張 韜,崔 璨,馬貫中,張愛(ài)華

(1.南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,南京211166;2.上海南方模式生物科技股份有限公司,上海200120)

嗜肺巴斯德桿菌（Pasteurella pneumotropica）屬于巴斯德菌科巴斯德菌屬，為革蘭陰性短桿或球桿菌［1］。嗜肺巴斯德桿菌是條件性致病菌，多數(shù)動(dòng)物感染后無(wú)任何臨床癥狀，但在動(dòng)物免疫機(jī)制受到抑制和應(yīng)激因子的作用下，容易發(fā)生呼吸道疾病，還可與仙臺(tái)病毒、肺支原體等呼吸道病原微生物合并感染［2］，因而影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量；而且使用隱性感染的小鼠進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生嚴(yán)重干擾［3］。

由于嗜肺巴斯德桿菌對(duì)外界理化因素抵抗力不強(qiáng)，生長(zhǎng)條件相對(duì)苛刻，在檢測(cè)中與其他細(xì)菌涂布于同一培養(yǎng)基上同時(shí)培養(yǎng)時(shí)為弱勢(shì)菌落，故傳統(tǒng)的血瓊脂平皿直接分離培養(yǎng)法易造成漏檢［4］。因此，優(yōu)化嗜肺巴斯德桿菌檢測(cè)方法以提高檢測(cè)敏感度，可避免檢測(cè)假陰性的發(fā)生。目前，針對(duì)嗜肺巴斯德桿菌感染，最有效的清除方式是剖宮產(chǎn)和胚胎移植。然而這兩種方法耗時(shí)且費(fèi)用昂貴，不適用于飼養(yǎng)量大、品系多的設(shè)施［3］。因此，需要建立一種應(yīng)急情況下快速去除嗜肺巴斯德桿菌的藥物凈化方案。

本研究評(píng)價(jià)了直接涂板法和改良增菌法對(duì)嗜肺巴斯德桿菌的檢出情況，并對(duì)本地分離出的嗜肺巴斯德桿菌進(jìn)行了抗生素敏感性測(cè)試；然后用該菌株感染小鼠后隔離飼養(yǎng)，進(jìn)一步進(jìn)行藥物安全性和凈化效果分析。本研究旨在優(yōu)化嗜肺巴斯德桿菌檢測(cè)方法，提高檢測(cè)敏感性，以強(qiáng)化嗜肺巴斯德桿菌的日常監(jiān)測(cè)，并對(duì)嗜肺巴斯德桿菌感染小鼠的藥物凈化方案進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

評(píng)價(jià)檢測(cè)方法時(shí)，選取某設(shè)施實(shí)驗(yàn)用小鼠152只。

藥物安全性評(píng)價(jià)用SPF級(jí)C57BL/6小鼠48只，雌性，7～8周齡。藥物凈化效果評(píng)價(jià)用SPF級(jí)C57BL/6小鼠80只，雌性，16～17周齡。以上實(shí)驗(yàn)小鼠均購(gòu)自南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［SCXK（蘇）2016-0002］，飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［SYXK（蘇）2015-0015］。動(dòng)物飼養(yǎng)條件：室溫（22±1）℃，相對(duì)濕度40%～70%，給予12 h晝夜光照循環(huán)，自由進(jìn)水進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，藥物凈化效果評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)小鼠均在屏障設(shè)施內(nèi)的獨(dú)立房間內(nèi)，以IVC籠具進(jìn)行隔離飼養(yǎng)，籠器具等裝置單獨(dú)進(jìn)行高壓滅菌處理。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)［IACUC-1701021］。

1.2 主要試劑和藥品

腦心浸液培養(yǎng)基購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自上?？片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司；特級(jí)馬血清購(gòu)自南京貝斯特生物技術(shù)有限公司；PCR相關(guān)試劑購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；抗菌藥物藥敏紙片（包括頭孢氨芐30μg/片、頭孢西丁30μg/片、頭孢噻吩30μg/片、頭孢羥唑30μg/片、頭孢克洛30μg/片、青霉素10U/片、四環(huán)素30μg/片、復(fù)方新諾明（磺胺甲噁唑/甲氧芐啶）23.75或1.25μg/片、丁胺卡那30μg/片、慶大霉素10μg/片、妥布霉素10μg/片、恩諾沙星10μg/片）購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；微需氧產(chǎn)氣袋購(gòu)自日本Mitsubishi Gas Chemical公司；拜有利10%恩諾沙星注射液購(gòu)自德國(guó)Bayer公司；三溴乙醇、叔戊醇購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.3 菌株

本研究第一部分優(yōu)化檢測(cè)方法時(shí)，從待檢小鼠咽拭子和氣管中分離獲得并檢測(cè)確認(rèn)為嗜肺巴斯德桿菌的菌株，收集后用于藥敏實(shí)驗(yàn)和藥物凈化研究。

1.4 主要儀器

生物安全柜（BIOⅡAdvance 6）購(gòu)自西班牙Telstar公司；生化培養(yǎng)箱（SPX-150BS-Ⅱ）購(gòu)自上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；三目生物顯微鏡（CX31RTSF）購(gòu)自日本Olympus公司；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Multiskan Spectrum）購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；NEW ATB自動(dòng)細(xì)菌鑒定分析儀（IAF020480）購(gòu)自法國(guó)BioMérieux公司；PCR儀（S1000）購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；電泳儀購(gòu)自上海天能科技有限公司。

1.5 嗜肺巴斯德桿菌檢測(cè)方法優(yōu)化

小鼠經(jīng)三溴乙醇（250 mg/kg）腹腔注射麻醉，采集咽拭子后，安樂(lè)死小鼠，無(wú)菌解剖小鼠；采集氣管內(nèi)壁分泌物，涂布于血瓊脂平皿，37℃培養(yǎng)18～24 h（直接涂板法）。然后截取0.5 cm氣管組織，將咽拭子和氣管組織一同放入增菌液（腦心浸液培養(yǎng)基+體積分?jǐn)?shù)為5%的馬血清）［5］中，37℃培養(yǎng)18～24 h（改良增菌法）。培養(yǎng)結(jié)束后，直接涂板法的血瓊脂平皿按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)［4］觀(guān)察培養(yǎng)結(jié)果；增菌培養(yǎng)的菌液接種于血瓊脂平皿，37℃分離培養(yǎng)18～24 h后觀(guān)察培養(yǎng)結(jié)果。上述步驟中觀(guān)察到的可疑菌落，均按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)［4］繼續(xù)進(jìn)行純化，用梅里埃NEWATB自動(dòng)化微生物鑒定分析系統(tǒng)以及16SrRNA通用引物PCR序列比對(duì)法［6］進(jìn)行菌株鑒定。兩種方法同時(shí)鑒定為嗜肺巴斯德桿菌者，判定為陽(yáng)性。記錄兩種方法的檢測(cè)結(jié)果，比較檢出率。

1.6 抗生素敏感性測(cè)試

采用紙片擴(kuò)散法，將嗜肺巴斯德桿菌菌株增菌過(guò)夜后，制成0.5麥?zhǔn)暇鷳乙?。將菌懸液均勻致密涂布于各血瓊脂平皿表面，室溫下放?5 min。然后將頭孢氨芐、青霉素、恩諾沙星等12種抗菌藥物藥敏紙片分別平貼于已涂布菌液的各培養(yǎng)基表面，與微需氧產(chǎn)氣袋一起置于密封袋中，37℃培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌環(huán)直徑并進(jìn)行比較分析。

1.7 恩諾沙星飲水給藥安全性實(shí)驗(yàn)

48只雌性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為6組，每組8只，飲水給藥。實(shí)驗(yàn)組每天攝入恩諾沙星劑量分別為85、150、200、250和300 mg·kg－1·d－1，配制方法是將1.73、3.05、4.08、5.10和6.10 mL恩諾沙星原液分別溶于300 mL滅菌水。連續(xù)給藥6周，對(duì)照組正常飲用滅菌水。每天觀(guān)察小鼠狀態(tài)，記錄給藥后2、6、24、48 h各組小鼠的異常表現(xiàn)和死亡情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，剖檢各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，取肝、腎組織，用體積分?jǐn)?shù)為10%的甲醛溶液固定標(biāo)本，脫水，石蠟包埋，切片后行HE染色，用于組織病理學(xué)檢查。

1.8 嗜肺巴斯德桿菌陽(yáng)性鼠藥物凈化研究

制作1×107CFU/mL（菌落形成單位，colony forming unit）的嗜肺巴斯德桿菌菌液，以100μL/只的劑量對(duì)C57BL/6小鼠進(jìn)行灌胃處理。1周后，采集咽拭子，將咽拭子放入增菌液中，按1.5節(jié)中改良增菌法進(jìn)行嗜肺巴斯德桿菌檢測(cè)。檢測(cè)出嗜肺巴斯德桿菌陽(yáng)性后，將小鼠分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組小鼠每天攝入的恩諾沙星劑量分別為50、85、150 mg·kg－1·d－1，連續(xù)給藥2周后停藥6周；對(duì)照組正常飲水。每個(gè)劑量組和對(duì)照組均4籠，每籠5只小鼠。其間每周以籠為單位，對(duì)籠內(nèi)所有小鼠采集咽拭子，按1.5節(jié)中改良增菌法進(jìn)行嗜肺巴斯德桿菌檢測(cè)。這部分實(shí)驗(yàn)中，相關(guān)微生物和感染小鼠的實(shí)驗(yàn)操作均在生物安全柜內(nèi)完成；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)所有小鼠尸體以及實(shí)驗(yàn)廢棄物等做高壓滅菌處理。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)各實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。檢測(cè)方法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析采用Fisher精確概率法；血液生化指標(biāo)結(jié)果以-±s表示，多組間比較先進(jìn)行方差分析，然后組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 嗜肺巴斯德桿菌檢測(cè)方法優(yōu)化

對(duì)152只小鼠同時(shí)采用直接涂板法和改良增菌法進(jìn)行嗜肺巴斯德桿菌檢測(cè)。結(jié)果顯示，直接涂板法只有極個(gè)別平板分離出可疑菌落（圖1A），改良增菌法平板可疑菌落生長(zhǎng)更具優(yōu)勢(shì)（圖1B）。挑取可疑菌落分離培養(yǎng)后，該菌在血平皿上呈灰白色的光滑滴露樣（圖1C）；染色后油鏡下觀(guān)察顯示，該菌為兩端鈍圓的革蘭陰性小桿菌（圖1D）。然后經(jīng)NEWATB微生物鑒定分析系統(tǒng)和16 SrRNA通用引物PCR序列比對(duì)法（圖1E）鑒定，結(jié)果均證明是嗜肺巴斯德桿菌（相似度均≥99%）。

圖1 直接涂板法（A）和改良增菌法（B）分離結(jié)果對(duì)比，以及菌落分離純化后在血平皿上的菌落形態(tài)（C）、革蘭染色鏡檢（D，×1 000）及PCR序列比對(duì)（E）結(jié)果Figure1 Results of isolation by routine procedure(A)and modified method(B)，as well as the colony morphology on blood plateafter purification(C)，microscopic result of Gram staining(D，×1 000)and sequencealignment(E)

最終，152只小鼠中一共檢出嗜肺巴斯德桿菌陽(yáng)性樣品23份（對(duì)應(yīng)23只小鼠）。其中，直接涂板法檢出率為1.3%（2/152），改良增菌法檢出率為15.1%（23/152）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示改良增菌法優(yōu)于直接涂板法。

將鑒定為嗜肺巴斯德桿菌的分離株進(jìn)行凍存，用于后續(xù)的藥敏實(shí)驗(yàn)和藥物凈化研究。

2.2 嗜肺巴斯德桿菌藥敏試驗(yàn)

選用青霉素、四環(huán)素等12種常見(jiàn)抗生素對(duì)嗜肺巴斯德桿菌做藥敏試驗(yàn)。結(jié)果顯示，所試嗜肺巴斯德桿菌菌株對(duì)恩諾沙星、頭孢西丁、頭孢羥唑、頭孢克洛、四環(huán)素、慶大霉素和妥布霉素敏感；對(duì)頭孢噻吩、復(fù)方新諾明和丁胺卡納中度敏感；對(duì)頭孢氨芐和青霉素則具有耐藥性（表1）。因此，選用恩諾沙星對(duì)小鼠進(jìn)行后續(xù)藥物凈化研究。

表1 嗜肺巴斯德桿菌菌株對(duì)12種抗生素的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table1 Antimicrobial sensitivity test resultsof Pasteurella pneumotropica to 12 antibiotic

2.3 恩諾沙星飲水給藥的安全性

恩諾沙星注射液配制成不同的質(zhì)量濃度，對(duì)小鼠進(jìn)行連續(xù)飲水給藥，實(shí)驗(yàn)期內(nèi)各劑量組小鼠飲食和精神均未見(jiàn)異常，未出現(xiàn)跛行、嘔吐、腹痛、皮膚紅斑瘙癢等異常反應(yīng)或死亡，各時(shí)間點(diǎn)大體剖檢也未見(jiàn)異常。HE染色結(jié)果（圖2）顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的肝、腎病理學(xué)檢查均未見(jiàn)明顯變化。實(shí)驗(yàn)組各劑量下的血液生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果的平均值與對(duì)照組比較，肝功能相關(guān)的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）和腎功能相關(guān)的血肌酐（CREA）的測(cè)量值較為一致，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表2）；各劑量實(shí)驗(yàn)組的堿性磷酸酶（ALP）含量高于對(duì)照組（P＜0.05），但仍在正常范圍（118±15.9）［7-8］；血尿素氮（BUN）和血尿酸（UA）水平均低于對(duì)照組（P＜0.05），但沒(méi)有明確提示意義。

表2 恩諾沙星不同劑量組小鼠的血液生化指標(biāo)Table2 Blood biochemical indexesin miceat different dosesof enrofloxacin

圖2 各組小鼠肝臟（A）和腎臟（B）組織的病理學(xué)結(jié)果（HE染色，×400）Figure 2 Histological observation on liver(A)and kidney(B)in each group(HE staining，×400)

2.4 恩諾沙星的凈化效果

綜合文獻(xiàn)［3，9～10］和安全性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)設(shè)計(jì)3個(gè)劑量梯度（50 mg·kg－1·d－1、85 mg·kg－1·d－1、150 mg·kg－1·d－1）來(lái)測(cè)試恩諾沙星飲水給藥的療效，結(jié)果如表3所示。各劑量實(shí)驗(yàn)組給予恩諾沙星飲水給藥1周后，嗜肺巴斯德桿菌陽(yáng)性小鼠均轉(zhuǎn)陰；50 mg·kg－1·d－1劑量組在停藥第6周后，4籠中有2籠出現(xiàn)嗜肺巴斯德桿菌轉(zhuǎn)陽(yáng)；但85 mg·kg－1·d－1和150 mg·kg－1·d－1劑量組維持6周仍未轉(zhuǎn)陽(yáng)。

表3 恩諾沙星藥物凈化效果Table 3 Effect of drug purification with enrofloxacin

3 討論

嗜肺巴斯德桿菌是目前國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)小鼠感染率最高的病原菌之一［11-12］。因?yàn)槭确伟退沟聴U菌本身比較脆弱、動(dòng)物感染后帶菌量較少［12］、在血平皿上屬于非優(yōu)勢(shì)菌落等原因，直接分離容易造成漏檢，因此提高嗜肺巴斯德桿菌的檢測(cè)敏感性十分重要。已有報(bào)告顯示，從小鼠咽部采樣，嗜肺巴斯德桿菌分離率最高［12］。因此，本研究使用增菌液（腦心浸液培養(yǎng)基+體積分?jǐn)?shù)為5%的馬血清）對(duì)小鼠咽拭子和氣管組織進(jìn)行增菌。結(jié)果顯示，相比于直接涂板法，改良增菌法的嗜肺巴斯德桿菌檢出率更高，提示后者可用于動(dòng)物房的日常健康監(jiān)測(cè)。

除了胚胎移植和剖宮產(chǎn)凈化外，嗜肺巴斯德桿菌感染鼠的藥物凈化方法值得進(jìn)一步探討。本研究中，本地分離的嗜肺巴斯德桿菌菌株對(duì)7種抗生素敏感。其中，恩諾沙星口服吸收較快且完全，組織分布濃度高［13］，能購(gòu)買(mǎi)到液體制劑，而其他抗生素存在口服不易吸收或劑型不方便操作等問(wèn)題。因此，本研究選擇恩諾沙星經(jīng)飲水給藥進(jìn)行后續(xù)研究。此前，有研究者嘗試用恩諾沙星治療嗜肺巴斯德桿菌陽(yáng)性小鼠，給藥劑量為8.5～85 mg·kg－1·d－1［3，9-10］。本 研 究 以85 mg·kg－1·d－1為最低劑量，設(shè)置了梯度遞進(jìn)的高濃度劑量組，進(jìn)行安全性測(cè)試。結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)條件下300 mg·kg－1·d－1以下劑量的恩諾沙星飲水給藥安全性良好，與前人在大鼠上進(jìn)行的毒理實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致［14］。因?yàn)槲墨I(xiàn)［3］中25.5 mg·kg－1·d－1劑量治療曾出現(xiàn)過(guò)疑似復(fù)發(fā)，結(jié)合安全性試驗(yàn)的結(jié)果，本研究進(jìn)一步設(shè)置50 mg·kg－1·d－1、85 mg·kg－1·d－1和150 mg·kg－1·d－1三個(gè)劑量組，探尋合適的藥物凈化劑量。既往研究中往往以單只鼠為單位進(jìn)行檢測(cè)評(píng)估療效，本研究選擇以籠為單位評(píng)估凈化效果，更接近實(shí)際飼養(yǎng)狀態(tài)，能準(zhǔn)確地反映恩諾沙星飲水給藥的效果。結(jié)果顯示，85 mg·kg－1·d－1以上劑量的恩諾沙星飲水給藥2周能有效清除感染小鼠體內(nèi)的嗜肺巴斯德桿菌，且在停藥6周后未出現(xiàn)復(fù)陽(yáng)。綜合考慮，筆者認(rèn)為每天85 mg·kg－1·d－1恩諾沙星是清除感染小鼠體內(nèi)嗜肺巴斯德桿菌的推薦劑量。

綜上所述，改良增菌法提高了嗜肺巴斯德桿菌檢測(cè)的靈敏度，可用于動(dòng)物房的日常健康監(jiān)測(cè)。在飼養(yǎng)繁育量大的非生產(chǎn)種群內(nèi)，85 mg·kg－1·d－1以上劑量的恩諾沙星飲水給藥作為一種藥物凈化手段，可以成為除剖宮產(chǎn)和胚胎移植以外清除嗜肺巴斯德桿菌的應(yīng)急替代方案。