李曉波,付 瑞,王淑菁,,李 威,王莎莎,,黃宗文,,秦 驍,,王 吉,,岳秉飛

(中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)室,北京102629)

諾如病毒（norovirus）為杯狀病毒科，諾如病毒屬，其中最具代表性的是人類諾如病毒，可導(dǎo)致人發(fā)生急性胃腸炎。諾如病毒既能感染人，也可感染動(dòng)物，并具有種屬特異性。小鼠諾如病毒（murine norovirus，MNV）是實(shí)驗(yàn)小鼠中感染率最高的病原體［1-2］，各品系小鼠均易感，可致RAG2-/-/STAT1-/-小鼠死亡。雖然免疫功能正常的小鼠感染MNV后無(wú)明顯臨床癥狀，但會(huì)終生攜帶病毒，并可導(dǎo)致其細(xì)胞免疫功能發(fā)生變化，進(jìn)而影響相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果［3-6］。

大量研究表明，在人、豬、牛和小鼠中，各種諾如病毒株感染都會(huì)引起體液免疫應(yīng)答［7-11］；體外表達(dá)組裝的病毒樣顆粒（virus-like particle，VLP）經(jīng)鼻或口給藥，在人類志愿者、牛、豬和小鼠中均能誘導(dǎo)黏膜IgA及血清IgG的產(chǎn)生。產(chǎn)生的血清抗體能夠阻斷MNV的VLP與ABH組織血型抗原結(jié)合，表明此類抗體能夠發(fā)揮抗病毒感染的保護(hù)作用，而用多種MNV的VLP組成的疫苗混合物對(duì)小鼠進(jìn)行接種可增強(qiáng)小鼠抗體的產(chǎn)生［12-16］。

KM、BALB/c、NIH、C57BL/6J及BALB/cnu等品系小鼠為我國(guó)生物制品檢定常用小鼠，本研究采用MNV感染這5個(gè)品系的實(shí)驗(yàn)小鼠，檢測(cè)其感染1～9周的多克隆抗體及中和抗體產(chǎn)生情況，分析總結(jié)各品系小鼠抗體變化規(guī)律，研究MNV感染對(duì)小鼠體液免疫應(yīng)答的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

KM、BALB/c、NIH、C57BL/6J及BALB/cnu共5個(gè)品系的SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)小鼠，每個(gè)品系20只，均為4周齡，雌性，購(gòu)自國(guó)家嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心［SCXK（京）2017-0005］，經(jīng)檢測(cè)符合SPF等級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)且MNV為陰性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)于中國(guó)食品藥品檢定研究院屏障動(dòng)物設(shè)施（生物安全2級(jí)）［SYXK（京）2017-0013］中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)所用鼠料、水及墊料等均經(jīng)滅菌處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后所有動(dòng)物通過(guò)二氧化碳窒息處死。本研究已通過(guò)中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查委員會(huì)審查［批準(zhǔn)號(hào)：中檢動(dòng)（福）第2018（B）020號(hào)］，按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3R原則給予人道關(guān)懷。

1.1.2 病毒株與細(xì)胞

MNV BJ10-2062株（GenBank：KM458057）由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存［17］；RAW264.7細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，目錄號(hào)為TCM13。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)液（批號(hào)RNBH2973）購(gòu)自北京細(xì)工生物科技有限公司；胎牛血清（批號(hào)1640958）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；MNV VP1重組抗原、MNV抗體陽(yáng)性及陰性血清對(duì)照均由本實(shí)驗(yàn)室制備；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG（批號(hào)10237522）購(gòu)自美國(guó)KPL公司；鄰苯二胺（批號(hào)0688）購(gòu)自北京博奧拓達(dá)科技有限公司；酶標(biāo)儀（型號(hào)MK3）購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)MIR-262）購(gòu)自日本Sanyo公司；倒置顯微鏡（型號(hào)Ti-S）購(gòu)自日本Nikon公司；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（型號(hào)8000DH）購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.3 動(dòng)物分組及處理

每個(gè)品系的實(shí)驗(yàn)小鼠均隨機(jī)分為感染組和對(duì)照組，每組各10只。參考文獻(xiàn)［18～19］報(bào)告的劑量，感染組經(jīng)口灌胃0.2 mL MNV液（經(jīng)RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)的MNV），對(duì)照組灌胃0.2 mL生理鹽水（即0.9%氯化鈉溶液）。每只小鼠分別在感染MNV后的第7、14、21、28、35、42、49、56及64天，連續(xù)從眼周靜脈采血，3 000 r/min離心10 min以分離血清，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病毒感染能力測(cè)定

通過(guò)測(cè)定病毒的半數(shù)組織細(xì)胞感染量（median tissue culture infective dose，TCID50）來(lái)反映MNV的感染能力。將MNV用DMEM培養(yǎng)液稀釋成10-1～10-11系列濃度，接種于96孔R(shí)AW264.7細(xì)胞板，每個(gè)稀釋度接種1列，每孔接種0.1 mL，分別接種第1～11列；第12列為正常細(xì)胞對(duì)照，加入0.1 mL的DMEM培養(yǎng)液。置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，接種第4天記錄每孔細(xì)胞病變情況，采用Reed-Muench兩氏法計(jì)算病毒TCID50。

1.5 病毒總IgG抗體測(cè)定

參考文獻(xiàn)［20］，采用間接ELISA法測(cè)定每份血清的MNV總IgG抗體水平。具體步驟：用MNV VP1重組抗原包被酶標(biāo)板，加入1∶40稀釋的血清，37℃孵育1 h；洗板后，加入1∶30 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG（二抗），37℃孵育1 h后加入顯色劑顯色，用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。

1.6 中和抗體測(cè)定

待測(cè)血清先經(jīng)56℃水浴滅活30 min后，用DMEM培養(yǎng)液從1∶256比例開始2倍系列稀釋，共8個(gè)稀釋度；每個(gè)稀釋度加入同體積的病毒液（事先用DMEM培養(yǎng)液稀釋成200 TCID50/0.1 mL），混勻，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育1 h。設(shè)立病毒對(duì)照、MNV抗體陽(yáng)性及陰性血清對(duì)照，待測(cè)血清本身有可能會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，因此隨機(jī)選擇一份待測(cè)血清作為血清毒性對(duì)照，以觀察待測(cè)血清本身是否會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞病變。其中陽(yáng)性和陰性血清對(duì)照與待檢血清進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，處理過(guò)程完全相同。將病毒分別稀釋成200、20、2.0和0.2 TCID50，每個(gè)稀釋度加入同體積的DMEM培養(yǎng)液，作為病毒對(duì)照；將血清毒性對(duì)照以1∶40比例稀釋，加入同體積的DMEM培養(yǎng)液，作為血清毒性對(duì)照。上述處理好的待測(cè)血清及對(duì)照樣本置于37℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)1 h，然后加入96孔R(shí)AW264.7細(xì)胞板中，每孔0.1 mL，每個(gè)稀釋度設(shè)置4個(gè)平行孔；最后1列作為細(xì)胞對(duì)照，每孔加入0.1 mL的DMEM培養(yǎng)液。接種后第4天進(jìn)行結(jié)果判定。

中和抗體滴度計(jì)算：陽(yáng)性對(duì)照及血清毒性對(duì)照不出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE），陰性對(duì)照出現(xiàn)CPE，病毒對(duì)照200 TCID50出現(xiàn)CPE，0.2 TCID50不出現(xiàn)CPE，符合上述條件說(shuō)明實(shí)驗(yàn)成立，可進(jìn)行結(jié)果判定。采用Reed-Muench兩氏法計(jì)算中和抗體滴度：距離比例＝（高于50%病變率的百分?jǐn)?shù)－50%）/（高于50%病變率的百分?jǐn)?shù)－低于50%病變率的百分?jǐn)?shù)），lgPD50＝高于50%血清的稀釋度的對(duì)數(shù)－距離比例×稀釋度對(duì)數(shù)之間的差；其中，PD50（median protective dose，半數(shù)保護(hù)劑量）即為中和抗體滴度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用-±s表示。感染組和對(duì)照組在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的總抗體吸光度均值差異比較采用t檢驗(yàn)；各品系小鼠感染組總抗體吸光度均值及中和抗體滴度均值比較先采用方差分析，然后用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各品系小鼠感染MNV后的總抗體水平

2.1.1 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的總IgG抗體吸光度均值比較

各品系小鼠感染MNV后每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，對(duì)照組和感染組的總抗體吸光度均值分別經(jīng)t檢驗(yàn)比較，結(jié)果表明KM、BALB/c、NIH、C57BL/6J及BALB/c-nu小鼠分別在感染后第21、35、14、及28天感染組吸光度均值明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），即抗體開始轉(zhuǎn)陽(yáng)（圖1）。

圖1 各品系小鼠感染小鼠諾如病毒后的抗體變化Figure1 Antibody changesin variousstrainsof miceafter MNV infection

2.1.2 總IgG抗體吸光度均值變化規(guī)律

各品系小鼠感染MNV后的抗體變化規(guī)律見圖1。NIH小鼠第21～28天和第35～42天這兩個(gè)時(shí)間段的抗體水平升高最快，第42天后放緩，第49天進(jìn)入平臺(tái)期；C57BL/6J小鼠第7～35天的抗體水平升高緩慢，第35～42天抗體水平迅速升高，隨后稍有放緩，至第56天進(jìn)一步放緩；KM小鼠第7～35天抗體水平上升較緩慢，第35～56天處于快速上升期，隨后放緩；BALB/c與BALB/c-nu小鼠相比，前35天BALB/c-nu小鼠抗體產(chǎn)生速度快于BALB/c，隨后BALB/c小鼠升高較快，而BALB/c-nu小鼠抗體水平基本不變，至第42天兩者抗體水平相近，隨后BALB/c小鼠繼續(xù)升高，而BALB/c-nu小鼠開始緩慢下降。

2.2 各品系小鼠感染MNV后的中和抗體水平

2.2.1 病毒TCID50測(cè)定

接種細(xì)胞第4天觀察記錄細(xì)胞出現(xiàn)CPE的情況，結(jié)果見表1。采用Reed-Muench兩氏法計(jì)算MNV病毒液的TCID50為10-5.330/0.1 mL。

表1 RAW264.7細(xì)胞接種MNV后最終細(xì)胞病變效應(yīng)結(jié)果Table1 Final CPEresultsof MNV inoculation

2.2.2 不同品系小鼠的中和抗體滴度比較

采用單因素方差法分析比較各品系小鼠的中和抗體滴度，NIH、C57BL/6J及KM小鼠之間無(wú)明顯差異（P＞0.05）；BALB/c小鼠的lgPD50為3.146，明顯低于NIH、C57BL/6J及KM小鼠（P＜0.01）；BALB/c-nu小鼠的lgPD50為2.338，明顯低于NIH、C57BL/6J、KM及BALB/c小鼠（P＜0.01，圖2A）。

圖2 各品系小鼠中和抗體滴度比較（A）及中和抗體變化規(guī)律（B）Figure 2 Comparison of neutralizing antibody titers（A）and the change curve of neutralizing antibody（B）of mice of variousstrains

2.2.3 中和抗體滴度變化規(guī)律

各品系小鼠感染MNV不同時(shí)間的中和抗體變化規(guī)律見圖2B。KM小鼠感染第7天及第14天各有2份血清未檢出中和抗體（最低限值lgPD50為2.408），隨后中和抗體滴度不斷升高，至第42天到達(dá)平臺(tái)期；C57BL/6J小鼠感染第2周時(shí)中和抗體滴度迅速升高，第14天開始放緩，第56天達(dá)最高值（有1份樣本超出檢測(cè)限，最高限值lgPD50為4.515）；NIH小鼠感染第7～35天中和抗體滴度迅速升高，至第35天到達(dá)平臺(tái)期；BALB/c小鼠中和抗體滴度變化趨勢(shì)與C57BL/6J小鼠相似，感染第2周中和抗體滴度迅速升高，第14天開始放緩，第64天到達(dá)峰值。與其他品系不同，BALB/c-nu小鼠中和抗體一直維持在較低水平，隨時(shí)間變化幅度不大。

3 討論

MNV是第一個(gè)可以通過(guò)細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)的諾如病毒，可在原代巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中生長(zhǎng)，也可在傳代細(xì)胞小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7上生長(zhǎng)并能夠產(chǎn)生CPE［21-22］。通過(guò)RAW264.7細(xì)胞體外培養(yǎng)體系能夠分離到MNV的單克隆中和抗體，研究發(fā)現(xiàn)其識(shí)別的抗原決定簇存在于主要衣殼蛋白VP1中一個(gè)高度可變的P2結(jié)構(gòu)域［23-24］。Chachu等［25］研究發(fā)現(xiàn)，MNV特異的B細(xì)胞和免疫抗體IgG在清除病毒中起重要作用，B細(xì)胞缺陷小鼠無(wú)法像野生型小鼠一樣有效地清除原發(fā)性MNV感染，將源自B細(xì)胞缺陷小鼠或抗體產(chǎn)生缺陷小鼠的免疫脾細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移至適應(yīng)性免疫應(yīng)答缺陷的RGA-/-小鼠，無(wú)法有效清除MNV的持續(xù)感染，而過(guò)繼轉(zhuǎn)移多克隆抗MNV血清或中和性抗MNV單克隆抗體則足以降低全身和腸道中MNV的水平。以上研究表明，MNV感染的體液免疫應(yīng)答在抗病毒感染過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。

MNV感染的小鼠能夠產(chǎn)生明顯的抗體反應(yīng)，產(chǎn)生的抗體可被中和［24］。早期研究發(fā)現(xiàn)，MNV感染CD-1小鼠后第1周抗體出現(xiàn)陽(yáng)性，隨后抗體滴度不斷升高，一直到第5周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)仍未出現(xiàn)下降［26］；該結(jié)果表明MNV抗體在動(dòng)物體內(nèi)能夠長(zhǎng)期持續(xù)存在。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)各品系小鼠抗體變化的規(guī)律不同：NIH小鼠在感染第49天時(shí)總抗體水平進(jìn)入平臺(tái)期，一直持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束（第64天）；C57BL/6J、KM及BALB/c小鼠的總抗體水平在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)（9周）持續(xù)升高；BALB/c-nu小鼠在第42天總抗體達(dá)峰值，隨后緩慢下降。中和抗體變化規(guī)律與總IgG抗體略有不同，其中C57BL/6J和BLAB/c小鼠在感染前兩周中和抗體滴度迅速升高，隨后升高幅度減緩；KM及NIH小鼠中和抗體分別在感染后第42天和第35天進(jìn)入平臺(tái)期；與其他品系小鼠不同，BALB/c-nu小鼠的中和抗體滴度一直維持在較低水平，比較恒定。BALB/c-nu小鼠為無(wú)胸腺小鼠，T細(xì)胞免疫缺陷，與BALB/c小鼠相比，其中和抗體水平明顯降低，說(shuō)明T細(xì)胞缺陷影響了B細(xì)胞的活化及MNV特異抗體的產(chǎn)生，T細(xì)胞和B細(xì)胞發(fā)揮的適應(yīng)性免疫應(yīng)答是清除MNV感染的關(guān)鍵。另外，BALB/c及BALB/c-nu小鼠的總IgG抗體水平顯著低于NIH及C57BL/6J小鼠（P＜0.05），而BALB/c及BALB/c-nu小鼠的中和抗體滴度顯著低于C57BL/6J、NIH及KM小鼠（P＜0.01）。以上結(jié)果表明MNV感染能夠引起NIH、C57BL/6J、KM小鼠發(fā)生較強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答，而BALB/c及BALB/c-nu小鼠的體液應(yīng)答較弱。

盡管NIH、C57BL/6J和KM小鼠的中和抗體水平較高，但其腸道病毒含量均處于較高水平，表現(xiàn)為長(zhǎng)期持續(xù)感染［27］。有報(bào)道顯示，MNV可能通過(guò)腸道微生物的保護(hù)或腸道細(xì)胞的特殊分化等機(jī)制，逃避了體液免疫應(yīng)答，因此腸道發(fā)揮著特殊的MNV“避難所”作用［28-29］，而肝、脾、肺等組織大部分不含病毒［27］，說(shuō)明免疫系統(tǒng)在這些組織中能夠正常發(fā)揮抗病毒功能。

本研究結(jié)果表明5個(gè)品系小鼠感染MNV產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答各不相同，可推測(cè)應(yīng)用不同品系小鼠進(jìn)行疫苗等生物制品效價(jià)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的結(jié)果會(huì)有所不同，進(jìn)一步研究不同品系小鼠在疫苗效價(jià)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)中的差異對(duì)指導(dǎo)疫苗檢定用動(dòng)物的選擇具有重要的指導(dǎo)意義，同時(shí)這些品系小鼠感染MNV是否會(huì)影響生物制品動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以及產(chǎn)生什么樣的影響，這些仍需進(jìn)一步研究和探討。