒內(nèi)4℃孵育過夜。然后按PV6001試劑盒說明書方法滴加羊抗兔二抗溶液，孵育50 min后，進行DAB顯色、蘇木精對比染色、封固。最后用光學顯微鏡觀察，用Image Pro Plus 5.0圖像分析系統(tǒng)分析單位面積（1 mm2）陽性染色區(qū)的平均吸光度值，以此反映PI3K陽性表達量。

1.8 ELISA法檢測海馬組織中Aβ42、p-tau含量

取－80℃保存的海馬組織，于4℃冰箱解凍后，用組織勻漿器勻漿，再經(jīng)離心分離后取上清液。用ELISA試劑盒檢測Aβ42、p-tau含量，具體操作按說明書進行。

1.9 蛋白質(zhì)印跡法檢測海馬組織中PI3K、p-Akt、IRS-1和GSK-3蛋白表達

?。?0℃保存的海馬組織，于4℃冰箱中解凍后，用組織勻漿器勻漿，離心分離后，取上清液。用蛋白提取試劑盒提取組織總蛋白，用蛋白定量BCA試劑盒檢測總蛋白濃度后，取50μg蛋白上樣，進行電泳和轉(zhuǎn)膜反應。TBST溶液清洗后，加入5%脫脂牛奶，室溫下封閉1 h；TBST溶液清洗3次后，加入抗PI3K、p-Akt、IRS-1、GSK-3和β-actin（內(nèi)參）抗體［除β-actin抗體（1∶2 000）外，稀釋比例均為1∶1 000］，于4℃搖床室溫孵育過夜；TBST振蕩漂洗后，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（稀釋比例為1∶2 000），于37℃搖床上室溫孵育1 h；TBST清洗3次后，采用增強化學發(fā)光法顯色，以凝膠成像儀觀察條帶并拍照，并用Image J軟件分析各組蛋白的相對表達水平。

1.10 統(tǒng)計學分析

用SPSS 22.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示。2組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，然后進一步行SNK-q檢驗；百分率比較采用卡方檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的空間學習記憶能力

Morris水迷宮行為檢測結(jié)果顯示：與Normal組相比，AD組大鼠平均逃避潛伏期延長（P＜0.05），穿越平臺次數(shù)減少（P＜0.05），原平臺象限游泳距離與總距離的比值、游泳時間與總時間的比值均降低（P＜0.05）；與AD組相比，Met低、中、高劑量組大鼠的平均逃避潛伏期縮短（P＜0.05），穿越平臺次數(shù)增加（P＜0.05），原平臺象限游泳距離與總距離的比值、游泳時間與總時間的比值均升高（P＜0.05）。Met各劑量組的上述指標變化均呈劑量依賴性（表1）。

表1 各組大鼠的Morris水迷宮行為指標比較Table1 Comparison of behavioral indicatorsof ratsin each group detected by the Morriswater mazetest（±s,n=10）

表1 各組大鼠的Morris水迷宮行為指標比較Table1 Comparison of behavioral indicatorsof ratsin each group detected by the Morriswater mazetest（±s,n=10）

注：Normal指生理鹽水對照組，AD指阿爾茨海默癥模型組，Met低、中、高劑量指AD建模后分別灌胃給予50 mg/kg、100 mg/kg和200 mg/kg二甲雙胍（Met）溶液的用藥組。與Normal組相比，a P＜0.05；與AD組相比，b P＜0.05；與Met低劑量組相比，c P＜0.05；與Met中劑量組相比，d P＜0.05。

組別Normal AD Met低劑量Met中劑量Met高劑量平均逃避潛伏期/s 19.00±1.01 32.21±1.64a 28.85±1.57ab 24.07±1.26abc 20.08±1.68bcd穿越平臺次數(shù)/次4.86±0.49 1.21±0.31a 2.85±0.37ab 3.87±0.46abc 4.68±0.48bcd原平臺象限游泳距離與總距離的比值0.39±0.03 0.21±0.01a 0.27±0.02ab 0.33±0.03abc 0.38±0.02bcd原平臺象限游泳時間與總時間的比值0.40±0.04 0.20±0.02a 0.28±0.03ab 0.34±0.02abc 0.38±0.03bcd

2.2 各組大鼠海馬組織的病理損傷情況

HE染色結(jié)果（圖1）顯示：Normal組大鼠海馬神經(jīng)元細胞體積大而圓，細胞核居中，核仁核膜清晰，層次豐富，細胞質(zhì)著色淺且均勻；與Normal組相比，AD組大鼠海馬神經(jīng)元細胞排列紊亂，數(shù)量減少，體積變小且拉長，細胞核固縮且染色較深，胞體收縮，形狀呈多角形且極不規(guī)則；與AD組相比，Met各劑量組海馬神經(jīng)元細胞排列紊亂、變性等病理損傷逐漸減輕。

圖1 各組大鼠海馬組織的HE染色（×400）Figure1 HEstaining of hippocampusof theratsin each group（×400）

2.3 各組大鼠海馬組織中Aβ42、p-tau含量

ELISA法檢測結(jié)果顯示：與Normal組相比，AD組大鼠的海馬組織中Aβ42、p-tau含量升高（P＜0.05）；與AD組相比，Met低、中、高劑量組的大鼠海馬組織中Aβ42、p-tau含量降低（P＜0.05），且Met各劑量組上述指標變化呈劑量依賴性（表2）。

表2 各組大鼠海馬組織中Aβ42、p-tau含量及PI3K陽性表達量比較Table 2 Comparison of Aβ42 and p-tau levels and PI3K positive expression in hippocampus of the rats in each group（±s，n=10）

表2 各組大鼠海馬組織中Aβ42、p-tau含量及PI3K陽性表達量比較Table 2 Comparison of Aβ42 and p-tau levels and PI3K positive expression in hippocampus of the rats in each group（±s，n=10）

注：Aβ42即β-淀粉樣蛋白42，p-tau即磷酸化Tau蛋白。Normal指生理鹽水對照組，AD指阿爾茨海默癥模型組，Met低、中、高劑量指AD建模后分別灌胃給予50 mg/kg、100 mg/kg和200 mg/kg二甲雙胍（Met）溶液的用藥組。與Normal組相比，a P＜0.05；與AD組相比，b P＜0.05；與Met低劑量組相比，c P＜0.05；與Met中劑量組相比，d P＜0.05。

組別Normal AD Met低劑量Met中劑量Met高劑量Aβ42ρ/(ng·L-1)18.02±1.91 60.21±3.64a 48.85±2.57ab 39.07±2.26abc 20.08±2.08bcd p-tauρ/(ng·L-1)16.86±0.49 56.21±0.31a 42.85±0.37ab 30.87±0.46abc 21.68±0.48bcd PI3K陽性表達/(平均吸光度·mm-2)2.32±0.21 0.51±0.04a 1.05±0.17ab 1.47±0.16abc 1.98±0.18bcd

2.4 各組大鼠海馬組織PI3K、p-Akt、IRS-1和GSK-3蛋白表達

蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示：與Normal組相比，AD組大鼠海馬組織中PI3K、p-Akt、IRS-1蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.05），GSK-3蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與AD組相比，Met低、中、高劑量大鼠海馬組織中PI3K、p-Akt、IRS-1蛋白表達水平升高（P＜0.05），GSK-3蛋白表達水平降低（P＜0.05），且Met各劑量組上述指標的變化呈劑量依賴性（圖2）。

圖2 蛋白質(zhì)印跡法檢測各組大鼠海馬組織中PI3K、p-Akt、IRS-1、GSK-3蛋白表達水平Figure 2 Expressions of PI3K，p-Akt，IRS-1，and GSK-3 proteins in hippocampus of the rats in each group were detected by Western blotting

2.5 各組大鼠海馬組織zhong PI3K陽性表達

免疫組織化學法染色結(jié)果顯示，PI3K可陽性表達于神經(jīng)元細胞胞質(zhì)中。與Normal組相比，AD組大鼠海馬組織的PI3K陽性表達量降低（P＜0.05）；與AD組相比，Met低、中、高劑量組大鼠海馬組織中PI3K陽性表達明顯升高（P＜0.05），且Met各劑量組的PI3K表達量呈劑量依賴性（圖3）。

圖3 大鼠海馬組織PI3K免疫組織化學染色（DAB，×400）Figure 3 Immunohistochemical staining of PI3K in hippocampus tissue of the rats(DAB，×400)

3 討論

AD的主要臨床病理表現(xiàn)為認知功能缺失、學習記憶障礙及語言功能下降等［12］。側(cè)腦室注射STZ可影響腦內(nèi)葡萄糖代謝，引起腦內(nèi)tau蛋白過度磷酸化以及Aβ沉積，導致海馬神經(jīng)元損傷而損傷學習和記憶功能，是模擬人類AD腦進行性能量代謝紊亂和認知功能障礙的常用方法［13］。本研究采用上述方法建立AD大鼠模型發(fā)現(xiàn)，AD模型組大鼠平均逃避潛伏期延長，穿越平臺次數(shù)、原平臺象限游泳距離與總距離比值、游泳時間與總時間比值減少，預示其學習記憶功能下降，腦內(nèi)Aβ42與p-tau含量增多的同時，海馬神經(jīng)元也出現(xiàn)缺失、減少等病理損傷，表明造模成功。

目前臨床上仍缺乏有效藥物來預防、改善或逆轉(zhuǎn)AD發(fā)生［4］。因此尋找和探索新型、有效的AD預防藥物，已成為臨床探索研究的重要任務之一。臨床報告發(fā)現(xiàn)，降糖藥Met對AD具有一定的防治作用［14］。Lu等［15］發(fā)現(xiàn)Met可通過降低胰島素抵抗，來緩解Aβ沉積，改善AD神經(jīng)功能損傷，并推測Met可能是有應用前途的AD治療藥物。本研究發(fā)現(xiàn)，Met低、中、高劑量組大鼠空間學習及記憶功能增加的同時，海馬組織神經(jīng)元缺失、減少等病理損傷明顯得到緩解，且Met劑量越高，海馬組織中Aβ42與p-tau降低越明顯，與Lu等［15］研究結(jié)果相一致，證實了Met可能是緩解AD神經(jīng)元損傷及認知功能下降的潛在藥物。但具體分子生物學機制還不明確，仍需繼續(xù)探究。

大量研究證實P13K/AKT通路活化，與AD發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。Yao等［16］發(fā)現(xiàn)激活P13K/AKT通路，可通過抑制GSK-3表達，抑制γ分泌酶活性，降低Aβ合成，減緩Tau蛋白磷酸化過程而緩解神經(jīng)損傷。本研究也在AD大鼠腦組織內(nèi)檢測到P13K、p-AKT蛋白表達的降低及GSK-3表達的升高，提示AD大鼠腦組織P13K/AKT通路被抑制，GSK-3活化，可能是引起Aβ蓄積及神經(jīng)元損傷的主要原因。另外，IRS-1也與神經(jīng)元存活和代謝關(guān)系密切。但IRS-1與AD的關(guān)系還存在爭議。Tian等［17］及劉耀萌等［18］發(fā)現(xiàn)IRS-1在AD大鼠腦組織內(nèi)表達降低，并認為IRS-1降低，腦內(nèi)胰島素信號轉(zhuǎn)導不足而引起糖元轉(zhuǎn)換障礙，腦組織代謝降低，有害物質(zhì)蓄積，是導致AD神經(jīng)元損傷及認知功能降低的重要原因，升高IRS-1表達可激活P13K/AKT通路，改善神經(jīng)元損傷；而羅俊等［19］及郝宏錚等［20］發(fā)現(xiàn)IRS-1在AD小鼠腦組織內(nèi)表達升高，降低IRS-1表達，可促進P13K/AKT信號通路活化，改善大鼠神經(jīng)元損傷及認知功能障礙。本研究發(fā)現(xiàn)，AD模型組大鼠海馬組織中PI3K、p-AKT蛋白表達降低的同時，IRS-1表達也降低，推測大鼠側(cè)腦注射STZ后，海馬組織內(nèi)可能存在胰島素抵抗和葡萄糖轉(zhuǎn)換障礙，IRS-1表達被抑制，未能激活下游P13K/AKT通路，使活性AKT（即p-AKT）減少，不足以抑制GSK-3活性，引起p-tau、Aβ42合成增多，而導致AD大鼠認知功能障礙，與文獻［17-18］報告的AD發(fā)病機理一致。而Met低、中、高劑量組大鼠海馬組織中IRS-1、P13K、p-AKT蛋白表達升高，GSK-3表達降低，且Met各劑量組上述指標呈劑量依賴性，推測Met改善AD大鼠認知障礙、降低海馬組織p-tau、Aβ42含量、緩解神經(jīng)元損傷的作用，可能與P13K/AKT通路激活有關(guān)。

綜上所述，Met可激活AD大鼠海馬組織PI3K/AKT通路，降低海馬組織p-tau、Aβ42含量，改善AD大鼠認知障礙，這可能為闡明Met改善AD認知功能障礙的作用，提供一定參考，但PI3K/AKT通路與神經(jīng)元損傷的關(guān)系及機制復雜，本研究未設置通路抑制劑進行驗證，Met激活PI3K/AKT通路改善AD認知功能障礙的具體生物學機制仍需繼續(xù)研究。