李曉波,付 瑞,王淑菁,,李 威,王莎莎,,黃宗文,,秦 驍,,王 吉,,岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所實驗動物質(zhì)量檢測室,北京102629)

諾如病毒（norovirus）為杯狀病毒科，諾如病毒屬，其中最具代表性的是人類諾如病毒，可導致人發(fā)生急性胃腸炎。諾如病毒既能感染人，也可感染動物，并具有種屬特異性。小鼠諾如病毒（murine norovirus，MNV）是實驗小鼠中感染率最高的病原體［1-2］，各品系小鼠均易感，可致RAG2-/-/STAT1-/-小鼠死亡。雖然免疫功能正常的小鼠感染MNV后無明顯臨床癥狀，但會終生攜帶病毒，并可導致其細胞免疫功能發(fā)生變化，進而影響相關的動物實驗結果［3-6］。

大量研究表明，在人、豬、牛和小鼠中，各種諾如病毒株感染都會引起體液免疫應答［7-11］；體外表達組裝的病毒樣顆粒（virus-like particle，VLP）經(jīng)鼻或口給藥，在人類志愿者、牛、豬和小鼠中均能誘導黏膜IgA及血清IgG的產(chǎn)生。產(chǎn)生的血清抗體能夠阻斷MNV的VLP與ABH組織血型抗原結合，表明此類抗體能夠發(fā)揮抗病毒感染的保護作用，而用多種MNV的VLP組成的疫苗混合物對小鼠進行接種可增強小鼠抗體的產(chǎn)生［12-16］。

KM、BALB/c、NIH、C57BL/6J及BALB/cnu等品系小鼠為我國生物制品檢定常用小鼠，本研究采用MNV感染這5個品系的實驗小鼠，檢測其感染1～9周的多克隆抗體及中和抗體產(chǎn)生情況，分析總結各品系小鼠抗體變化規(guī)律，研究MNV感染對小鼠體液免疫應答的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

KM、BALB/c、NIH、C57BL/6J及BALB/cnu共5個品系的SPF級實驗小鼠，每個品系20只，均為4周齡，雌性，購自國家嚙齒類實驗動物種子中心［SCXK（京）2017-0005］，經(jīng)檢測符合SPF等級實驗動物國家標準且MNV為陰性。動物實驗于中國食品藥品檢定研究院屏障動物設施（生物安全2級）［SYXK（京）2017-0013］中進行，實驗所用鼠料、水及墊料等均經(jīng)滅菌處理，實驗結束后所有動物通過二氧化碳窒息處死。本研究已通過中國食品藥品檢定研究院實驗動物福利倫理審查委員會審查［批準號：中檢動（福）第2018（B）020號］，按實驗動物3R原則給予人道關懷。

1.1.2 病毒株與細胞

MNV BJ10-2062株（GenBank：KM458057）由本實驗室分離并保存［17］；RAW264.7細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，目錄號為TCM13。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)液（批號RNBH2973）購自北京細工生物科技有限公司；胎牛血清（批號1640958）購自美國Gibco公司；MNV VP1重組抗原、MNV抗體陽性及陰性血清對照均由本實驗室制備；辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG（批號10237522）購自美國KPL公司；鄰苯二胺（批號0688）購自北京博奧拓達科技有限公司；酶標儀（型號MK3）購自美國Thermo公司；恒溫培養(yǎng)箱（型號MIR-262）購自日本Sanyo公司；倒置顯微鏡（型號Ti-S）購自日本Nikon公司；二氧化碳細胞培養(yǎng)箱（型號8000DH）購自美國Thermo公司。

1.3 動物分組及處理

每個品系的實驗小鼠均隨機分為感染組和對照組，每組各10只。參考文獻［18～19］報告的劑量，感染組經(jīng)口灌胃0.2 mL MNV液（經(jīng)RAW264.7細胞培養(yǎng)的MNV），對照組灌胃0.2 mL生理鹽水（即0.9%氯化鈉溶液）。每只小鼠分別在感染MNV后的第7、14、21、28、35、42、49、56及64天，連續(xù)從眼周靜脈采血，3 000 r/min離心10 min以分離血清，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病毒感染能力測定

通過測定病毒的半數(shù)組織細胞感染量（median tissue culture infective dose，TCID50）來反映MNV的感染能力。將MNV用DMEM培養(yǎng)液稀釋成10-1～10-11系列濃度，接種于96孔RAW264.7細胞板，每個稀釋度接種1列，每孔接種0.1 mL，分別接種第1～11列；第12列為正常細胞對照，加入0.1 mL的DMEM培養(yǎng)液。置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，接種第4天記錄每孔細胞病變情況，采用Reed-Muench兩氏法計算病毒TCID50。

1.5 病毒總IgG抗體測定

參考文獻［20］，采用間接ELISA法測定每份血清的MNV總IgG抗體水平。具體步驟：用MNV VP1重組抗原包被酶標板，加入1∶40稀釋的血清，37℃孵育1 h；洗板后，加入1∶30 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG（二抗），37℃孵育1 h后加入顯色劑顯色，用酶標儀測定490 nm波長處的吸光度值。

1.6 中和抗體測定

待測血清先經(jīng)56℃水浴滅活30 min后，用DMEM培養(yǎng)液從1∶256比例開始2倍系列稀釋，共8個稀釋度；每個稀釋度加入同體積的病毒液（事先用DMEM培養(yǎng)液稀釋成200 TCID50/0.1 mL），混勻，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育1 h。設立病毒對照、MNV抗體陽性及陰性血清對照，待測血清本身有可能會對細胞產(chǎn)生毒性作用，因此隨機選擇一份待測血清作為血清毒性對照，以觀察待測血清本身是否會導致細胞病變。其中陽性和陰性血清對照與待檢血清進行平行實驗，處理過程完全相同。將病毒分別稀釋成200、20、2.0和0.2 TCID50，每個稀釋度加入同體積的DMEM培養(yǎng)液，作為病毒對照；將血清毒性對照以1∶40比例稀釋，加入同體積的DMEM培養(yǎng)液，作為血清毒性對照。上述處理好的待測血清及對照樣本置于37℃培養(yǎng)箱中反應1 h，然后加入96孔RAW264.7細胞板中，每孔0.1 mL，每個稀釋度設置4個平行孔；最后1列作為細胞對照，每孔加入0.1 mL的DMEM培養(yǎng)液。接種后第4天進行結果判定。

中和抗體滴度計算：陽性對照及血清毒性對照不出現(xiàn)細胞病變效應（cytopathic effect，CPE），陰性對照出現(xiàn)CPE，病毒對照200 TCID50出現(xiàn)CPE，0.2 TCID50不出現(xiàn)CPE，符合上述條件說明實驗成立，可進行結果判定。采用Reed-Muench兩氏法計算中和抗體滴度：距離比例＝（高于50%病變率的百分數(shù)－50%）/（高于50%病變率的百分數(shù)－低于50%病變率的百分數(shù)），lgPD50＝高于50%血清的稀釋度的對數(shù)－距離比例×稀釋度對數(shù)之間的差；其中，PD50（median protective dose，半數(shù)保護劑量）即為中和抗體滴度。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行實驗結果分析，計量數(shù)據(jù)用-±s表示。感染組和對照組在每個時間點的總抗體吸光度均值差異比較采用t檢驗；各品系小鼠感染組總抗體吸光度均值及中和抗體滴度均值比較先采用方差分析，然后用LSD-t檢驗進行兩兩比較，以P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各品系小鼠感染MNV后的總抗體水平

2.1.1 每個時間點的總IgG抗體吸光度均值比較

各品系小鼠感染MNV后每個時間點，對照組和感染組的總抗體吸光度均值分別經(jīng)t檢驗比較，結果表明KM、BALB/c、NIH、C57BL/6J及BALB/c-nu小鼠分別在感染后第21、35、14、及28天感染組吸光度均值明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），即抗體開始轉陽（圖1）。

圖1 各品系小鼠感染小鼠諾如病毒后的抗體變化Figure1 Antibody changesin variousstrainsof miceafter MNV infection

2.1.2 總IgG抗體吸光度均值變化規(guī)律

各品系小鼠感染MNV后的抗體變化規(guī)律見圖1。NIH小鼠第21～28天和第35～42天這兩個時間段的抗體水平升高最快，第42天后放緩，第49天進入平臺期；C57BL/6J小鼠第7～35天的抗體水平升高緩慢，第35～42天抗體水平迅速升高，隨后稍有放緩，至第56天進一步放緩；KM小鼠第7～35天抗體水平上升較緩慢，第35～56天處于快速上升期，隨后放緩；BALB/c與BALB/c-nu小鼠相比，前35天BALB/c-nu小鼠抗體產(chǎn)生速度快于BALB/c，隨后BALB/c小鼠升高較快，而BALB/c-nu小鼠抗體水平基本不變，至第42天兩者抗體水平相近，隨后BALB/c小鼠繼續(xù)升高，而BALB/c-nu小鼠開始緩慢下降。

2.2 各品系小鼠感染MNV后的中和抗體水平

2.2.1 病毒TCID50測定

接種細胞第4天觀察記錄細胞出現(xiàn)CPE的情況，結果見表1。采用Reed-Muench兩氏法計算MNV病毒液的TCID50為10-5.330/0.1 mL。

表1 RAW264.7細胞接種MNV后最終細胞病變效應結果Table1 Final CPEresultsof MNV inoculation

2.2.2 不同品系小鼠的中和抗體滴度比較

采用單因素方差法分析比較各品系小鼠的中和抗體滴度，NIH、C57BL/6J及KM小鼠之間無明顯差異（P＞0.05）；BALB/c小鼠的lgPD50為3.146，明顯低于NIH、C57BL/6J及KM小鼠（P＜0.01）；BALB/c-nu小鼠的lgPD50為2.338，明顯低于NIH、C57BL/6J、KM及BALB/c小鼠（P＜0.01，圖2A）。

圖2 各品系小鼠中和抗體滴度比較（A）及中和抗體變化規(guī)律（B）Figure 2 Comparison of neutralizing antibody titers（A）and the change curve of neutralizing antibody（B）of mice of variousstrains

2.2.3 中和抗體滴度變化規(guī)律

各品系小鼠感染MNV不同時間的中和抗體變化規(guī)律見圖2B。KM小鼠感染第7天及第14天各有2份血清未檢出中和抗體（最低限值lgPD50為2.408），隨后中和抗體滴度不斷升高，至第42天到達平臺期；C57BL/6J小鼠感染第2周時中和抗體滴度迅速升高，第14天開始放緩，第56天達最高值（有1份樣本超出檢測限，最高限值lgPD50為4.515）；NIH小鼠感染第7～35天中和抗體滴度迅速升高，至第35天到達平臺期；BALB/c小鼠中和抗體滴度變化趨勢與C57BL/6J小鼠相似，感染第2周中和抗體滴度迅速升高，第14天開始放緩，第64天到達峰值。與其他品系不同，BALB/c-nu小鼠中和抗體一直維持在較低水平，隨時間變化幅度不大。

3 討論

MNV是第一個可以通過細胞進行體外培養(yǎng)的諾如病毒，可在原代巨噬細胞和樹突狀細胞中生長，也可在傳代細胞小鼠巨噬細胞系RAW264.7上生長并能夠產(chǎn)生CPE［21-22］。通過RAW264.7細胞體外培養(yǎng)體系能夠分離到MNV的單克隆中和抗體，研究發(fā)現(xiàn)其識別的抗原決定簇存在于主要衣殼蛋白VP1中一個高度可變的P2結構域［23-24］。Chachu等［25］研究發(fā)現(xiàn)，MNV特異的B細胞和免疫抗體IgG在清除病毒中起重要作用，B細胞缺陷小鼠無法像野生型小鼠一樣有效地清除原發(fā)性MNV感染，將源自B細胞缺陷小鼠或抗體產(chǎn)生缺陷小鼠的免疫脾細胞過繼轉移至適應性免疫應答缺陷的RGA-/-小鼠，無法有效清除MNV的持續(xù)感染，而過繼轉移多克隆抗MNV血清或中和性抗MNV單克隆抗體則足以降低全身和腸道中MNV的水平。以上研究表明，MNV感染的體液免疫應答在抗病毒感染過程中發(fā)揮了重要作用。

MNV感染的小鼠能夠產(chǎn)生明顯的抗體反應，產(chǎn)生的抗體可被中和［24］。早期研究發(fā)現(xiàn)，MNV感染CD-1小鼠后第1周抗體出現(xiàn)陽性，隨后抗體滴度不斷升高，一直到第5周實驗結束時仍未出現(xiàn)下降［26］；該結果表明MNV抗體在動物體內(nèi)能夠長期持續(xù)存在。本研究進一步發(fā)現(xiàn)各品系小鼠抗體變化的規(guī)律不同：NIH小鼠在感染第49天時總抗體水平進入平臺期，一直持續(xù)到實驗結束（第64天）；C57BL/6J、KM及BALB/c小鼠的總抗體水平在實驗周期內(nèi)（9周）持續(xù)升高；BALB/c-nu小鼠在第42天總抗體達峰值，隨后緩慢下降。中和抗體變化規(guī)律與總IgG抗體略有不同，其中C57BL/6J和BLAB/c小鼠在感染前兩周中和抗體滴度迅速升高，隨后升高幅度減緩；KM及NIH小鼠中和抗體分別在感染后第42天和第35天進入平臺期；與其他品系小鼠不同，BALB/c-nu小鼠的中和抗體滴度一直維持在較低水平，比較恒定。BALB/c-nu小鼠為無胸腺小鼠，T細胞免疫缺陷，與BALB/c小鼠相比，其中和抗體水平明顯降低，說明T細胞缺陷影響了B細胞的活化及MNV特異抗體的產(chǎn)生，T細胞和B細胞發(fā)揮的適應性免疫應答是清除MNV感染的關鍵。另外，BALB/c及BALB/c-nu小鼠的總IgG抗體水平顯著低于NIH及C57BL/6J小鼠（P＜0.05），而BALB/c及BALB/c-nu小鼠的中和抗體滴度顯著低于C57BL/6J、NIH及KM小鼠（P＜0.01）。以上結果表明MNV感染能夠引起NIH、C57BL/6J、KM小鼠發(fā)生較強的體液免疫應答，而BALB/c及BALB/c-nu小鼠的體液應答較弱。

盡管NIH、C57BL/6J和KM小鼠的中和抗體水平較高，但其腸道病毒含量均處于較高水平，表現(xiàn)為長期持續(xù)感染［27］。有報道顯示，MNV可能通過腸道微生物的保護或腸道細胞的特殊分化等機制，逃避了體液免疫應答，因此腸道發(fā)揮著特殊的MNV“避難所”作用［28-29］，而肝、脾、肺等組織大部分不含病毒［27］，說明免疫系統(tǒng)在這些組織中能夠正常發(fā)揮抗病毒功能。

本研究結果表明5個品系小鼠感染MNV產(chǎn)生的體液免疫應答各不相同，可推測應用不同品系小鼠進行疫苗等生物制品效價評價實驗產(chǎn)生的結果會有所不同，進一步研究不同品系小鼠在疫苗效價評價實驗中的差異對指導疫苗檢定用動物的選擇具有重要的指導意義，同時這些品系小鼠感染MNV是否會影響生物制品動物實驗的結果，以及產(chǎn)生什么樣的影響，這些仍需進一步研究和探討。