唐錚灝，劉 潔，陳 巧，謝 皓

(北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點實驗室，北京102206)

株高是大豆育種中一個重要的農(nóng)藝性狀，矮稈表型對于選育具有理想株型的高產(chǎn)品種起到重要作用[1]，矮稈能夠提高抗倒伏和光能利用率，實現(xiàn)大豆產(chǎn)量的提高[2-3]。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，矮稈基因不斷被發(fā)掘出來，并應(yīng)用于培育矮稈品種[4]。例如，HWANG等[5]利用輻照發(fā)現(xiàn)一個大豆矮稈突變體，培育出Hobbit 87、Charleston、Apex和Strong等半矮稈品種，顯著提高大豆的產(chǎn)量。據(jù)分析[6-7]，大豆株高的遺傳力較高，約85.6%，受主效基因和多對微效基因共同控制，同時環(huán)境對大豆表型影響也較大。何平等[8]對矬大豆、早豐5、九交7601等品種的研究表明，株高由隱性主效單基因及若干修飾基因控制；目前在SoyBean數(shù)據(jù)庫中收集約200多個與株高有關(guān)的數(shù)量性狀位點(quantitative trait loci，QTL)[9-10]。除發(fā)現(xiàn)調(diào)控株高的主效基因外，DONG等[11]研究認(rèn)為，大豆品種Jimidou-1和Gongjiao 9112雜交后代的半矮性狀受一個隱性基因控制；LI等[12]用EMS誘變大豆品種中品661，獲得一個矮稈突變體dw，發(fā)現(xiàn)dw的矮稈性狀由1對隱性核基因控制。

本課題組在大豆新品種選育過程中，從高稈品種海系13與矮稈品種北農(nóng)103雜交的分離后代中，發(fā)現(xiàn)高稈和矮稈性狀極端分離的情況。經(jīng)對該雜交組合F2群體的遺傳分析和分子標(biāo)記初步定位，北農(nóng)103攜帶1對調(diào)控矮稈性狀的隱性核基因，位于大豆19號染色體(L連鎖群)上[13]。本研究在此基礎(chǔ)上，對該基因進行精細定位和克隆，為進一步研究和利用北農(nóng)103及其矮稈基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

大豆矮稈品種北農(nóng)103、高稈品種海系13和以北農(nóng)103為父本、海系13為母本雜交構(gòu)建的688個F5代重組自交系(342個矮稈系和346個高稈系)。其中，北農(nóng)103為北京農(nóng)學(xué)院選育、北京市農(nóng)作物品種審定委員會審定的夏播品種，為有限生長型品種，株高55 cm；海系13為南京品種，半有限生長型，北京夏播株高90 cm。試驗材料由本課題組保存和提供，種植在北京農(nóng)學(xué)院大豆試驗地。

1.2 試驗方法

1.2.1 株高鑒定與田間取樣 大豆植株開花結(jié)束后，株高不再生長時，鑒定各個自交系的株高，矮稈系50 cm左右，高稈系90 cm左右。分別采取矮稈系和高稈系幼嫩葉片于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 BSA-Seq混池的構(gòu)建、重測序及矮稈基因初步定位 選取矮稈和高稈重組自交系葉片各30份，提取DNA，將DNA等量混合構(gòu)建矮稈和高稈混池，并以矮稈父本北農(nóng)103和高稈母本海系13為對照，利用高通量重測序技術(shù)，分析株高在大豆全基因組變異情況及相關(guān)區(qū)域。測序及數(shù)據(jù)基本分析由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.2.3 分子標(biāo)記的開發(fā) 在高通量重測序的基礎(chǔ)上，參照大豆數(shù)據(jù)庫Soybase(https://soybase.org/)提供的SSR引物序列合成引物，同時利用測序數(shù)據(jù)設(shè)計插入缺失位點標(biāo)記引物。引物由北京擎科新業(yè)生物科技有限公司合成。

1.2.4 DNA提取和PCR體系 CTAB法提取葉片DNA。參照袁鷹等[13]的方法，PCR反應(yīng)體系10 μL，其中，1 μL引物(2 μmol/L)，5 μL 2×T5 Super PCR Mix，2 μL樣品DNA(15～25 ng/μL)，2 μL ddH2O；PCR反應(yīng)程序，95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性45 s；55～60 ℃退火45 s；72 ℃延伸30 s；35次循環(huán)， 72 ℃延伸10 min。利用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。

1.2.5 遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建及目標(biāo)基因的定位 以(海系13×北農(nóng)103) F5重組自交系為定位材料，根據(jù)688個重組自交系產(chǎn)生的分子標(biāo)記和對應(yīng)自交系的田間株高表型，利用Mapmaker 3.0和MapDraw V2.1軟件進行遺傳連鎖距離分析；根據(jù)標(biāo)記與株高性狀的緊密連鎖程度，參照大豆遺傳連鎖圖譜(https://soybase.org/)定位矮稈基因。

1.2.6 基因克隆 根據(jù)矮稈基因定位結(jié)果，在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上分析定位區(qū)域內(nèi)的已知基因，推測可能與矮稈性狀相關(guān)的候選基因，并根據(jù)其序列設(shè)計引物。以海系13、北農(nóng)103和(海系13×北農(nóng)103) F5重組自交系中矮稈、高稈各3株幼葉提取的DNA為模板，進行PCR擴增，擴增結(jié)果連接至pEASY-BluntZero載體上，培養(yǎng)后挑取單克隆及重組體菌液PCR鑒定。取300 μL陽性克隆菌液上游引物、下游引物各20 μL，在北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進行測序。pEASY-BluntZeroCloning Kit試劑盒購自北京全式金生物公司。

1.2.7 株高發(fā)育期候選基因表達量分析 采用實時熒光定量分析法，分別在苗期、花芽分化期、開花期、成熟前期摘取北農(nóng)103和海系13頂部相同位置的葉片，利用試劑盒TransZol Up，提取RNA；以Goldenstar RT6 cDNA Synthesis Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄RNA。根據(jù)候選基因序列設(shè)計引物進行實時熒光定量PCR，檢測候選基因表達量，參照劉潔等[14]的方法，PCR體系為25 μL：上游引物和下游引物各1 μL(10 μmol/L)，12.5 μL SYBR GREEN PCR Premix HS Taq，2 μL模板cDNA，8.5 μL H2O(DNase free)。PCR反應(yīng)程序，94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性30 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，40次循環(huán)；熔解曲線，95 ℃ 10 s，65 ℃ 60 s，97 ℃ 1 s。試劑購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實時熒光定量分析試驗均重復(fù)3次，經(jīng)儀器自動分析獲得基因的Ct值，用Microsoft Excel軟件作圖分析，SPSS軟件分析顯著性，用3次重復(fù)的平均值比較高稈基因和矮稈基因的相對表達量，相對表達量的計算采用2-△△Ct法[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 株高性狀高通量測序分析

株高性狀高通量測序分析見表1。全基因組高通量重測序共獲得178.48G數(shù)據(jù)量，原始數(shù)據(jù)總序列數(shù)為539.24M，Q30達到93.84%，親本樣品平均測序深度為35X，矮稈系和高稈系混池樣品平均測序深度為36X。測樣與參考基因平均比對率為99.72%，平均覆蓋深度為36X，基因組覆蓋度為93%。當(dāng)置信度為0.99時，控制株高性狀的基因可能位于大豆10號、19號、2號、4號和8號染色體的5個區(qū)域中，共有1 461個候選基因，301個單核苷酸多態(tài)性位點和57個插入缺失位點。

表1 矮稈性狀基因和高稈性狀基因全基因組高通量重測序結(jié)果Tab.1 Whole genome high throughput resequencing of dwarf/tall trait genes

2.2 矮稈基因精細定位

根據(jù)初步定位結(jié)果，選取10號、19號、2號、4號和8號染色體上SSR引物，從(海系13×北農(nóng)103) F5重組自交系群體中選取矮稈系和高稈系各4份，采用集團分離分析法，建立矮稈和高稈2個近等基因池，通過PCR擴增，檢測引物產(chǎn)生的多態(tài)性。在19號染色體(L)上的56對SSR引物中有12對引物在混池擴增出多態(tài)性，而在10號、2號、4號和8號染色體上的SSR引物的擴增結(jié)果未檢測出多態(tài)性。將產(chǎn)生多態(tài)性的12對SSR引物，分別對群體中346個高稈系和342個矮稈系的DNA進行PCR檢測，12對引物中有10對引物產(chǎn)生的多態(tài)性標(biāo)記與矮稈基因緊密連鎖。為增加標(biāo)記的數(shù)量，根據(jù)全基因組重測序結(jié)果中19號染色體(L)48 410 000到50 666 457區(qū)域內(nèi)DNA的序列，設(shè)計50對插入/缺失標(biāo)記，通過PCR多態(tài)性檢測，發(fā)現(xiàn)缺失標(biāo)記XH-8和XH-23與矮稈基因緊密連鎖。最終，共發(fā)現(xiàn)12對引物(表2)擴增產(chǎn)生的標(biāo)記與矮稈基因緊密連鎖。其中，引物Satt373的部分PCR結(jié)果如圖1。

表2 12對SSR引物的序列信息及位置Tab.2 Information of 12 pairs of SSR primers used in this study

利用Mapmaker3.0和MapDraw V2.1軟件對12對引物與688個自交系的DNA擴增的標(biāo)記基因型數(shù)據(jù)和688個自交系的表型數(shù)據(jù)進行遺傳連鎖分析，繪制出遺傳連鎖圖譜(圖2)。根據(jù)袁鷹等[13]的建議，將矮稈基因暫命名為Gmd1。遺傳連鎖分析表明標(biāo)記Satt373、XH-8、Sat_245、Satt513、XH-23、Satt229、Satt527、Satt166、Satt481、Satt418 、Sat_195和Satt278與Gmd1的遺傳距離分別為0.8、1.0、1.8、2.3、4.4、8.3、11.4、12.3、15.6、22.2、25.4和28.4 cM，從遺傳連鎖圖譜可以看出Gmd1位于標(biāo)記Satt373與XH-8之間，與12個標(biāo)記的連鎖位置為Satt278-Sat_195-Satt418-Satt481-Satt166-Satt527-Satt229-XH-23-Satt513-Satt373-Gmd1-XH- 8-Sat_245。結(jié)合大豆品種Williams 82的物理圖譜(https://www.soybase.org)，分子標(biāo)記Satt373至XH-8區(qū)間對應(yīng)于19號染色體上195 kb的物理區(qū)間。

2.3 候選基因的序列分析

檢索NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的大豆基因組，發(fā)現(xiàn)在引物Satt 373和XH-8區(qū)間包含25個基因，根據(jù)功能對這些基因進行初步篩選，2個候選基因GRF1和IAA16與矮稈性狀相關(guān)，參照GRF1和IAA16的序列設(shè)計引物(表3)，以海系13、北農(nóng)103及其后代高稈系和矮稈系為材料，對候選基因進行克隆和序列分析。候選基因GRF1全長1 100 bp，在海系13、北農(nóng)103、高稈系和矮稈系中的GRF1序列完全相同；候選基因IAA16全長2 760 bp，在海系13和高稈系中IAA16序列相同，而北農(nóng)103和矮稈系的IAA16序列相同，海系13與北農(nóng)103相比，IAA16在1 564 bp處海系13堿基為A，而北農(nóng)103為C；在1 571 bp處海系13堿基為G，而北農(nóng)103為C(圖3)。分析IAA16序列，編碼序列全長為4 35 bp，共編碼144個氨基酸，海系13和北農(nóng)103中因堿基的不同出現(xiàn)兩處氨基酸變化(圖4)。北農(nóng)103候選基因IAA16在第132個氨基酸，由酪氨酸突變成絲氨酸；在第134個氨基酸，由絲氨酸突變成蘇氨酸。經(jīng)蛋白結(jié)構(gòu)分析推測，北農(nóng)103的候選基因IAA16中氨基酸變異在可引起蛋白結(jié)構(gòu)變化的結(jié)構(gòu)域范圍之內(nèi)。

表3 候選基因克隆引物序列Tab.3 Sequence information of candidate gene clone primers

2.4 株高和生育期候選基因表達量分析

為驗證候選基因IAA16對株高的影響，在矮稈品種北農(nóng)103和高稈品種海系13的苗期、花芽分化期、開花期和成熟前期，分別取幼葉，提取RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用實時熒光定量分析法對候選基因IAA16在不同生育期的表達量進行分析(圖5)。苗期和花芽分化期IAA16表達量相對較高，海系13中IAA16表達量略高于北農(nóng)103，但差異不明顯(P>0.05)；開花期海系13中IAA16表達量較高，而北農(nóng)103較低，相差6倍，差異極顯著(P<0.01)；成熟前期IAA16表達量都較低，雖然海系13的IAA16表達量也比北農(nóng)103高，但差異不明顯(P>0.05)。

3 討 論

目前，對大豆矮稈基因的定位區(qū)間多位于6號、7號、13號和18號染色體上，且多為QTL定位[14]，而QTL在實際應(yīng)用上有一定的難度。本研究以矮稈品種北農(nóng)103、高稈品種海系13及其雜交F2分離群體衍生的F5重組自交系群體為研究材料，通過全基因組高通量重測序技術(shù)初步定位，F(xiàn)5重組自交系群體的精細定位，篩選與克隆候選基因，并對候選基因進行生育期表達量分析，以確定候選基因的可靠性。大豆品種北農(nóng)103攜帶有1對控制矮稈性狀的隱性基因，該基因暫定名為Gmd1，位于大豆19號染色體(L連鎖群)上，與12對引物產(chǎn)生的分子標(biāo)記緊密連鎖，在標(biāo)記Satt373與XH-8之間，遺傳距離分別為0.8 cM和1.0 cM；區(qū)間內(nèi)北農(nóng)103候選基因IAA16發(fā)生兩處單堿基變異，分別發(fā)生在1 564 bp和1 571 bp處，導(dǎo)致氨基酸變化，從而蛋白結(jié)構(gòu)受影響；海系13在開花期候選基因IAA16的表達量高于北農(nóng)103，相差6倍，差異極顯著，作為高稈和半有限生長型品種的海系13，開花期仍是株高生長的快速期，而北農(nóng)103為矮稈和有限生長型品種，開花期株高的生長基本停止，表明IAA16開花期在海系13中的高表達量與其對株高的調(diào)控有關(guān)。結(jié)合IAA16在海系13和北農(nóng)103中的DNA序列和蛋白結(jié)構(gòu)分析，推測IAA16的等位突變基因可能是調(diào)控北農(nóng)103矮稈性狀的基因，即Gmd1。

據(jù)報道，在大豆上已發(fā)現(xiàn)的矮稈基因dw[12]，位于8號染色體；半矮基因sdf-1[11]位于19號染色體45 201 612 bp到45 250 751 bp之間。本研究發(fā)現(xiàn)Gmd1定位在19號染色體49 191 336 bp到49 386 333 bp之間，與前人的研究不在同一定位區(qū)間，推測Gmd1可能是一個新的矮稈基因。目前與株高相關(guān)的基因中，大多與植物激素有關(guān)，并通過調(diào)控植物激素的合成或其信號傳導(dǎo)途徑，以此控制植物株高[16-17]。盡管本研究獲得的候選基因IAA16的功能有待進一步確定，但是為研究北農(nóng)103及其攜帶的矮稈基因提供重要的信息。此外，劉潔等[14]的研究表明北農(nóng)103還攜帶有1對調(diào)控早花的隱性基因e1，因此，北農(nóng)103作為改良大豆株高和成熟期的品種資源具有一定的利用價值。